3.8: Cromatografia gasosa (GC) com detecção por ionização em chama

1. Inicialização do GC

1. Ligue o gás e o ar do portador de hélio e ajuste os medidores de pressão no instrumento.
2. Ligue o forno da coluna a uma alta temperatura (tipicamente 250 °C ou superior) para assar na coluna. Não exceda a temperatura máxima da coluna. Isso removerá quaisquer contaminantes. Deixe assar por pelo menos 30 minutos antes de executar uma amostra.

2. Fazer um arquivo de métodos

1. No software que controla o instrumento, insira todos os valores desejados para um arquivo de métodos. Primeiro, defina as configurações do autosampler. Defina o número de enxágües pré-executados, enxágües pós-escoamentos e enxágues com amostra. Estas enxágües limpam a coluna entre diferentes amostras.
2. A quantidade injetada é tipicamente de 1 μL. Uma proporção dividida é geralmente definida porque injetar toda uma amostra pode sobrecarregar a coluna. Se a razão de divisão for de 100:1, isso significa que para cada 1 parte que é injetada no instrumento 100 peças vão para o lixo.
3. Insira os parâmetros de fase móvel. A vazão é controlada pelo conjunto de pressão. Taxas de fluxo mais rápidas levam a separações mais rápidas, mas há menos tempo para o analito interagir com a coluna.
4. Digite a programação de temperatura. Para uma corrida isotemal, entre na temperatura da separação e, em seguida, um tempo para a separação. Para uma eluição gradiente, digite a temperatura inicial e o tempo de espera, a temperatura final e o tempo de espera, e a velocidade da rampa em °C/min. Também é definido um tempo de equilíbrio que permite que a coluna esfrie a temperatura original entre as corridas.
5. Digite os parâmetros do detector. Uma temperatura do detector e uma taxa de amostragem serão inseridas. O detector deve ser sempre uma temperatura mais alta do que a da coluna para que nenhum analito condensa no detector.
6. Salve o arquivo de métodos. Os parâmetros também podem precisar ser baixados para que sejam lidos pelo GC.

3. Coleta de Dados GC

1. Ligue o gás hidrogênio e certifique-se de que o medidor de pressão esteja configurado corretamente. Acenda a chama do FID.
2. No rack de autosampler, encha o frasco de lavagem com solvente de lavagem, como acetonitrilo ou metanol. Certifique-se de que o frasco de lixo está vazio.
3. Prepare a amostra. Se houver alguma chance de partículas na amostra, filtre a amostra. Como os resíduos plásticos às vezes podem ser vistos com GC, use apenas seringas de vidro e frascos de vidro para preparar sua amostra.
4. Encha o frasco pelo menos no meio do caminho com a amostra para que a seringa autosampler seja garantida para pegar a amostra. Os frascos de feixe automático são tipicamente de 2 mL, mas se o volume da amostra for limitado, as pastilhas de frasco estão disponíveis para reduzir o volume amostral necessário.
5. Coloque o frasco de amostra no rack do autosampler. Acompanhe em que posição cada amostra está.
6. Antes da execução, zero a linha de base do gravador de gráficos no software do computador.
7. Os arquivos podem ser coletados como uma única execução ou usando uma tabela de lote para várias execuções. Certifique-se de especificar o número correto do frasco para a amostra. Aperte o botão "iniciar" e faça um arquivo.
8. Os dados são normalmente analisados com um programa de software. Os parâmetros que podem ser medidos incluem tempo de retenção, altura máxima, área de pico e número de placas teóricas.

4. Resultados: Análise gc de amostras de café

1. Neste exemplo, foi realizada a análise gc-FID para cafeína e ácido palmítico, dois compostos encontrados no café. A cafeína é menos polar que o ácido palmítico, que tem uma cauda de alkano de cadeia longa. Assim, a cafeína é menos retida e elutes primeiro na coluna nãopolar de 95% dimetilpolisiloxano e 5% fenil-arylene(Figura 1).
2. A partir do cromatógrafo, as áreas de pico podem ser calculadas. As áreas de pico são proporcionais à massa de carbono que passa pelo detector e podem ser usadas para fazer uma curva de calibração de resposta de instrumento versus concentração. Para a Figura 1, a área de pico é de 27.315 para cafeína e 18.852 para ácido palmítico.
3. Uma medida de eficiência da coluna é N, o número de placas teóricas. N pode ser calculado a partir do cromatógrafo para cada pico. Para a Figura 1, N é 283.000 para cafeína e 261.000 para ácido palmítico.
4. A Figura 2 mostra o efeito da temperatura nas separações isotemais. Duas separações são sobrepostas da mesma amostra de cafeína e ácido palmítico. O primeiro é de 180 °C e o segundo a 200 °C. Os tempos de retenção são muito menores para a corrida de temperatura mais alta.

