Análise de RNA de amostras ambientais usando RT-PCR

1. Coleta de Amostras: Amostra de Solo

1. Encontre uma amostra através de GPS, coordenadas ou visão.
2. Para amostragem aleatória, escolha pontos aleatórios dentro de uma área para obter um censo geral de habitats microbianos. A amostragem transect coleta de pontos ao longo de uma linha reta, por exemplo,adjacente a um córrego. As amostras de grade são sistematicamente retiradas de pontos em intervalos regulares e são úteis para mapear comunidades microbianas em uma área desconhecida ou variável.
3. A amostragem dentro de uma profundidade de 7,5-15 cm fornece acesso à atividade microbiana mais abundante que está próxima, mas não dentro, da rizosfera (a região estreita do solo diretamente afetada pelas raízes das plantas e seus microrganismos associados).
4. Para coletar a amostra do solo, empurre e gire uma mão no chão até a profundidade predeterminada.
5. Levante o auger. O solo é encontrado dentro da haste oca do auger.
6. Raspe o solo no fundo do auger em um saco de coleta de solo. Certifique-se de não tocar ou contaminar o solo.
7. Rotule a bolsa corretamente com localização, nome, data e hora.
8. No laboratório, passe o solo através de uma peneira de 2 mm para remover qualquer cascalho e rocha.
9. Analise uma parte do solo para obter o teor de umidade do solo. Para obter detalhes desta etapa, consulte o vídeo da JoVE Science Education sobre a umidade do solo.

2. Coleta de Amostras: Amostra de Água

1. Encontre a localização da amostra via GPS, coordenadas ou visão.
2. Pegue a água em uma garrafa de armazenamento. Registrar o volume de água coletado; se os micróbios da amostra forem avaliados quantitativamente, a concentração microbiana pode ser determinada com base no volume coletado.
3. Teste imediatamente a água para quaisquer parâmetros necessários para o experimento (temperatura, pH, condutividade, salinidade, nitrogênio e teor de fósforo, etc.) utilizando as sondas eletrônicas apropriadas.
4. Coloque a garrafa contendo a amostra de água em um refrigerador com gelo. Transfira o refrigerador para o laboratório.

3. Extração de RNA

1. Para coletar e concentrar microrganismos da amostra ambiental, consulte o vídeo da JoVE Science Education sobre a extração de ácido nucleico comunitário.
2. Extrair RNA de vírus usando um kit de extração comercial de acordo com as instruções do fabricante.
3. Brevemente, misture primeiro as amostras com tampão de lise complementado com etanol e, em seguida, adicione as amostras em colunas de spin.
4. Centrifugar as colunas a aproximadamente 12.000 x g, descartar fluxo através. Adicione o tampão de lavagem às colunas e centrífugas novamente.
5. Adicione água livre de RNase às colunas e centrífuga por 30 s para elute RNA em tubos de microfuge de baixa adesão estéreis de 1,5 mL.

4. Transcrição reversa - PCR

1. Recupere os seguintes reagentes do congelador -20 °C: dNTP, concentrado(por exemplo,10x) tampão de transcrição reversa, primers (neste exemplo, primers aleatórios). Descongele isso no gelo ou à temperatura ambiente dentro de um capô limpo, e mantenha-os no gelo uma vez descongelados. Também recupere a transcriptase reversa e o inibidor de RNase e mantenha-os no gelo.
2. Calcule os volumes de reagente necessários para fazer uma "mistura mestre" que combina todos os reagentes constantes entre cada reação (ver Tabela 1 para uma reação amostral). Prepare mix mestre suficiente para cada amostra, bem como um controle positivo (usando um modelo de transcrição conhecido) e controle negativo (por exemplo,sem transcrição reversa, com apenas água como modelo, etc.) reações. Inclua um volume extra de 10%.
3. Monte a mistura mestre em tubos de microfuça de baixa adesão de 1,5 mL. Isso minimiza a ligação das moléculas de reagente às paredes plásticas dos tubos.
4. Quando os reagentes forem descongelados, adicione volumes calculados ao tubo de microfuça. Vórtice suavemente e centrífuga cada tubo antes da adição. Certifique-se de alterar as pontas da pipeta entre a adição de cada reagente para evitar contaminação.
5. Depois de todos os reagentes terem sido adicionados, vórtice e centrífuga a mistura mestre para garantir uma mistura homogênea. Coloque os reagentes de volta ao armazenamento a -20 °C.
6. Prepare e rotule tiras PCR de 8 tubos, designando um tubo para cada amostra ou reação de controle.
7. Alíquota igual de mistura mestre em cada tubo. Em seguida, adicione componentes específicos de reação, como os extratos de RNA.
8. Coloque a tampa da tampa da tira com segurança na tira PCR e centrífuga em um minicentrifuge com um adaptador de tubo de tira para garantir que todo o líquido seja coletado na parte inferior de cada tubo(Figura 2).
9. Coloque a tira PCR com segurança no termociclador. Pressione para baixo para garantir que os tubos estejam protegidos.
10. Defina o termociclador para executar o programa apropriado para o RT que está sendo usado (consulte tabela 2 para um protocolo de amostra). Quando o programa estiver concluído, os tubos conterão produtos cDNA, que podem então ser submetidos à amplificação pcr. Para obter detalhes, consulte os vídeos da JoVE Science Education sobre PCR e PCR quantitativo. Armazene cDNA a -20 °C até usar.

Figura 2. Tira de 8 tubos tampada contendo mistura e extrato mestre.

Reagente	Volume por reação 1 (μL)
10x tampão RT	2.0
25x dNTPs	0.8
Primer aleatório de 10x	2.0
Multiscrito	1.0
Inibidor de Rnase	1.0
Grau Molecular H2O	3.2
Total Volume	10

Mesa 1. RT Master Mix Ingredientes.

Passo 1	Passo 2	Passo 3	Passo 4
25 °C, 10 min	37 °C , 120 min	85 °C , 5 min	4 °C , ∞

Mesa 2. Programa de Thermocicr de Reação RT.