Análise da Rolling Leucócitos Fisiológica E-Selectina-Mediated no endotélio microvascular

Este vídeo demonstra a análise em câmara de fluxo de placas paralelas para examinar os fatores que desencadeiam o rolamento de leucócitos sobre superfícies de células endoteliais. Monocamadas de células endoteliais são estimuladas com a citocina pró-inflamatória IL-1β para aumentar a expressão de S-seletina. Em seguida, a câmara de fluxo de placas paralelas é colocada sobre as células endoteliais e leucócitos positivos para S-seletina são infundidos sobre a monocamada.

As interações celulares na câmara são, portanto, submetidas a uma tensão de cisalhamento semelhante à encontrada na adesão de leucócitos em capilares pós-capilares. Os eventos de rolamento são capturados e enumerados utilizando os elementos NIS e ensaio para independência de E-selectina. Olá, sou George Weis no laboratório do Dr. Charles de Nitro, no Departamento de Dermatologia do Hospital Brigman Women's, da Harvard Medical School.

Hoje mostraremos um procedimento para analisar o papel da E-selectina e dos ligantes da E-selectina na adesão de leucócitos humanos a células endoteliais da medula óssea humana sob condições fisiológicas de fluxo sanguíneo. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o papel de moléculas da superfície celular que iniciam a adesão de glóbulos brancos ou células cancerígenas metastáticas às células endoteliais, que revestem a superfície interna dos vasos sanguíneos. Esse evento adesivo é caracterizado por um comportamento de rolamento, semelhante a uma bola de boliche descendo uma pista.

Então vamos começar. O primeiro passo deste procedimento é preparar as células endoteliais que revestirão a câmara de fluxo. Este protocolo utiliza células H-B-M-E-C 60 derivadas da medula óssea humana.

As placas de cultura de microvasculatura devem ser pré-revestidas com fibronectina para preparar estas placas: incubar placas de cultura de tecidos de 35 mililitros com PBS contendo 20 microgramas por mililitro de fibronectina. A incubação pode ser realizada durante a noite a quatro graus Celsius ou por três horas a 37 graus Celsius. Suspender as células H-B-M-E-C 60 no meio 1 99 e semear a 10 elevado à quinta células por placa, cultivando as culturas até atingirem mais de 90% de confluência.

Isso levará cerca de dois dias para aumentar a expressão de E-selectina; aspire o meio de crescimento e adicione meio fresco contendo 50 nanogramas por mililitro de IL-1β; incube por quatro a seis horas. As monocamadas celulares estão agora prontas para o ensaio em câmara de fluxo. Placas adicionais de células H-B-M-E-C 60 podem ser estimuladas com IL-1β e tratadas com anticorpo neutralizante anti-e-selectina humana a 20 microgramas por mililitro por uma hora a 37 graus Celsius.

Isso controlará a expressão funcional da e-selectina. Em seguida, prepare os leucócitos positivos para e-selectina. Estas são as células KG1a, progenitoras hematopoiéticas humanas.

Essas são cultivadas em suspensão até a confluência ou até atingirem seis células por mililitro em RPMI 1640. As células KG1a podem ser pipetadas diretamente do cultivo e contadas em um hemocitômetro. Resuspenda as células a 10⁶ células por mililitro em HBSS com tampão hep ou HH 10 milimolar que contém cloreto de cálcio 2 milimolar.

Guarde as células no gelo até o momento do ensaio. Os próximos passos envolvem o preparo do microscópio, da câmara de fluxo com placas paralelas e da bomba de seringa. Para o ensaio, ligue o microscópio e a bomba de seringa.

Selecione a objetiva de 10 x no microscópio. Coloque um tubo cônico de 50 mililitros no suporte e encha-o com tampão HH contendo cloreto de cálcio a dois milimolares. Em seguida, coloque tubos de ensaio plásticos de cinco mililitros no suporte abaixo.

Em seguida, coloque uma seringa de 60 mililitros na bomba de seringa. Certifique-se de que tanto o êmbolo quanto o corpo da seringa estejam firmes. Afixe uma torneira de três vias à extremidade da seringa de 60 mL e, em seguida, conecte uma seringa de 5 mL à torneira de três vias.

