3.4: Curvas de calibração

1. Fazendo os Padrões: Diluições seriais

1. Faça uma solução concentrada de estoque do padrão. Normalmente, o composto é pesado com precisão e, em seguida, transferido quantitativamente para um frasco volumoso. Adicione algum solvente, misture para que a amostra se dissolva e, em seguida, encha a linha com o solvente adequado.
2. Realizar diluições seriais. Pegue outro frasco volumoso e pipeta a quantidade de padrão necessária para a diluição, em seguida, encha a linha com solvente e misture. Uma diluição de dez vezes é tipicamente feita, por isso para um frasco volumoso de 10 mL, adicione 1 mL da diluição anterior.
3. Continue conforme necessário para mais diluições, pipetando da solução anterior para diluí-la para fazer a próxima amostra. Para uma boa curva de calibração, são necessárias pelo menos 5 concentrações.

2. Execute as amostras para a Curva de Calibração e a Desconhecida

1. Execute as amostras com o espectrômetro UV-Vis para determinar a resposta instrumental necessária para a curva de calibração.
2. Faça a leitura com a primeira amostra. É uma boa ideia executar as amostras em ordem aleatória ( ouseja, não mais alta para menor ou mais baixa para alta) no caso de haver algum erro sistemático. Para obter uma estimativa de ruído, repita a leitura em qualquer amostra 3-5x.
3. Execute as amostras padrão adicionais, repetindo as medidas para cada amostra para obter uma estimativa de ruído. Registo os dados para fazer um plot posterior.
4. Execute a amostra desconhecida( s). Use condições semelhantes para executar as normas possível. Assim, a matriz amostral ou tampão deve ser o mesmo, o pH deve ser o mesmo, e a concentração deve estar na faixa das normas executadas.

3. Fazendo a curva de calibração

1. Registo os dados em uma planilha e use um programa de computador para traçar os dados versus concentração. Se pelo menos medidas triplicadas forem tomadas para cada ponto, as barras de erro podem ser traçadas do desvio padrão dessas medidas para estimar o erro de cada ponto. Para algumas curvas, os dados podem precisar ser plotados com um eixo como um tronco para obter uma linha. A equação que rege a curva de calibração é geralmente conhecida antes do tempo, de modo que um plot de log é usado quando há um registro na equação.
2. Examine a curva de calibração. Parece linear? Tem uma porção que parece não linear ( ouseja, atingiu o limite da resposta instrumental)? Para verificar, encaixe todos os dados para uma regressão linear usando o software. Se o coeficiente de determinação (R²) não for alto, remova alguns dos pontos no início ou final da curva que não parecem se encaixar na linha e realize novamente a regressão linear. Não é aceitável remover pontos no meio só porque eles têm uma grande barra de erro. A partir desta análise, decida qual parte da curva é linear.
3. A saída do linear deve ser uma equação do formato y=mx+b, onde m é a inclinação e b é o y-intercept. As unidades para a inclinação são a unidade/concentração do eixo y, neste exemplo (Figura 1) absorção/μM. As unidades para a interceptação y são as unidades do eixo Y. Um coeficiente de determinação (R²) é obtido. Quanto maior o R^2, melhor o ajuste; um ajuste perfeito dá um R² de 1. O programa também pode ser capaz de dar uma estimativa do erro na encosta e na interceptação.

4. Resultados: Curva de Calibração da Absorvância de Corante Azul #1

1. A curva de calibração para absorção de #1 de corante azul (a 631 nm) é mostrada abaixo(Figura 1). A resposta é linear de 0 a 10 μM. Acima dessa concentração o sinal começa a nivelar porque a resposta está fora da faixa linear do espectrofotômetro UV-Vis.
2. Calcule o LOD. Da inclinação da curva de calibração, o LOD é de 3*S.D. (ruído)/m. Para esta curva de calibração, o ruído foi obtido tomando um desvio padrão de medições repetidas e foi de 0,021. O LOD seria de 3*0,021/.109=0,58 μM.
3. Calcule o LOQ. O LOQ é 10*S.D.(ruído)/m. Para esta curva de calibração, LOQ é 10 * 0,021/.109 =1,93 μM.
4. Calcule a concentração do desconhecido. Use a equação da linha para calcular a concentração da amostra desconhecida. A curva de calibração só é válida se o desconhecido cair na faixa linear das amostras padrão. Se as leituras forem muito altas, a diluição pode ser necessária. Neste exemplo, a bebida esportiva desconhecida foi diluída 1:1. A absorvância foi de 0,243 e isso correspondeu a uma concentração de 2,02 μM. Assim, a concentração final de corante azul #1 na bebida esportiva foi de 4,04 μM.

Figura 1. Curvas de calibração para absorvância UV-Vis de corante azul. Esquerda: A absorvância foi medida de diferentes concentrações de corante azul #1. As respostas se nivelam após 10 μM, quando a absorvância for superior a 1. As barras de erro são de medidas repetidas da mesma amostra e são desvios padrão. Certo: A porção linear da curva de calibração é encaixada com uma linha, y=0,109 * x + 0,0286. Os dados desconhecidos são mostrados em preto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As curvas de calibração são usadas para entender a resposta instrumental a um analito e para prever a concentração do analito em uma amostra.

Uma curva de calibração é criada preparando primeiro um conjunto de soluções-padrão com concentrações conhecidas do analito. A resposta do instrumento é medida para cada um e plotada em relação à concentração da solução-padrão. A porção linear deste gráfico pode então ser usada para prever a concentração de uma amostra do analito, correlacionando sua resposta à concentração.

