Análise da Rolling Leucócitos Fisiológica E-Selectina-Mediated no endotélio microvascular

Este vídeo demonstra a análise da câmara de fluxo de placas paralelas para examinar os fatores que desencadeiam o rolamento de leucócitos nas superfícies das células endoteliais. As monocamadas de células endoteliais são estimuladas com a citocina pró-inflamatória IL one beta para regular positivamente a expressão de S selectina. A câmara de fluxo de placas paralelas é então colocada sobre as células endoteliais e os leucócitos positivos para S selectina são infundidos sobre a monocamada.

As interações celulares na câmara são, portanto, transmitidas com estresse absoluto que é semelhante ao da adesão leucocitária pós-capilar. Os eventos contínuos são capturados e enumerados usando elementos NIS e ensaio para independência de seleção E. Olá, sou George Weis no laboratório do Dr. Charles de Nitro no Departamento de Dermatologia do Brigman Women's Hospital, Harvard Medical School.

Hoje mostraremos um procedimento para analisar o papel da e selectina, ligantes da E selectina na adesão de leucócitos humanos a células endoteliais da medula óssea humana sob condições fisiológicas de fluxo sanguíneo. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar o papel das moléculas da superfície celular que iniciam a adesão de glóbulos brancos ou células cancerígenas metastáticas às células endoteliais, que revestem a superfície interna dos vasos sanguíneos. Este evento adesivo é caracterizado por um comportamento de rolamento, como uma bola de boliche rolando por uma pista.

Então vamos começar. O primeiro passo neste procedimento é preparar as células endoteliais que revestirão a câmara de fluxo. Este protocolo usa células H-B-M-E-C 60 derivadas da medula óssea humana.

As placas de cultura de microvasculatura devem ser pré-revestidas com fibronectina para preparar essas placas de cultura de tecidos incubadas de 35 mililitros com PBS contendo 20 microgramas por mil de fibronectina. Estes podem ser incubados durante a noite a quatro graus Celsius ou por três horas a 37 graus Celsius. Suspenda as células H-B-M-E-C 60 no meio 1 99 e semeie em 10 até a quinta células por prato, aumente as culturas para mais de 90% de confluência.

Isso levará cerca de dois dias para regular positivamente e selecionar e aspirar a expressão do meio de crescimento e adicionar meio fresco com 50 nanogramas por mil de IL uma incubação beta por quatro a seis horas. As monocamadas de células estão agora prontas para o ensaio da câmara de fluxo. Placas adicionais de células H-B-M-E-C 60 podem ser estimuladas com IL um beta e tratadas com anticorpo neutralizante anti-humano e selectina a 20 microgramas por mil por uma hora a 37 graus Celsius.

Isso controlará a expressão funcional de e selectina. Em seguida, prepare os leucócitos e selectina positivos. Estas são células progenitoras hematopoiéticas humanas KG uma.

Estes são cultivados em suspensão para confluência ou tendem a seis células por mil em RPMI 1640. As células KG e A podem ser pipetadas diretamente da cultura e contadas em um hemocitômetro. Resus suspende as células em 10 elevado a seis células por mil em HBSS com 10 milimolares de hep ou tampão HH que contém dois milimolares de cloreto de cálcio.

Armazene as células no gelo até que sejam analisadas. As próximas etapas envolvem a preparação do microscópio, da câmara de fluxo de placas paralelas e da bomba de seringa. Para o ensaio, ligue o microscópio e a bomba de seringa.

Selecione a objetiva de 10 x no microscópio. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros no suporte e encha-o com tampão HH com cloreto de cálcio dois milimolares. Em seguida, coloque tubos de ensaio de plástico de cinco mililitros no suporte abaixo.

Em seguida, coloque uma seringa de 60 mililitros na bomba de seringa. Certifique-se de que o êmbolo e o corpo da seringa estejam seguros. Conecte uma torneira de parada de três vias na extremidade da seringa de 60 mil e, em seguida, uma seringa de cinco mil na torneira de parada de três vias.