Figura 1. Análise GC-FID de amostras de cafeína e ácido palmítico. O elute padrão de cafeína de 5 mM primeiro, seguido pela amostra de ácido palmítico de 1 mM. A rampa de temperatura foi de 0,1 min a 150 °C seguida de uma rampa de 10 °C/min a 220 °C onde a temperatura foi mantida por 5 min.

Figura 2. Análise GC-FID de corridas isotérmicas de uma amostra de café assado escuro. Uma comparação de GC-FID é de 180 °C e 200 °C para uma amostra de café assado escuro. Os picos elute muito mais rápido com a temperatura de 200 °C.

A cromatografia gasosa, ou GC, é uma técnica usada para separar, detectar e quantificar pequenos compostos voláteis na fase gasosa.

No GC, as amostras líquidas são vaporizadas e, em seguida, transportadas por um gás inerte através de uma coluna longa e fina. Os analitos são separados com base em sua afinidade química com um revestimento no interior da coluna.

Como o GC requer que os analitos sejam vaporizados para a fase gasosa, o instrumento é ideal para produtos químicos voláteis e apolares com menos de 1.000 daltons de massa. Para moléculas maiores, aquosas ou polares que são difíceis de vaporizar, a cromatografia líquida é uma alternativa útil. Este vídeo apresentará os fundamentos da cromatografia gasosa e ilustrará as etapas necessárias para analisar as espécies químicas em uma amostra de mistura não aquosa usando um cromatógrafo gasoso.

O instrumento GC tem cinco componentes essenciais. Primeiro, uma porta de injeção é usada para introduzir a amostra no instrumento. Em seguida, uma câmara de aquecimento vaporiza a amostra e a mistura com um gás inerte. O gás inerte, como hélio ou nitrogênio, transporta a amostra vaporizada através do sistema. Combinados, o gás de arraste e a amostra compõem a fase móvel. Em seguida, a fase móvel entra na coluna aquecida, separando os analitos à medida que fluem. Por fim, um detector registra os gases à medida que saem da coluna, ou eluem, e envia dados para um computador para análise. O componente mais crítico do instrumento é a coluna. A coluna é um capilar com uma matriz de fase estacionária que reveste as paredes internas. Alternativamente, as colunas podem ser embaladas com contas revestidas com matriz. A fase estacionária é geralmente polidimetilsiloxano modificado, que é ideal para resolver moléculas apolares. Suas propriedades de separação são refinadas pela adição de 5?10% de grupos fenil, cianopropil ou trifluoropropil.

Analitos com baixa afinidade química para a fase estacionária movem-se rapidamente através da coluna, enquanto moléculas com alta afinidade são retardadas à medida que adsorvem nas paredes da coluna. O período de tempo que um composto passa dentro da coluna é chamado de tempo de retenção, ou Rt, e permite que os compostos sejam identificados. O detector fica no final da coluna e registra os gases à medida que eles eluem. A detecção de ionização de chama, ou FID, é amplamente utilizada porque detecta íons de carbono, permitindo detectar praticamente qualquer composto orgânico. No FID, os analitos entram em combustão em uma chama de hidrogênio-ar ao sair da coluna, produzindo íons de carbono que induzem uma corrente em eletrodos próximos. A corrente é diretamente proporcional à massa de carbono, portanto, a concentração do composto pode ser determinada. O resultado final é um cromatograma, que é um gráfico de sinal FID versus tempo, mostrando cada componente eluído à medida que saem da coluna. Idealmente, cada pico terá uma forma gaussiana simétrica. Características assimétricas, como cauda de pico e frente de pico, podem ser devidas a sobrecarga, problemas de injeção ou a presença de grupos funcionais que aderem à coluna, como ácidos carboxílicos.

Agora que os princípios da cromatografia gasosa foram discutidos, vamos dar uma olhada em como realizar e analisar uma análise de cromatografia gasosa no laboratório.

