Coloração de Gram de bactérias de fontes ambientais

Gram Staining of Bacteria from Environmental Sources

JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Science Education Environmental Microbiology

Gram Staining of Bacteria from Environmental Sources

100,394 Views

•

09:31 min

•

February 23, 2015

Overview

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba – Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner

O espectro de pesquisas em microbiologia ambiental é amplo em escopo e potencial de aplicação. Se o trabalho é de bancada com isolados bacterianos conhecidos, ou no campo coletando amostras de solo ou água contendo isolados bacterianos desconhecidos, a capacidade de discernir rapidamente e visualmente populações culturais de interesse permanece de grande importação para microbiologistas ambientais ainda hoje com a abundância de técnicas moleculares disponíveis para uso. Este vídeo demonstrará uma dessas técnicas, conhecida como mancha gram.

Principles

A mancha de Gram é uma técnica clássica e importante de coloração que permanece amplamente utilizada por microbiologistas ambientais. Semelhante a uma simples mancha, permite a avaliação da morfologia celular bacteriana (por exemplo,cocci, hastes, esporos- ex), tamanho e arranjo(por exemplo,cadeias ou aglomerados). Além disso, permite diferenciar bactérias em dois grupos distintos de princípios — Gram-negativo e Gram-positivo — de acordo com a composição e estrutura da parede celular(Figura 1).

A coloração de grama é um processo de várias etapas. Antes da coloração, uma mancha bacteriana é preparada usando uma cultura de placa, inclinação ou caldo. A preparação para a mancha é seca e fixada em uma lâmina de vidro limpa. Uma mancha primária de violeta cristalina é então aplicada à mancha fixa. O violeta cristalina é uma mancha básica composta por íons coloridos carregados positivamente (ou seja, cromóforos) que formam ligações iônicas fracas com grupos funcionais negativamente carregados presentes na parede celular bacteriana. Depois de enxaguar suavemente o toboágua com água, o iodo de Gram é aplicado, e forma complexos insolúveis com o cristal violeta na parede celular. Os complexos de cristal violeta-iodo se ligam ainda mais com peptidoglycan, um componente principal das paredes celulares bacterianas. Após uma segunda lavagem de água, um agente descolorante é brevemente aplicado à mancha. Para bactérias Gram-negativas, o complexo cristalino-iodo é lavado durante a etapa de descoloração, com bactérias Gram-positivas retendo a mancha roxa. Uma terceira e última lavagem de água é seguida por uma contra-mancha de safran que colore as bactérias Gram-negativas rosa ou vermelha.

Figura 1. Comparação da parede celular de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

Procedure

1. Coleta de Amostras

Coletar amostras de solo e transportar para o laboratório para análise microbiana.
No laboratório, pese uma amostra de 10 g usando um equilíbrio analítico.
Diluir a amostra 1:10 em 95 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (10 partes de solo equivale a 5 partes de líquido aquoso) e vórtice para misturar(Figura 2, Passo 1).
Realizar diluições subsequentes de 1:10 até pelo menos 10^-5 g de solo por mL, e diluições selecionadas em placas de propagação em réplicas de dois ou três em um meio de ágar de baixo nutriente(por exemplo,R2A) (Figura 2, Passos 2-3).
Incubar as placas durante uma semana em temperatura ambiente(Figura 2, Passo 4).
Selecione uma ou duas colônias para isolamento e listrada em placas de ágar fresco(Figura 3, Passos 1-3).
Incubar as placas de raia por dois a três dias em temperatura ambiente(Figura 3, Passo 4).