Coloque o aparelho da câmara de fluxo paralelo no microscópio stage com tubo de entrada no tubo de saída direito à esquerda e tubo de vácuo na parte traseira. Depois que a tubulação estiver conectada ao vácuo, abra a válvula de ar para permitir que o aparelho de placa paralela adira ao stage. Isso testará se a saia de vácuo na câmara de fluxo é hermética.

Quando a vedação for afirmada, desligue a válvula de ar. Agora conecte a linha da tubulação de saída à torneira de parada de três vias que já está conectada à seringa. O aparelho está agora pronto para ser colocado sobre as células H-B-M-E-C 60.

Ligue o vácuo, abaixe suavemente o aparelho da câmara de fluxo na placa e deixe o aparelho aspirar. Não deve haver sons de ar escapando e, neste ponto, pode ser necessário aplicar pressão na câmara para comprimir a junta de borracha. Uma vez estabelecido o vácuo, coloque o tubo de entrada no tubo cônico de 50 mililitros.

Abra a torneira de parada de três vias na seringa de 60 mil e coloque a bomba no modo bomba para remover o ar das linhas sem levantar as células da placa. Use a bomba de seringa ajustada a dois mils por minuto para encher o tubo de admissão. Em seguida, defina rapidamente para 0,5 mils por minuto.

Pouco antes de o fluido atingir o aparelho, é fundamental preparar a configuração com cuidado e evitar bolhas de ar, que levantarão a monocamada da placa. Uma vez que o fluido se move para a seringa de 60 mil, a câmara de fluxo e a bomba da seringa são preparadas. Agora, prenda o fluxo na câmara para o palco com um pedaço de fita adesiva sobre cada uma das linhas de entrada, saída e vácuo.

Isso garante que o campo de visão permaneça constante ao visualizar e coletar os dados. A câmara de fluxo está agora pronta para uso. Essas etapas devem ser repetidas para cada execução de entrada de célula e para cada nova placa.

Para capturar eventos contínuos do site Lucas, abra os elementos NIS na área de trabalho, pressione o ícone de reprodução para obter uma imagem ao vivo. A exposição automática permitirá que você veja a placa e foque a imagem. Certifique-se de que o microscópio esteja focado corretamente na monocamada da célula, ajustando o foco manualmente no microscópio.

Quando a imagem estiver em foco, redefina a exposição para um quadro por segundo e ajuste a luz no microscópio. A imagem deve aparecer no computador e não deve mais ser visível no microscópio. O histograma de luz pode então ser ajustado Para remover a exposição do fundo ou melhorar a clareza das células, clique no compartimento dois a dois ou no compartimento ativo para obter uma imagem ideal para a captura de filmes.

Clique na macro na barra de menus e selecione a porta direita selecionada com três e abra. Isso abre a porta para coordenar com a bomba de seringa. A câmara de fluxo está agora pronta para ser infundida com pipeta de células KG one A um mil de suspensão KG one A S no tubo de ensaio de cinco mil perto da linha de tubulação de entrada.

Em seguida, coloque a linha de entrada na parte inferior do tubo de ensaio. Vá para a barra de menu e clique em captura e aquisição de lapso de tempo. Selecione o protocolo com duração de 210 segundos.

Esta é a duração do programa para rolar em células H-B-M-E-C 60. Cada fase é programada para tirar uma foto a cada segundo durante o protocolo da bomba. Ele também está configurado para enviar um comando através da porta de comunicação três para iniciar a bomba.

Defina a bomba de seringa para o modo de programa, o que permite a programação manual de vazões específicas. Isso determinará os níveis de estresse absoluto dentro da câmara e ditará as interações da célula KG um A sobre as células HBM 60. As configurações para essas interações são 4,2 jantares por centímetro quadrado por 45 segundos.

Aponte três jantares por centímetro quadrado por 60 segundos e os passos se afastam a cada 15 segundos para um máximo de 4,2 jantares por centímetro quadrado. O microscópio e o computador estão agora prontos para capturar fotografias com lapso de tempo. Pressione Iniciar Executar no computador para começar a adquirir dados durante a execução do programa.

