Análise da Curva de Crescimento Bacteriano e suas Aplicações Ambientais

Medir a taxa de crescimento de bactérias é uma técnica microbiológica fundamental e tem uso generalizado em pesquisa básica, bem como em aplicações agrícolas e industriais.

As bactérias estão entre as formas de vida mais abundantes na Terra, estando presentes em todos os ecossistemas, incluindo o corpo humano. Certas espécies bacterianas também são geneticamente altamente tratáveis e foram aproveitadas como modelos de pesquisa ou para produzir produtos naturais ou sintéticos em escala industrial. No entanto, nem todas as espécies bacterianas podem ser cultivadas em laboratório. Para aqueles que podem, uma característica importante é a taxa de multiplicação, ou "cinética de crescimento".

Medir a taxa de crescimento de uma cultura bacteriana pode informar os cientistas sobre suas funções fisiológicas e metabólicas e também é útil para obter um número preciso de células da bactéria para aplicações a jusante.

Este vídeo apresentará os princípios por trás da análise da taxa de crescimento bacteriano, demonstrará um protocolo para caracterizar a taxa de crescimento com uma "curva de crescimento" e, finalmente, explorará várias aplicações da ciência ambiental para medir a cinética de crescimento bacteriano.

As bactérias geralmente se reproduzem assexuadamente, multiplicando-se por fissão binária simples, onde uma célula parental se divide em duas células-filhas idênticas. Em condições favoráveis de crescimento, onde os nutrientes estão disponíveis em abundância e os parâmetros ambientais, como a temperatura, são todos propícios ao crescimento, a taxa de multiplicação excede em muito a taxa de mortalidade. Isso resulta em crescimento exponencial.

Ao medir a quantidade de bactérias em uma cultura em função do tempo, uma curva de crescimento pode ser obtida. O cultivo de bactérias em uma cultura líquida em condições ideais produz uma curva de crescimento com uma forma característica que pode ser dividida em várias fases. A curva começa com uma "fase de defasagem", quando o crescimento é lento enquanto as bactérias se aclimatam às condições de cultivo. Em seguida vem o "log" ou "fase exponencial", quando a bactéria experimenta um crescimento exponencial. O crescimento eventualmente pára quando os nutrientes se esgotam e os resíduos se acumulam, resultando em uma "fase estacionária". Finalmente, uma vez que a taxa de multiplicação é superada pela taxa de morte celular, a cultura entra na "fase de morte".

Para construir uma curva de crescimento, o número de bactérias em um frasco de cultura líquida é contado em diferentes pontos de tempo durante um certo período de cultura. As contagens bacterianas podem ser obtidas por vários métodos diferentes. Uma abordagem comum é medir a densidade óptica - ou "OD" - 600, que é a absorbância da luz da solução bacteriana em um comprimento de onda de 600 nm.

Outro método é determinar o "UFC", ou unidades formadoras de colônias, por mililitro da cultura. Devido à natureza clonal do crescimento bacteriano, uma bactéria em uma cultura pode, teoricamente, expandir-se em uma colônia observável em uma placa de ágar. Ao plaquear uma série de diluições de uma cultura bacteriana para atingir uma concentração bacteriana onde colônias individuais e discretas podem ser observadas, um método chamado "plaqueamento de diluição serial", a contagem de colônias pode ser usada para calcular a concentração bacteriana em termos de UFC por mL.

Agora que você entende como o crescimento bacteriano pode ser analisado, vamos passar por um protocolo para realizar a análise da curva de crescimento em culturas puras de um modelo bacteriano bem estabelecido, Escherichia coli, usando o método de placas de diluição seriada.

Um dia antes da coleta em ponto de tempo, inocular 20 mL de caldo de soja tripticase pré-esterilizado, ou TSB, em um frasco de 50 mL com uma única colônia de E. coli.

Incubar a cultura durante a noite aos 37 ? C com agitação. Para E. coli, isso resultaria em uma população de fase estacionária de aproximadamente 109 UFC/mL.

No dia seguinte, inocular 100 ? L da cultura noturna em 250 mL de TSB em um balão de 500 mL. Homogeneizar. Isso produz uma cultura diluída de aproximadamente 4 x 105 UFC/mL. Armazene 5 mL desta cultura diluída em um tubo de cultura. Esta é a alíquota do ponto de tempo 0, ou T0. Leve à geladeira imediatamente a 4 ?C.

Incube o volume restante da cultura a 37 ? C com agitação. A cada hora depois, por até 8 h, colete alíquotas de 5 mL da cultura. Designe essas amostras T1 a T8 e armazene-as todas em 4 ? C até o uso.

No dia do experimento, remova as alíquotas de ponto de tempo de E. coli da geladeira e mantenha-as no gelo. Use tubos de microcentrífugas estéreis, cada um com 900 ? L de solução salina estéril, estabelecer uma série de diluições para cada alíquota de acordo com o quadro seguinte.

Misture bem a cultura T0 por vórtice suave e, em seguida, adicione 100 ? L para o tubo A de sua série de diluição, fazendo uma diluição de 1 em 10 ou 10-1. Tubo de vórtice A para misturar e, usando uma ponta de pipeta nova, adicione 100 ? L do Tubo A ao Tubo B, fazendo a diluição 1 em 100 ou 10-2.