Coloque o aparelho de câmara de fluxo paralelo sobre a platina do microscópio com o tubo de entrada à direita, o tubo de saída à esquerda e o tubo de vácuo na parte traseira. Após conectar as tubulações ao vácuo, abra a válvula de ar para permitir que o aparelho de placas paralelas adere à platina. Isso testará se a saia de vácuo da câmara de fluxo está hermeticamente fechada.

Quando o selo for confirmado, desligue a válvula de ar. Agora, conecte a linha de tubo de saída à torneira de três vias que já está ligada à seringa. O aparelho está agora pronto para ser colocado sobre as células H-B-M-E-C 60.

Ligue o vácuo e abaixe suavemente o aparato da câmara de fluxo sobre a placa, permitindo que o aparato seja sugado. Não deve haver sons de ar escapando, e nesse momento pode ser necessário aplicar pressão sobre a câmara para comprimir a junta de borracha. Uma vez que o vácuo tenha sido estabelecido, coloque o tubo de entrada no tubo cônico de 50 mililitros.

Abra a válvula de três vias da seringa de 60 mil e coloque a bomba no modo de bombeamento para remover o ar das tubulações sem deslocar as células na placa. Use a bomba de seringa ajustada em dois mils por minuto para encher o tubo de entrada. Em seguida, ajuste rapidamente para 0,5 mil por minuto.

Imediatamente antes de o fluido atingir o aparelho, é essencial escorificar cuidadosamente o sistema e evitar bolhas de ar, que poderiam levantar a monocamada da placa. Assim que o fluido avançar para dentro da seringa de 60 mil, a câmara de fluxo e a bomba de seringa estarão escorificadas. Agora, fixe a câmara de fluxo à platina com um pedaço de fita sobre cada uma das linhas de entrada, saída e vácuo.

Isso garante que o campo de visão permaneça constante durante a visualização e coleta dos dados. A câmara de fluxo agora está pronta para uso. Esses passos devem ser repetidos para cada execução de entrada celular e para cada placa nova.

Para capturar eventos de rolamento no local Lucas, abra o NIS Elements na área de trabalho e pressione o ícone de reprodução para obter uma imagem ao vivo. A exposição automática permitirá que você visualize a placa e foque a imagem. Certifique-se de que o microscópio esteja corretamente focado na monocamada celular ajustando manualmente o foco no microscópio.

Uma vez que a imagem esteja em foco, redefina a exposição para um quadro por segundo e ajuste a luz no microscópio. A imagem deve aparecer no computador e não deverá mais ser visível no microscópio. O histograma de luz pode então ser ajustado para remover a exposição de fundo ou para melhorar a nitidez das células; clique em bin 2x2 ou bin ao vivo para obter uma imagem ideal para a captura de vídeo.

Clique no macro na barra de menu e selecione a direita para a porta, escolha a porta com três e abra. Isso abre a porta para coordenar com a bomba de seringa. A câmara de fluxo agora está pronta para ser infundida com células KG um A; pipete um mililitro da suspensão de KG um A S no tubo de ensaio de cinco mililitros próximo à linha de tubulação de entrada.

Em seguida, posicione a linha de entrada na parte inferior do tubo de ensaio. Vá até a barra de menu e clique em captura e aquisição em lapso de tempo. Selecione o protocolo com duração de 210 segundos.

Esta é a duração do programa para o rolamento em células H-B-M-E-C 60. Cada fase é programada para tirar uma foto a cada segundo durante toda a duração do protocolo da bomba. Também é configurada para enviar um comando através da porta comm três para iniciar a bomba.

Configure a bomba de seringa no modo de programação, o que permite a programação manual de taxas de fluxo específicas. Isso determinará os níveis de tensão de cisalhamento na câmara e regulará as interações entre células KG um A e células H-B-M-E-C 60. As configurações para essas interações são de 4,2 dinas por centímetro quadrado durante 45 segundos.

Ponto três dina por centímetro quadrado durante 60 segundos e aumentos de passo a cada 15 segundos até um máximo de 4,2 dina por centímetro quadrado. O microscópio e o computador estão agora prontos para capturar fotografias com lapso de tempo. Pressione iniciar execução no computador para começar a adquirir dados enquanto executa o programa.