2. Preparação de manchas bacterianas

Observe as placas de listras para colônias isoladas.
Para preparar cada preparação de difamação, mergulhe um laço inoculante em etanol, esterilizar a chama e coloque de 1 a 2 laços de água destilada estéril no centro de lâminas de vidro pré-limpas.
Esterilize o laço de inoculação novamente como descrito anteriormente. Uma vez resfriado, remova uma pequena quantidade de cultura de uma única colônia isolada e misture-a com as gotículas de água no escorregador (a mancha deve se assemelhar ao leite desnatado diluído). O laço inoculante deve ser resfriado antes do isolamento da colônia. Um laço muito quente fará com que a colônia e/ou o meio espirrem, o que pode levar à aerossolização de bactérias. Geralmente, quando o laço é muito quente para uso, um som “assobiar” será ouvido quando aplicado ao ágar ou colônia. O resfriamento inadequado do loop também pode resultar em transferência de cultura para slide menos eficiente e distorção da morfologia celular.
Espalhe a mancha sobre a superfície do slide medindo aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm, e deixe-a secar. É importante que a secagem do ar ocorra sob condições de fluxo laminar. Os slides não devem ser secados para não interromper a mancha. Além disso, os slides não devem ser secos à chama, a fim de manter a morfologia celular.
Após a secagem, o calor corrija a mancha passando rapidamente pelo escorregador através de uma chama de 2-3x. O slide não deve ser mantido parado na chama, para evitar distorção da morfologia celular e/ou danos ao escorregador de vidro.

3. Mancha de grama

Fixar o slide em uma extremidade usando um grampo de roupa limpo.
Cubra a mancha com violeta cristalina (mancha primária) e segure por 2 a 3 minutos.
Lave cuidadosamente o escorregador com água destilada. O fluxo de água não deve ser direcionado para a mancha, a fim de evitar danos e/ou desprendimento da lâmina de vidro.
Cubra a mancha com o iodo do Gram e segure por 2 minutos, depois enxágue suavemente o toboágua com água.
Descolorir a mancha usando 95% de etanol até que a mancha não lave mais do escorregador (isso geralmente não leva mais de 20 s dependendo da espessura da mancha), depois enxágue imediatamente com água destilada. Esta etapa é fundamental para evitar a descoloração excessiva do slide, o que pode levar a uma designação falsa de mancha gram (ou seja, variável Gram).
Adicione a contra-mancha (safranin) à mancha e segure por 30 s. Em seguida, enxágue suavemente o escorregador com água destilada e enxugue a mancha usando papel absorvente.

4. Observação microscópica de slides

Observe os slides usando objetivos baixos (por exemplo,4X ou 10X), de alta seca(por exemplo,40X) e de imersão de óleo (100X). Para imersão em óleo, adicione o óleo diretamente à mancha.
Para obter resultados representativos de bactérias do solo Gram-positivo e Gram-negativos, consulte as Figuras 4 e 5.

Figura 2. Técnica de diluição e revestimento de difusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Isolamento da colônia usando a técnica da placa de raia.

Figura 4. Gram-positivo bactéria do solo Staphylococcus aureus.

Figura 5. Gram-negativo bactéria do solo Escherichia coli.

A coloração de grama permite uma visualização rápida da morfologia bacteriana e ampla distinção celular de uma ampla gama de amostras ambientais. Para manchar bactérias, uma mancha uniforme é aplicada em um lado de vidro e permitida a secar. Após a fixação de calor da mancha, a violeta cristalina é aplicada.

Um agente descolorante enxagua o cristal violeta das células Gram-negativas, mas não as células Gram-positivas. Um segundo corante, tipicamente safranin, é usado como uma mancha de fundo para visualizar as células Gram-negativas. Uma vez manchadas, as células podem ser avaliadas para morfologia celular, tamanho e arranjo, como correntes ou aglomerados.

Este vídeo demonstrará como preparar uma amostra ambiental, isolar as espécies bacterianas encontradas nela, e executar uma mancha de Grama nas colônias isoladas

A coloração grama permite a categorização da maioria das bactérias em duas classes estruturais amplas: Gram-positive e Gram-negativo. Embora ambas as classes tenham uma membrana de plasma fosfolipídida subjacente, a estrutura da parede celular varia muito. A parede celular Gram-positive é composta principalmente de uma espessa camada de peptidoglycan, que é um polímero que consiste em açúcares e aminoácidos. As paredes celulares gram-negativas têm uma camada mais fina de peptidoglycan, sanduíche entre uma segunda membrana lipídica. Esta membrana externa normalmente contém lipopólises.

O violeta cristalina carregada positivamente liga-se fracamente à parede celular bacteriana carregada negativamente. O iodo de Gram forma um complexo insolúvel com o corante violeta cristalino, fixando-o assim na parede celular.

