Análise de RNA de amostras ambientais usando RT-PCR

A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa, ou RT-PCR, permite a detecção de vírus de RNA e expressão gênica microbiana no ambiente.

Ao contrário dos organismos celulares, de humanos a bactérias, que usam DNA como material genético, alguns vírus têm genomas feitos de RNA, incluindo muitos vírus patogênicos, como gripe, Ebola e HIV. Embora alguns vírus possam ser detectados observando o fenótipo patogênico que se desenvolve quando usado para infectar células em cultura de células, a maioria não possui métodos de caracterização baseados em cultura. O RT-PCR pode ser usado para detectar a presença desses vírus no ambiente com alta sensibilidade.

Ao mesmo tempo, organismos com genomas baseados em DNA "expressam" a informação genética codificada em seus genomas de DNA, "transcrevendo-os" em mensageiro ou "m" RNA, que pode então ser "traduzido" em proteínas para desempenhar função enzimática ou estrutural nas células. À medida que os micróbios respondem e se adaptam às mudanças no ambiente, ligando ou desligando várias vias genéticas, o RT-PCR pode ser usado para monitorar essas alterações na expressão gênica para servir como potenciais avaliadores do ecossistema.

Este vídeo abordará os princípios por trás do RT-PCR, descreverá um procedimento generalizado para realizar essa técnica e, por último, examinará algumas das maneiras pelas quais esse método está sendo aplicado na microbiologia ambiental hoje.

Existem duas partes principais neste procedimento: a extração de RNA de amostras biológicas, seguida por sua transcrição reversa em DNA.

O isolamento do RNA envolve a lise das células da amostra pela adição de um detergente que decompõe lipídios e proteínas, seguido de interrupção mecânica. A extração de RNA de vírus geralmente requer a adição de proteinases, que são enzimas que digerem proteínas, para quebrar os capsídeos dos vírus - as camadas de proteínas resistentes que formam a partícula viral. Por outro lado, ao obter RNA de organismos celulares, o lisado pode precisar ser tratado com enzimas degradadoras de DNA, ou DNAases, para evitar que os resultados a jusante sejam confundidos pela presença do DNA quimicamente semelhante.

O RNA pode então ser purificado a partir de lisados de duas maneiras. Em um método, conhecido como extração ácida de tiocianato de guanidínio-fenol-clorofórmio, o lisado é misturado com uma mistura orgânica-aquosa que é então centrifugada para separar as fases. As proteínas serão particionadas na fase orgânica, os detritos celulares lisados na interfase turva e os ácidos nucléicos na fase aquosa. A fase aquosa superior pode então ser coletada e o RNA é precipitado pela adição de álcool como o isopropanol, que diminui a solubilidade do ácido nucléico em água.

No isolamento de RNA baseado em coluna, o lisado é misturado com álcool e, em seguida, passado por uma coluna de filtração em gel com uma resina carregada negativamente, como a sílica. O lisado é preparado de modo que os íons carregados positivamente no tampão formem "pontes de sal" que permitem que a estrutura de fosfato carregada negativamente dos ácidos nucléicos se ligue à resina. Todos os outros contaminantes são então lavados. Os ácidos nucléicos são "eluídos" da coluna usando um tampão com baixo teor de sal ou água. Como o RNA de fita simples tem menos cargas negativas do que o DNA de fita dupla, ele pode ser eluído preferencialmente usando tampões de concentrações específicas.

Uma vez isolado, o RNA é transformado no DNA quimicamente mais estável. Os cientistas aproveitaram uma enzima naturalmente codificada por retrovírus como o HIV. Esta enzima é conhecida como transcriptase reversa, ou "RT".

O RT sintetiza DNA complementar ou "c" a partir de um pequeno trecho de nucleotídeos conhecido como primer. Este primer pode ter diferentes sequências, dependendo do objetivo do experimento. Por exemplo, o primer pode ser projetado para ter uma sequência específica, a fim de detectar genes ou organismos específicos. Uma vez sintetizado, este cDNA de "primeira fita" pode ser amplificado por PCR regular.

Agora que entendemos os princípios por trás do RT-PCR, vejamos um protocolo para realizar essa técnica em amostras de RNA coletadas do ambiente.

Para iniciar o procedimento, encontre um local de coleta de amostras usando coordenadas GPS ou visão. Escolha pontos aleatórios dentro de uma área para obter uma pesquisa geral dos habitats microbianos.

Para coletar a amostra sólida, empurre e torça uma broca manual no solo até a profundidade predeterminada. Quando a broca é levantada, o solo pode ser encontrado dentro da haste oca da broca.

Este solo é raspado diretamente em um saco de coleta de solo e o saco é rotulado com o local, nome, data, hora da coleta e qualquer outra informação necessária.

Transfira o solo para o laboratório e passe o solo por uma peneira de 2 mm para remover cascalho e rocha. Analise uma amostra do solo quanto ao teor de umidade, o que pode ser informativo sobre o nível de atividade microbiana no solo. Para isso, consulte o vídeo desta coleção "Determinação do Teor de Umidade do Solo".