Repetir o processo para cada alíquota de cultura e fazer a série de diluições adequada de acordo com o quadro 2. Uma vez feita a série de diluições para todas as amostras pontuais, preparar o número adequado de placas estéreis de ágar-tripticase soja para o plaqueamento bacteriano.

3 diluições de cada cultura de ponto de tempo serão plaqueadas em triplicado de acordo com a tabela a seguir. Rotule as placas de acordo. Em seguida, pipete 100 ? L de cada cultura adequadamente diluída no centro da respectiva placa de ágar. Esterilize uma haste de vidro em forma de "L", esfrie tocando a haste no ágar longe do inóculo e espalhe imediatamente o líquido sobre a superfície do ágar. Observe que um atraso na disseminação pode resultar em crescimento excessivo de bactérias no local da inoculação.

Continue a galvanizar cada série de diluição para todas as 9 culturas pontuais, esterilizando a haste de espalhamento de vidro entre cada série de diluição.

Depois que as placas secarem por alguns minutos, inverta-as e coloque-as no 37 ? C durante a noite. Após este período de crescimento, as placas podem ser armazenadas a 4 ?C.

Após a incubação das placas de diluição durante a noite, examiná-las quanto à contaminação e uniformidade das colônias. Para cada cultura de ponto de tempo, escolha uma diluição para a qual haja entre 30-300 colônias por placa. Contar o número de colónias em cada uma das placas triplicadas para essa diluição.

Utilizando o número médio de colónias para cada diluição e o factor de diluição, calcular a concentração de bactérias na cultura original em cada momento em UFC/ml. Por exemplo, se houver em média 30 colônias do conjunto de placas triplicadas obtidas a partir de 0,1 mL da diluição de 10-4, ou 1 em 10.000, então haveria 30 dividido por 0,1 mL multiplicado por 10.000, ou 3 milhões de UFC / mL.

Usando a concentração bacteriana calculada para cada ponto de tempo, traçar um gráfico do log de base 10 das concentrações bacterianas, em UFC/mL, em relação ao tempo em horas. A partir do gráfico, identifique a fase logarítmica de crescimento da cultura bacteriana original e escolha dois dos pontos de tempo dentro da fase logarítmica, designando o primeiro desses pontos de tempo como t = 0. Calcule o tempo médio de geração usando a equação X igual a 2 elevado a n multiplicado por X0, onde X é a concentração bacteriana no tempo t, X0 é a concentração inicial em t = 0 e n é o número de gerações decorridas entre os dois pontos de tempo.

Por exemplo, suponha que X0 seja 1.000 UFC/mL e, em t = 6 h, a concentração seja 16.000 UFC/mL. Usando a equação, obtemos que 4 gerações ocorreram em 6 h, o que dá um tempo de geração de 6 dividido por 4 ou 1,5 h por geração.

A medição da cinética de crescimento bacteriano é fundamental para muitas aplicações para fins de pesquisa, agricultura ou bioengenharia.

Um uso para conhecer a taxa de crescimento bacteriano é permitir que uma quantidade precisa de uma cultura bacteriana seja obtida para inocular outra cultura ou meio. Por exemplo, certas culturas, como leguminosas, precisam ser cultivadas com bactérias simbióticas conhecidas como rizóbios que colonizam as raízes das plantas para formar nódulos e "fixar" o nitrogênio - convertendo o nitrogênio atmosférico em amônia que pode ser utilizada pela planta. Para aplicações agrícolas, uma quantidade conhecida de rizóbio é adicionada a um meio de carbono à base de turfa, que é então usado para inocular sementes de leguminosas para estabelecer a simbiose planta-bactéria.

A análise de crescimento também pode ser usada para identificar espécies bacterianas que podem degradar resíduos industriais e possivelmente gerar subprodutos valiosos. Neste exemplo, os pesquisadores investigaram como os meios de crescimento suplementados com licor negro, um resíduo da produção de celulose e papel, afetaram o crescimento de um isolado microbiano ambiental.

As bactérias não apenas demonstraram crescimento aprimorado com licor negro, mas também mostraram um padrão de crescimento "difásico", indicando a presença de mais de uma fonte de carbono no licor negro que a bactéria pode metabolizar. Componentes individuais do licor negro poderiam então ser extraídos para uma análise de crescimento mais detalhada.

Finalmente, as medições da taxa de crescimento também são úteis para caracterizar bactérias que foram projetadas para fins industriais específicos, por exemplo, para remediação da poluição por óleo. Aqui, os cientistas criaram cepas bacterianas geneticamente modificadas que contêm enzimas para degradar os componentes de hidrocarbonetos do petróleo. A análise de crescimento foi realizada, por exemplo, para verificar se a bactéria modificada aumentou a taxa de crescimento do que as bactérias normais na presença dos hidrocarbonetos tóxicos, indicando tolerância aprimorada que permitirá que as bactérias modificadas desempenhem sua função de limpeza da poluição.

Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre como analisar as taxas de crescimento bacteriano com curvas de crescimento. Agora você deve entender as diferentes fases de crescimento das culturas bacterianas, como realizar um experimento para obter uma curva de crescimento usando coleta de pontos de tempo e placas de diluição em série e como a análise de crescimento pode ser aplicada a fins industriais e de pesquisa. Como sempre, obrigado por assistir!