Análise da Curva de Crescimento Bacteriano e suas Aplicações Ambientais

1. Coleção de Alíquotas de Cultura Bacteriana

1. Um dia antes da coleta de pontos de tempo de crescimento, inocular 20 mL de caldo de soja tripática (TSB) médio em um frasco de 50 mL com E. coli.
2. Incubar durante a noite a 27 °C. Este período de incubação relativamente longo resulta em uma população de fase estacionária de tipo selvagem E. coli de aproximadamente 1099 CFU/mL.
3. No dia seguinte, use 100 μL da cultura preparada para inocular 250 mL de TSB (em um frasco de 500 mL). Homogeneizar.  Remova uma alíquota de 5 mL e leve à geladeira imediatamente a 4 °C. Este é t = 0 ou T₀ ponto de tempo, e deve conter aproximadamente 4 x 10⁵ CFU/mL.
4. Coloque o frasco do E. coli restante (245 mL) em uma incubadora de agitação de 37 °C. Remova alíquotas de cultura de 5 mL a cada hora, até 8h. Armazene cada alíquota a 4 °C. Designe essas alíquotas T₁ a T₈.

2. Diluição seriada

1. Remova as alíquotas de E. coli da geladeira e coloque no gelo para o transporte. Mantenha todas as culturas no gelo até o uso.
2. Configure uma série de tubos de diluição para obter várias diluições de cada cultura E. coli (Figura 3). Tubos de microfuge são convenientes para esta função. Cada tubo de diluição deve ter 900 μL de fluido de diluição (soro fisiológico estéril). Uma série de diluição é necessária para cada cultura E. coli (T₀ a T₈); rotular cada tubo de acordo com a Tabela 2.
   
   Figura 3. Esquema mostrando o procedimento para chapeamento E. coli.
3. Inicie as diluições adicionando 100 μL de E. coli do tubo rotulado T₀ (a cultura inicial E. coli) ao tubo A, que é a diluição de^{10 -1} de T₀. Vórtice o tubo para 5 s.
4. Posteriormente, adicione 100 μL de tubo A ao próximo tubo de soro fisiológico, tubo B, que é a diluição de 10^-2 de T₀. Continue a série de diluição necessária para cada alíquota de ponto de tempo. Lembre-se de vórtice de cada tubo antes da transferência. Também é importante usar uma nova dica de pipeta para cada transferência.

Cultura E. coli	Diluições necessárias e tubo #
	Um	B	C	D	E	F	G
T0	10-1	10-2
T1	10-1	10-2
T2	10-1	10-2	10-3
T3	10-1	10-2	10-3	10-4
T4	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5
T5	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T6	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
T7	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6
T8	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6

Mesa 2. Série de diluição necessária para cada cultura E. coli.

3. Chapeamento

1. Três diluições para cada alíquota de ponto de cultura E. coli serão emplacados, de acordo com a Tabela 3. Placas de etiqueta com o ponto de tempo (T₁ a T₈), o fator de diluição e volume a ser adicionado. Use placas triplicadas para cada diluição.
2. Adicione 100 μL de cada diluição à placa, canalizar a quantidade para o centro da placa deágar (Figura 3). Espalhe imediatamente a alíquota utilizando uma haste de vidro em forma de "L" esterilizada por uma chama. Se a alíquota não for espalhada imediatamente, ela se torna in situ na placa, resultando em crescimento excessivo bacteriano no local da inoculação inicial.
3. Repita o revestimento para cada série de diluição para os pontos de tempo T₁ a T₈. Lembre-se de esterilizar a haste entre as placas e especialmente entre diferentes diluições.
4. Uma vez que as placas tenham secado por alguns minutos, inverta e coloque em incubadora de 37 °C durante a noite. Inverter as placas impede a condensação de cair sobre a placa de ágar. Após a incubação durante a noite, as placas devem ser armazenadas na geladeira.

Cultura E.coli	Diluições a serem emplacados
T0	10-1	10-2	10-3
T1	10-1	10-2	10-3
T2	10-2	10-3	10-4
T3	10-3	10-4	10-5
T4	10-4	10-5	10-6
T5	10-5	10-6	10-7
T6	10-6	10-7	10-8
T7*	10-5	10-6	10-7
T8*	10-4	10-5	10-6

^* Diluições mais baixas levam em conta populações mais baixas devido à fase de morte.

Mesa 3. Protocolo de chapeamento para culturas E. coli.

4. Contando colônias e calculando o tempo médio de geração

1. Examine as placas para uniformidade das colônias e falta de contaminação.
2. Para cada ponto de tempo (T₀ a T_8),escolha uma diluição que contenha entre 30 e 300 colônias, e conde placas triplicadas.
3. Utilizando o fator de diluição, calcule de volta o número de células por mL de cultura original nos pontos de tempo T₀ a T₈. Por exemplo, se o número de colônias resultantes de uma diluição de 10^-4 for 30, 28 e 32:
   Número médio de colônias = 30 colônias
   Estes surgiram de 0,1 mL de uma diluição de 10^-4
   Número de colônias por mL = 30 x 10⁴ = 3 x 10⁶
4. Registro de_{parcela 10} CFU/mL versus tempo (em horas).
5. A partir do gráfico, identifique a fase exponencial do crescimento. Usando 2 pontos de tempo dentro da fase de crescimento exponencial e os números de células correspondentes em cada momento, calcule o tempo médio de geração.