Curvas de calibração

1. Fazendo os Padrões: Diluições seriais

1. Faça uma solução concentrada de estoque do padrão. Normalmente, o composto é pesado com precisão e, em seguida, transferido quantitativamente para um frasco volumoso. Adicione algum solvente, misture para que a amostra se dissolva e, em seguida, encha a linha com o solvente adequado.
2. Realizar diluições seriais. Pegue outro frasco volumoso e pipeta a quantidade de padrão necessária para a diluição, em seguida, encha a linha com solvente e misture. Uma diluição de dez vezes é tipicamente feita, por isso para um frasco volumoso de 10 mL, adicione 1 mL da diluição anterior.
3. Continue conforme necessário para mais diluições, pipetando da solução anterior para diluí-la para fazer a próxima amostra. Para uma boa curva de calibração, são necessárias pelo menos 5 concentrações.

2. Execute as amostras para a Curva de Calibração e a Desconhecida

1. Execute as amostras com o espectrômetro UV-Vis para determinar a resposta instrumental necessária para a curva de calibração.
2. Faça a leitura com a primeira amostra. É uma boa ideia executar as amostras em ordem aleatória ( ouseja, não mais alta para menor ou mais baixa para alta) no caso de haver algum erro sistemático. Para obter uma estimativa de ruído, repita a leitura em qualquer amostra 3-5x.
3. Execute as amostras padrão adicionais, repetindo as medidas para cada amostra para obter uma estimativa de ruído. Registo os dados para fazer um plot posterior.
4. Execute a amostra desconhecida( s). Use condições semelhantes para executar as normas possível. Assim, a matriz amostral ou tampão deve ser o mesmo, o pH deve ser o mesmo, e a concentração deve estar na faixa das normas executadas.

3. Fazendo a curva de calibração

1. Registo os dados em uma planilha e use um programa de computador para traçar os dados versus concentração. Se pelo menos medidas triplicadas forem tomadas para cada ponto, as barras de erro podem ser traçadas do desvio padrão dessas medidas para estimar o erro de cada ponto. Para algumas curvas, os dados podem precisar ser plotados com um eixo como um tronco para obter uma linha. A equação que rege a curva de calibração é geralmente conhecida antes do tempo, de modo que um plot de log é usado quando há um registro na equação.
2. Examine a curva de calibração. Parece linear? Tem uma porção que parece não linear ( ouseja, atingiu o limite da resposta instrumental)? Para verificar, encaixe todos os dados para uma regressão linear usando o software. Se o coeficiente de determinação (R²) não for alto, remova alguns dos pontos no início ou final da curva que não parecem se encaixar na linha e realize novamente a regressão linear. Não é aceitável remover pontos no meio só porque eles têm uma grande barra de erro. A partir desta análise, decida qual parte da curva é linear.
3. A saída do linear deve ser uma equação do formato y=mx+b, onde m é a inclinação e b é o y-intercept. As unidades para a inclinação são a unidade/concentração do eixo y, neste exemplo (Figura 1) absorção/μM. As unidades para a interceptação y são as unidades do eixo Y. Um coeficiente de determinação (R²) é obtido. Quanto maior o R^2, melhor o ajuste; um ajuste perfeito dá um R² de 1. O programa também pode ser capaz de dar uma estimativa do erro na encosta e na interceptação.

4. Resultados: Curva de Calibração da Absorvância de Corante Azul #1

1. A curva de calibração para absorção de #1 de corante azul (a 631 nm) é mostrada abaixo(Figura 1). A resposta é linear de 0 a 10 μM. Acima dessa concentração o sinal começa a nivelar porque a resposta está fora da faixa linear do espectrofotômetro UV-Vis.
2. Calcule o LOD. Da inclinação da curva de calibração, o LOD é de 3*S.D. (ruído)/m. Para esta curva de calibração, o ruído foi obtido tomando um desvio padrão de medições repetidas e foi de 0,021. O LOD seria de 3*0,021/.109=0,58 μM.
3. Calcule o LOQ. O LOQ é 10*S.D.(ruído)/m. Para esta curva de calibração, LOQ é 10 * 0,021/.109 =1,93 μM.
4. Calcule a concentração do desconhecido. Use a equação da linha para calcular a concentração da amostra desconhecida. A curva de calibração só é válida se o desconhecido cair na faixa linear das amostras padrão. Se as leituras forem muito altas, a diluição pode ser necessária. Neste exemplo, a bebida esportiva desconhecida foi diluída 1:1. A absorvância foi de 0,243 e isso correspondeu a uma concentração de 2,02 μM. Assim, a concentração final de corante azul #1 na bebida esportiva foi de 4,04 μM.

Figura 1. Curvas de calibração para absorvância UV-Vis de corante azul. Esquerda: A absorvância foi medida de diferentes concentrações de corante azul #1. As respostas se nivelam após 10 μM, quando a absorvância for superior a 1. As barras de erro são de medidas repetidas da mesma amostra e são desvios padrão. Certo: A porção linear da curva de calibração é encaixada com uma linha, y=0,109 * x + 0,0286. Os dados desconhecidos são mostrados em preto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.