Durante a etapa descoloração, o peptidoglycan nas células Gram-positivas é desidratado, fazendo com que se contraa e preenalize os complexos de cristal violeta-iodo. Nas células Gram-negativas, o agente descolorante compromete a membrana externa, aumentando sua porosidade. Isso permite que os complexos de cristal violeta-iodo sejam lavados.

Agora que você entende os princípios por trás da mancha de gram bactérias do solo, vamos ver o processo realizado em bactérias do solo em laboratório.

Depois de coletar uma amostra de solo no campo, leve-a para o laboratório para análise. Refine a amostra com uma peneira e pese 10 g do solo peneirado usando um equilíbrio analítico.

Diluir a amostra em 95 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato e vórtice para misturar. Realize diluições adicionais de 1 a 10, vórtices entre cada diluição. Transfira alíquotas de pelo menos 3 diluições sucessivas, para replicar placas de baixa agarose de nutrientes.

Após a esterilização da chama de etanol e o resfriamento de uma haste de vidro dobrada, tocando na mídia, espalhe a amostra sobre a superfície das placas. Incubar as placas em temperatura ambiente. Após incubar por 3 a 5 dias, selecione a maior diluição com 30 a 300 colônias discretas. Com um laço inoculante estéril, selecione colônias de interesse para o isolamento.

Coloque a colônia em uma seção de uma placa fresca. Esterilizando o laço entre listras, faça sucessivas listras em um padrão zig-zag em cada seção da placa para permitir o isolamento subsequente de colônias únicas discretas. Incubar as placas por 1 a 2 dias em temperatura ambiente.

Para iniciar a preparação de manchas bacterianas, conecte um clipe a uma lâmina de vidro pré-limpa para facilitar o manuseio. Para cada mancha bacteriana, limpe e esterilize uma alça inoculante. Coloque 2 laços de água destilada estéril no centro do escorregador.

Depois de esterilizar o laço novamente, remova uma pequena quantidade de cultura de uma colônia isolada, e misture com a água no escorregador. É importante esfriar o laço antes de tocar a cultura tocando uma porção não vacinada de ágar várias vezes. A mancha deve se assemelhar ao leite diluído. Deixe o slide secar à temperatura ambiente. Após a secagem, o calor corrija a mancha passando rapidamente por uma chama.

Uma vez seco, pipeta cristal violeta sobre a mancha, e deixe sentar-se por 2 – 3 min. Enxágue cuidadosamente o slide com água destilada, apontando o fluxo direto para o topo do escorregador, permitindo que a água flua suavemente para baixo. Não aponte o fluxo de água diretamente para a mancha.

Cubra o slide com iodo da vovó. Depois de 2 minutos, enxágue delicadamente com água destilada. Descolorir o escorregador com 95% de etanol até que a mancha não desaja mais. Enxágue imediatamente com água destilada. Isso limitará o excesso de descoloração da mancha.

Adicione safranin como contra-mancha à mancha por 30 s. Isso manchará todas as células Gram-negativas presentes. Enxágue suavemente com água destilada e enxugue a mancha com papel absorvente. Observe o slide resultante com um microscópio. Use um objetivo de baixa potência primeiro para fazer ajustes grosseiros e encontrar uma porção ideal da mancha antes de passar para o campo de visão menor das ampliações mais altas.

Após mais imagens e ajuste a mancha com um objetivo de potência média, adicione óleo de imersão diretamente à mancha. O óleo é necessário para objetivos de alta potência que fornecerão os melhores micrografos. As bactérias gram-positivas aparecerão de cor azul ou roxa, enquanto as células Gram-negativas serão vermelhas ou rosas. Além da estrutura da parede celular, a forma e o arranjo são elucidados a partir dos micrografos resultantes.

A capacidade de coloração de Gram para estudar bactérias qualitativamente é importante para uma ampla gama de campos científicos.