Antes de executar um experimento, ligue o tanque de gás hélio. Abra o software no computador e asse a coluna para remover quaisquer contaminantes potenciais. Defina o forno para uma temperatura alta, normalmente 250 ? C ou superior e asse a coluna por pelo menos 30 min.

Em seguida, ajuste as configurações do amostrador automático. Defina o número de enxágues pré e pós-corrida para limpar a coluna entre as amostras.

Use um volume de amostra de 1 ? L e defina a configuração da taxa de divisão para programar o instrumento para aceitar apenas uma fração da entrada. Ajuste a vazão do gás de arraste e use as configurações estabelecidas ou tentativa e erro para encontrar a pressão ideal.

Agora insira as configurações de temperatura para o experimento. Para uma corrida isotérmica, insira a temperatura e o tempo para a separação. Alternativamente, para um gradiente de temperatura, insira a temperatura inicial e o tempo de espera, a temperatura final e o tempo de espera e a velocidade de rampa em ? C por min.

Defina o tempo para a coluna esfriar entre as execuções para uma execução de gradiente ou isotérmica.

Por fim, defina a taxa de amostragem e a temperatura do detector. O detector deve estar sempre mais quente que a coluna para evitar condensação. Depois que todas as configurações estiverem programadas, salve o arquivo de métodos.

Ative o detector abrindo a válvula do tanque de hidrogênio e acenda a chama do FID. O instrumento agora está pronto para análise de amostra.

Para executar a amostra no GC, primeiro encha um frasco com um solvente de lavagem, como acetonitrila ou metanol. Prepare a amostra, certificando-se de usar seringas de vidro e frascos de vidro, pois resíduos de plástico podem contaminar o GC.

Agora adicione a amostra preparada a um frasco com uma pipeta. Encha pelo menos até a metade, de modo que a seringa do amostrador automático fique totalmente submersa. Em seguida, carregue os frascos de lavagem e sample no rack do amostrador automático. Antes de executar a amostra, zere a linha de base do cromatograma no software do computador. Os dados podem ser coletados como uma única execução ou usando uma tabela de lotes para várias execuções. Pressione "iniciar" para executar a amostra.

Neste exemplo, os níveis de cafeína e ácido palmítico no café foram analisados usando GC com FID. A cafeína é menor e menos polar, por isso é menos atraída pela coluna e elui primeiro. O ácido palmítico, que tem uma longa cauda de cadeia alcana, elui mais tarde devido a uma maior afinidade com a fase estacionária.

Como as dimensões dos picos são proporcionais à massa de carbono, a concentração de cada componente pode ser determinada a partir de sua respectiva área de pico no cromatógrafo e comparada com os padrões de concentração conhecidos.

O efeito da temperatura da coluna também foi explorado. Aos 200? C, as amostras se moveram através da coluna duas vezes mais rápido que a amostra a 180 °C. Observe que, embora as alturas dos picos mudem, a área sob a curva permanece constante.

O GC é uma técnica importante para análise química e é amplamente utilizado em aplicações científicas, comerciais e industriais.

Devido à simplicidade do GC, os químicos o usam rotineiramente para monitorar reações químicas e pureza do produto. As reações podem ser amostradas ao longo do tempo para mostrar a formação do produto e a depleção do reagente. O cromatógrafo revela as concentrações do produto e também a presença de produtos não intencionais ou secundários.

O GC é comumente usado em conjunto com a espectrometria de massa, chamada GS-MS, para identificar inequivocamente produtos químicos em amostras ou ar. A espectrometria de massa, ou MS, separa as moléculas com base em sua relação massa/carga e permite a determinação de identidades compostas. O GC-MS é uma ferramenta poderosa, pois o GC primeiro separa misturas complexas em componentes individuais, e o MS fornece informações precisas de massa e identidade química.

O GC é usado rotineiramente no monitoramento do ar para detectar compostos orgânicos voláteis, ou VOCs, que podem surgir da poluição ambiental, pesticidas e explosivos. O GC pode ser usado para rastrear e identificar VOCs tanto em ambientes internos para análise de headspace quanto em ambientes externos, para saúde, segurança e proteção.

Você acabou de assistir à introdução da JoVE à cromatografia gasosa com FID. Agora você deve entender os princípios básicos da cromatografia gasosa e da detecção de FID.

Obrigado por assistir!