Este vídeo apresentará as curvas de calibração e seu uso, demonstrando a preparação de um conjunto de padrões, seguido da análise de uma amostra com concentração desconhecida.

Um conjunto de soluções padrão é usado para preparar a curva de calibração. Essas soluções consistem em uma faixa de concentrações que abrangem a concentração aproximada do analito.

As soluções-padrão são frequentemente preparadas com uma diluição em série. Efectua-se uma diluição em série preparando primeiro uma solução-mãe da substância a analisar. A solução estoque é então diluída em uma quantidade conhecida, geralmente uma ordem de magnitude. A nova solução é então diluída da mesma maneira e assim por diante. Isso resulta em um conjunto de soluções com concentrações que variam em várias ordens de magnitude.

A curva de calibração é um gráfico de sinal instrumental versus concentração. O gráfico dos padrões deve ser linear e pode ser ajustado com a equação y = mx + b. As partes não lineares da parcela devem ser descartadas, pois essas faixas de concentração estão fora do limite de linearidade.

A equação da linha de melhor ajuste pode então ser usada para determinar a concentração da amostra, usando o sinal do instrumento para correlacionar com a concentração. As amostras com medições que se encontram fora da gama linear da parcela devem ser diluídas, a fim de se encontrarem na gama linear.

O limite de detecção do instrumento, ou a medição mais baixa que pode ser determinada estatisticamente sobre o ruído, também pode ser calculada a partir da curva de calibração. Uma amostra em branco é medida várias vezes. O limite de detecção é geralmente definido como o sinal em branco médio mais 3 vezes seu desvio padrão.

Finalmente, o limite de quantificação também pode ser calculado. O limite de quantificação é a menor quantidade de analito que pode ser quantificada com precisão. Isso é calculado como 10 desvios padrão acima do sinal em branco.

Agora que você aprendeu o básico de uma curva de calibração, vamos ver como preparar e usar uma no laboratório.

Primeiro, prepare uma solução de estoque concentrada do padrão. Pesar com precisão o padrão e transferi-lo para um balão volumétrico. Adicione uma pequena quantidade de solvente e misture para que a amostra se dissolva. Em seguida, encha até a linha com solvente. É importante usar o mesmo solvente que a amostra.

Para preparar os padrões, pipetar a quantidade necessária no balão volumétrico. Em seguida, encha o frasco até a linha com solvente e misture.

Continue fazendo os padrões pipetando a partir da solução estoque e diluindo. Para uma boa curva de calibração, são necessárias pelo menos 5 concentrações.

Agora, execute amostras com o instrumento analítico, neste caso um espectrofotômetro UV-Vis, para determinar a resposta instrumental necessária para a curva de calibração.

Tome a medida do primeiro padrão. Execute os padrões em ordem aleatória, caso haja erros sistemáticos. Meça cada padrão 3?5x?para obter uma estimativa de ruído.

Meça o restante dos padrões, repetindo as medições para cada um. Registre todos os dados.

Por fim, execute o exemplo. Use a mesma matriz de amostra e condições de medição que foram usadas para os padrões. Certifique-se de que a amostra esteja dentro da faixa dos padrões e do limite do instrumento.

Para construir a curva de calibração, use um programa de computador para traçar os dados como sinal versus concentração. Use o desvio padrão das medições repetidas para cada ponto de dados para criar barras de erro.

Remova partes da curva que não são lineares e, em seguida, execute uma regressão linear e determine a linha de melhor ajuste. A saída deve ser uma equação na forma y = m x + b. Um valor R2 próximo a 1 denota um bom ajuste.

Esta é a curva de calibração para o corante azul #1, medido a 631 nm. A resposta é linear entre 0 e 15 mM.

Calcular a concentração da amostra utilizando a equação da recta de melhor ajuste. A absorbância para a amostra foi de 0,141 e correspondeu a uma concentração de 6,02 mM.

Agora que você viu como uma curva de calibração pode ser usada com um espectrofotômetro UV-Vis, vamos dar uma olhada em algumas outras aplicações úteis.

As curvas de calibração são frequentemente usadas em aplicações eletroquímicas, pois o sinal do eletrodo deve ser calibrado para a concentração de íons na solução. Neste exemplo, os dados foram coletados para um eletrodo íon-seletivo para flúor.

Os dados de concentração devem ser plotados na escala logarítmica para obter uma linha. Esta curva de calibração pode ser usada para medir a concentração de flúor em uma solução, como pasta de dente ou água potável.

A cromatografia líquida de alta eficiência, ou HPLC, é uma técnica de separação e análise muito utilizada em química analítica. A HPLC separa os componentes de uma mistura com base no tempo necessário para que as moléculas percorram o comprimento da coluna de cromatografia. Esse tempo varia dependendo de uma variedade de propriedades químicas das moléculas.

A eluição das moléculas é medida usando um detector, resultando em um cromatograma. A área do pico pode ser correlacionada à concentração usando uma curva de calibração simples de uma variedade de soluções padrão, como neste exemplo de ingredientes populares de refrigerantes.

Em alguns casos, onde a matriz da solução interfere na medição do soluto, uma curva de calibração clássica pode ser imprecisa. Nesses casos, uma curva de calibração modificada é preparada. Para isso, uma variedade de volumes de solução padrão é adicionada à amostra. O gráfico de sinal para concentração é criado, onde a interceptação x é igual à concentração original da solução da amostra. Para obter mais detalhes sobre esta técnica, assista ao vídeo de educação científica do JoVE, "O método de adição padrão".

Você acabou de assistir à introdução do JoVE à curva de calibração. Agora você deve entender onde a curva de calibração é usada, como criá-la e como usá-la para calcular as concentrações de amostras.

Como sempre, obrigado por assistir!