O solo é apenas uma das fontes ambientais das quais as bactérias podem ser isoladas e analisadas. Para água potável, a preparação da amostra deve ser modificada. Amostras de água da torneira podem ser extraídas de uma torneira, e banhadas em meios de crescimento que facilitam o crescimento de diversas colônias bacterianas heterotróficas. Ao emplacar em um meio como o R2A, o processo é quase idêntico ao procedimento do solo.

Para certas técnicas de identificação bacteriana, os parâmetros dependem do tipo de parede celular das bactérias de interesse. Neste exemplo, o sangue de um paciente séptico foi testado e foi encontrado abrigando bactérias Gram-positivas.

Com essas informações, foram escolhidas sondas de ácido nucleírico de peptídeos específicas da espécie que se ligariam ao rRNA das células. Estas sondas foram ligadas a corantes fluorescentes que foram usados para identificar as espécies presentes.

Devido às diferenças fundamentais na estrutura celular Gram-positiva e negativa, as bactérias têm respostas únicas para outros compostos além da violeta cristalina. Este experimento procurou isolar Clostridium difficile, uma bactéria Gram-positiva, de amostras fecais. A cicloserina, que inibe o crescimento de células Gram-negativas, foi adicionada à placa de ágar. As células Gram-positivas que cresceram na placa foram ainda mais isoladas através de outros métodos.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE à mancha de Gram para estudos ambientais. Agora você deve entender os benefícios do processo e como executar a técnica e utilizar os resultados. Obrigado por assistir!

Applications and Summary

A mancha de Gram é usada nos muitos subágros da microbiologia ambiental e clínica. Cientistas de qualidade da água podem usar a mancha de Gram como uma ferramenta confirmatória para a detecção de bactérias fecais em amostras de água. Isolados bacterianos de solos são manchados de Gram para caracterizar ainda mais as comunidades de solos culturais. Para microbiologistas ambientais, a mancha de gram auxilia na categorização das populações bacterianas de acordo com a estrutura da parede celular. Isso, por sua vez, fornece informações sobre a capacidade geral de uma determinada comunidade microbiana de suportar a dessecação e outros estressores ambientais. O conhecimento da designação de manchas gram também é importante na pesquisa e desenvolvimento de desinfetantes e outros antimicrobianos, já que as bactérias Gram-positivas tendem a ser mais resistentes à inativação por químicas particulares do que as bactérias Gram-negativas.

Para aplicações clínicas de microbiologia, a mancha de Gram é usada para confirmar a identidade dos agentes de doenças bacteriológicas, juntamente com os métodos tradicionais de diagnóstico. É também de grande ajuda quando a colheita falhou, ou não é uma opção. A coloração gramada de amostras clínicas pode revelar a presença de agentes etiológicos que podem não ter sido observados de outra forma.

Transcript

Gram staining allows for quick visualization of bacterial morphology and broad cellular distinction from a wide range of environmental samples. To stain bacteria, a uniform smear is applied to a glass side and allowed to dry. After heat-fixing the smear, crystal violet is applied.

A decolorizing agent rinses away the crystal violet from Gram-negative cells, but not Gram-positive cells. A second dye, typically safranin, is used as a background stain to visualize the Gram-negative cells. Once stained, the cells can be assessed for cell morphology, size, and arrangement, such as chains or clusters.

This video will demonstrate how to prepare an environmental sample, isolate the bacterial species found therein, and perform a Gram stain on the isolated colonies

Gram staining allows for the categorization of most bacteria into two broad structural classes: Gram-positive and Gram-negative. While both classes have an underlying phospholipid plasma membrane, the structure of the cellular wall varies greatly. The Gram-positive cell wall is primarily composed of a thick layer of peptidoglycan, which is a polymer that consists of sugars and amino acids. Gram-negative cell walls have a thinner layer of peptidoglycan, sandwiched between a second lipid membrane. This outer membrane typically contains lipopolysaccharides.

The positively-charged crystal violet binds weakly to the negatively-charged bacterial cell wall. Gram’s iodine forms an insoluble complex with the crystal violet dye, thereby fixing it in the cell wall.

During the decolorizing step, the peptidoglycan in the Gram-positive cells is dehydrated, causing it to contract and trap the crystal violet-iodine complexes. In Gram-negative cells, the decolorizing agent compromises the outer membrane, increasing its porosity. This allows the crystal violet-iodine complexes to be washed away.