Certifique-se de adicionar mídia ao tubo contendo células KG um A para manter a tubulação de entrada e saída cheia de meio e evitar que bolhas de ar entrem no sistema. Se o lapso de tempo for interrompido, a bomba não irá parar sozinha e deve ser reiniciada. Pressione cancelar para retornar à imagem ao vivo.

Uma monocamada de células endoteliais não estimulada serve como controle negativo para este experimento. Para fazer isso, infundir leucócitos KG um A na câmara de fluxo sobre células HBM 60 não tratadas para controlar a independência selecionada, estimular a monocamada de células endoteliais com IL um beta e infundir os leucócitos sobre essas células para controlar ainda mais a independência do efeito. Trate as células HBMC 60 com IL um beta e depois com anticorpo anti-selectina S humana.

Em seguida, analise os eventos de rolamento de leucócitos nessas células. O rolamento celular não é determinado apenas pela S selectina, mas também por resíduos de ácido fatiado na superfície da célula leucocitária. Para mostrar isso, digerir as células KG um A com 0,1 unidades por mil neuraminidase por uma hora a 37 graus Celsius.

Em seguida, analise os eventos de rolagem sobre células H-B-M-E-C 60 estimuladas. As glicoproteínas na superfície dos leucócitos também são importantes para o rolamento celular. Isso pode ser demonstrado tratando as células KG one A com 0,2 unidades por pista de mil broma por uma hora a 37 graus Celsius e, em seguida, infundindo-as na câmara de fluxo.

Depois que a sequência de tempo é adquirida, os dados estão prontos para análise. Salve os dados e vá para a guia de medida na barra de menus e selecione o limite definido. Mova as barras para que as células desejadas fiquem coloridas em vermelho, selecione todas as imagens e, em seguida, tudo bem, toda a sequência de lapso de tempo agora deve ser modificada com células vermelhas visíveis.

Vá para medir e selecione restrições. Isso permite que o usuário exclua objetos de limite que não representam células contínuas. Estes são principalmente o fundo criado pela área de seleção de monocamada H-B-M-E-C 60 e valores mínimos e máximos de entrada, que são ideais para os leucócitos rolantes.

Repita esta etapa para alongamento e circularidade Selecione medir e, em seguida, selecione criar binário usando restrições. Os mesmos valores de restrição, que foram definidos na etapa anterior, agora serão usados para otimizar o software de elementos NIS para reconhecimento de leucócitos rolantes na monocamada de células endoteliais. Volte para medir os dados de campo selecionados e, em seguida, selecione redefinir dados.

Feche o menu, retorne para medir e selecione campo de varredura, abra dados de campo de medida e selecione número ou objetos. Em seguida, selecione todos os campos e exporte os dados para o Microsoft Excel. Por fim, selecione limpar dados.

Os elementos NIS agora estão prontos para mais coleta de dados. Esses dados representativos mostram como as interações das células endoteliais leucocitárias respondem ao estresse fisiológico, testando especificamente o papel do ligante adesivo. E selectin.

O rolamento robusto de leucócitos ocorre quando as células endoteliais são pré-estimuladas com IL um beta. Ao comparar esse resultado com o controle não estimulado, fica claro que o rolamento celular depende da estimulação de citocinas. Ao tratar as células H-B-M-E-C 60 com IL um beta e depois com anticorpo anti-E selectina humana, fica claro que o rolamento celular depende especificamente da e selectina.

Este ensaio também pode ser usado para testar outros parâmetros. Por exemplo, quando as células estimuladas são pré-tratadas com um sase ou com brolina, os resultados são menos robustos. Esses dados destacam a importância dos resíduos de ácido fatiado terminal, bem como das glicoproteínas da superfície celular.

Para a atividade do ligante de S selectina, acabamos de mostrar como analisar as interações adesivas baseadas em seltina entre leucócitos e células endoteliais sob condições que imitam as forças presentes em uma venial pós-capilar, a região do sistema de circulação onde os leucócitos deixam o sangue e entram nos tecidos. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de usar o anticorpo bloqueador apropriado ou o controle de tratamento enzimático para validar a necessidade da respectiva selectina e seu ligante neste sistema de ensaio. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.