Certifique-se de adicionar meio ao tubo contendo as células KG uma A para manter os tubos de entrada e saída cheios de meio e evitar que bolhas de ar entrem no sistema. Se o intervalo de tempo for interrompido, a bomba não parará sozinha e deverá ser redefinida. Pressione cancelar para retornar à imagem em tempo real.

Uma monocamada de células endoteliais não estimuladas serve como controle negativo para este experimento. Para isso, infunda leucócitos KG1a na câmara de fluxo sobre células HBMEC-60 não tratadas para controlar a independência em relação à selecina E, estime a monocamada de células endoteliais com IL-1β e infunda os leucócitos sobre essas células para controlar ainda mais a independência em relação à selecina E. Trate as células HBMEC-60 com IL-1β e, em seguida, com anticorpo anti-selecina S humana.

Em seguida, analise os eventos de rolamento de leucócitos nessas células. O rolamento celular é determinado não apenas pelo S-seletina, mas também pelos resíduos de ácido siálico na superfície da célula leucocitária. Para demonstrar isso, digira as células KG1a com 0,1 unidade por mililitro de neuraminidase por uma hora a 37 graus Celsius.

Em seguida, analise os eventos de rolamento sobre as células H-B-M-E-C 60 estimuladas. As glicoproteínas na superfície dos leucócitos também são importantes para o rolamento celular. Isso pode ser demonstrado tratando as células KG uma A com 0,2 unidades por mililitro de bromelina por uma hora a 37 graus Celsius e, em seguida, infundindo-as na câmara de fluxo.

Após a sequência temporal ser adquirida, os dados estão prontos para análise. Salve os dados, vá até a guia medir na barra de menu e selecione limite definido. Mova as barras para que as células desejadas fiquem coloridas em vermelho, selecione todas as imagens e depois clique em OK; toda a sequência de imagens de longa duração deverá agora ser modificada, com células rolantes visíveis em vermelho.

Vá até medir e selecione restrições. Isso permite ao usuário excluir objetos limiares que não representam células em rolamento. Estes são principalmente fundos criados pela monocamada de H-B-M-E-C 60; selecione a área e insira valores mínimos e máximos, que são ideais para os leucócitos em rolamento.

Repita este passo para alongamento e circularidade. Selecione medir e, em seguida, selecione criar binário usando restrições. Os mesmos valores de restrição, definidos no passo anterior, serão agora utilizados para otimizar o software de elementos NIS na identificação de leucócitos rolantes na monocamada de células endoteliais. Volte a medir, selecione campo de dados e, em seguida, selecione redefinir dados.

Feche o menu, retorne à medição e selecione o campo de digitalização, abra os dados do campo de medição e selecione o número ou os objetos. Em seguida, selecione todos os campos e exporte os dados para o Microsoft Excel. Por fim, selecione limpar dados.

Os elementos NIS agora estão prontos para coleta adicional de dados. Esses dados representativos mostram como as interações entre leucócitos e células endoteliais respondem ao estresse cisalhante fisiológico, testando especificamente o papel do ligante adesivo E-selectina.

O rolamento robusto de leucócitos ocorre quando as células endoteliais são previamente estimuladas com IL-1β. Ao comparar esse resultado com o controle não estimulado, fica evidente que o rolamento celular depende da estimulação por citocinas. Ao tratar as células HBMEC-60 com IL-1β e, em seguida, com anticorpo anti-E-selectina humana, torna-se claro que o rolamento celular depende especificamente da E-selectina.

Este ensaio também pode ser utilizado para testar outros parâmetros. Por exemplo, quando células estimuladas são pré-tratadas com sase ou com brolin, os resultados são menos robustos. Esses dados destacam a importância dos resíduos de ácido slicídico terminais, bem como das glicoproteínas da superfície celular.

Para a atividade do ligante de S-seletina, mostramos como analisar interações adesivas mediadas pela E-seletina entre leucócitos e células endoteliais sob condições que simulam as forças presentes em vênulas pós-capilares, a região do sistema circulatório onde os leucócitos deixam o sangue e entram nos tecidos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de usar o anticorpo bloqueador apropriado ou o controle de tratamento enzimático para validar a necessidade da respectiva seletina e do seu ligante neste sistema de ensaio. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.