Now that you understand the principles behind Gram staining soil bacteria, let’s see the process performed on soil bacteria in the laboratory.

After collecting a soil sample in the field, bring it into the laboratory for analysis. Refine the sample with a sieve, and weigh 10 g of the sieved soil using an analytical balance.

Dilute the sample into 95 mL of phosphate-buffered saline and vortex to mix. Perform additional 1 to 10 dilutions, vortexing between each dilution. Transfer aliquots of at least 3 successive dilutions, onto replicate low nutrient agarose plates.

Following ethanol-flame sterilization and cooling of a bent glass rod by tapping onto the media, spread the sample over the surface of the plates. Incubate the plates at room temperature. After incubating for 3 to 5 days, select the highest dilution with 30 to 300 discrete colonies. With a sterile inoculating loop, select colonies of interest for isolation.

Streak the colony onto one section of a fresh plate. Sterilizing the loop between streaks, make successive streaks in a zig-zag pattern onto each section of the plate to allow for subsequent isolation of discrete single colonies. Incubate the plates for 1 to 2 days at room temperature.

To begin preparation of bacterial smears, attach a clip to a pre-cleaned glass slide for ease of handling. For each bacterial smear, clean and flame-sterilize an inoculating loop. Place 2 loopfuls of sterile distilled water onto the center of the slide.

After sterilizing the loop again, remove a small amount of culture from an isolated colony, and mix with the water on the slide. It’s important to cool the loop before touching the culture by tapping an uninoculated portion of agar several times. The smear should resemble diluted milk. Allow the slide to dry at room temperature. After drying, heat fix the smear by quickly passing it through a flame.

Once dry, pipette crystal violet onto the smear, and let sit for 2 – 3 min. Carefully rinse the slide with distilled water by aiming the direct flow towards the top of the slide, allowing the water to gently flow down. Do not aim the water flow directly at the smear.

Cover the slide with Gram’s iodine. After 2 min, gently rinse with distilled water. Decolorize the slide with 95% ethanol until stain no longer washes away. Immediately rinse with distilled water. This will limit over-decolorizing the smear.

Add safranin as a counter-stain to the smear for 30 s. This will stain any Gram-negative cells present. Gently rinse with distilled water and blot dry with absorbent paper. Observe the resulting slide with a microscope. Use a low power objective first to make coarse adjustments and find an ideal portion of the smear before moving on to the smaller field-of-views of the higher magnifications.

After further imaging and adjusting the smear with a medium power objective, add immersion oil directly to the smear. The oil is needed for high power objectives that will provide the best micrographs. Gram-positive bacteria will appear blue or purple in color, while Gram-negative cells will be red or pink. In addition to cell wall structure, shape and arrangement are elucidated from the resulting micrographs.

The ability of Gram staining to qualitatively study bacteria is important to a wide range of scientific fields.

Soil is just one of the environmental sources from which bacteria can be isolated and analyzed. For drinking water, sample preparation must be modified. Samples of tap water can be drawn from a faucet, and plated onto growth media that facilitates the growth of diverse, heterotrophic bacterial colonies. Upon plating onto a medium such as R2A, the process is nearly identical to the soil procedure.

For certain bacterial identification techniques, the parameters are dependent on the cell wall type of the bacteria of interest. In this example, a septic patient’s blood was tested and was found to be harboring Gram-positive bacteria.

With this information, species-specific peptide nucleic acid probes were chosen that would bind to the cells’ rRNA. These probes were bound to fluorescent dyes that were used to identify the species present.

Because of the fundamental differences in Gram-positive and -negative cellular structure, bacteria have unique responses to other compounds besides crystal violet. This experiment sought to isolate Clostridium difficile, a Gram-positive bacterium, from fecal samples. Cycloserine, which inhibits the growth of Gram-negative cells, was added to the agar plate. The Gram-positive cells that grew on the plate were further isolated via other methods.

You’ve just watched JoVE’s introduction to Gram staining for environmental studies. You should now understand the benefits of the process and how to perform the technique and utilize the results. Thanks for watching!

Tags

Valor vazio emissão