Para a coleta de amostras de água, escolha um local de interesse semelhante à coleta de solo e colete a água em uma garrafa plástica estéril de paredes espessas. Anote o volume de água coletado. Teste a água imediatamente para parâmetros como temperatura, pH e salinidade, que podem fornecer informações importantes sobre os níveis microbianos esperados na amostra. Em seguida, coloque o frasco no refrigerador e transfira para o laboratório.

Microrganismos como vírus são coletados e concentrados da amostra ambiental.

O RNA pode ser extraído dos vírus coletados pelo método da coluna giratória usando kits comerciais de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante. O tampão de lise, suplementado com etanol, é primeiro misturado com a amostra. Coloque o número apropriado de colunas de centrifugação em tubos de coleta e, em seguida, aplique as amostras na matriz da coluna. Centrifugue as colunas a aproximadamente 12.000 x g por 1-2 min para permitir que os ácidos nucléicos se liguem à coluna e descarte o fluxo de líquido.

Adicione o tampão de lavagem às colunas e centrifugue novamente. Coloque as colunas em tubos de microcentrífugas novos e estéreis de baixa adesão de 1,5 mL. Em seguida, adicione água livre de RNases, que são enzimas que degradam o RNA, às colunas e centrifugue por 30 s para eluir o RNA. O RNA eluído pode ser armazenado a -80 ? C até o uso.

Antes do experimento, devem ser projetados primers apropriados para detectar as sequências de interesse, que podem servir como marcadores para a presença de microrganismos específicos.

Retire os reagentes RT armazenados a -20 ? C e descongele os reagentes congelados no gelo (ou à temperatura ambiente). Estes incluem nucleotídeos, tampão de transcrição reversa e primers. Depois de descongelados, mantenha os reagentes no gelo; a enzima transcriptase reversa e o inibidor de RNase devem ser mantidos sempre no gelo.

Enquanto os reagentes estão descongelando, calcule os volumes e concentrações dos componentes da reação. Depois que os reagentes forem descongelados, bata suavemente e gire cada tubo para garantir que o conteúdo esteja bem misturado.

Trabalhando em uma capela de fluxo laminar para evitar contaminação, monte os componentes em uma mistura mestre para adicionar a cada tubo de PCR. Ao montar a master mix em um tubo Eppendorf, certifique-se de trocar as pontas da pipeta entre cada reagente para evitar contaminação. Depois que todos os reagentes tiverem sido adicionados ao tubo Eppendorf, bata suavemente e gire o tubo da mistura principal para garantir uma mistura homogênea.

Rotule um conjunto de tubos de PCR, certificando-se de incluir controles. Alíquota de um volume igual da mistura principal em cada tubo. Em seguida, adicione componentes específicos da reação, como os extratos de RNA ou água para controle negativo.

Depois que todos os componentes forem adicionados, coloque os tubos em um termociclador e defina o programa de transcrição reversa para funcionar. O cDNA pode então ser submetido à amplificação por PCR. Para obter uma descrição detalhada desta etapa, consulte o vídeo desta coleção sobre PCR.

Quando a PCR estiver completa, parte do produto da PCR pode ser separado e visualizado em um gel de agarose. Por exemplo, um primer específico para genes foi usado aqui para detectar a presença de um vírus de RNA. Bandas do tamanho esperado são obtidas a partir da reação RT-PCR, mas não dos controles negativos, indicando a presença desse vírus na amostra de água que está sendo testada.

A identificação de microrganismos à base de RNA por RT-PCR permite a análise da saúde ecológica, dos riscos ambientais e da conservação da biodiversidade.

O uso de microrganismos para limpar hidrocarbonetos e solventes de solo e água poluídos representa uma alternativa de remediação ecossustentável. Compreender a expressão gênica microbiana nativa pode destacar vias microbianas específicas que quebram os contaminantes nessas condições. O RT-PCR é frequentemente utilizado para amplificar o mRNA de tais amostras ambientais.

As medidas de saúde pública geralmente exigem vigilância rápida de fontes virais de infecção no ambiente. A gripe aviária, por exemplo, é altamente infecciosa e pode se espalhar rapidamente para aves, gado e até humanos. Neste exemplo em particular, os pesquisadores procuraram a ameaça da gripe aviária transmitida por aves selvagens.

Usando uma configuração e aparelho RT-PCR portátil, eles rastrearam uma variedade de aves selvagens, mesmo em áreas remotas, para detectar infecções precocemente e prevenir a transmissão.

Finalmente, o RT-PCR pode ser usado para caracterizar "biopesticidas" que estão sendo desenvolvidos para atingir pragas como a cigarrinha-de-asa-vítrea, Homalodisca vitripennis, hospedeira de uma doença que danifica gravemente as videiras na América do Norte. Um novo vírus de RNA de fita simples está sendo desenvolvido como um agente para infectar esse inseto. Usando uma combinação de cultura de células Homalodisca e confirmação de RT-PCR da carga viral, esses autores foram capazes de propagar uma alta concentração de vírus para uso como agente de controle biológico.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE à Análise de Organismos Ambientais Baseados em RNA por RT-PCR. Agora você deve entender a teoria por trás do protocolo, como aplicar a técnica à sua pesquisa e algumas das maneiras pelas quais ela está sendo usada no campo hoje. Obrigado por assistir!