Identificação de roedores I

A identificação adequada de animais de laboratório é um requisito fundamental da pesquisa biomédica. É essencial que os investigadores sejam capazes de distinguir entre animais individuais para que o animal correto seja usado para procedimentos experimentais e coleta de dados. Os cientistas desenvolveram vários métodos permanentes e temporários para identificar animais de laboratório individuais. Aqui, vamos discutir os dois métodos mais comumente usados: marcação de orelha e perfuração de orelha.

Antes de nos aprofundarmos no procedimento de perfuração da orelha, vamos apresentar o código do punção da orelha, os tipos de punções disponíveis e discutir os benefícios e desvantagens desse método. Como você deve ter adivinhado, perfurar a orelha envolve fazer um buraco ou um entalhe na orelha externa ou no pavilhão auricular do animal. Para padronizar esse método, foram desenvolvidos códigos universais de punção de orelha.

Dependendo da posição, os entalhes na orelha direita representam um dígito, como 1, 3 e 5, e um entalhe duplo representa 2. Usando diferentes combinações desses entalhes e somando o valor de cada entalhe, você pode rotular o animal de 1 a 9. Da mesma forma, na orelha esquerda, os mesmos entalhes representam as dezenas. E, novamente, diferentes combinações cobrirão o intervalo de 10 a 90. Os orifícios no centro do pavilhão auricular direito e esquerdo representam 100 e 200, respectivamente. E os buracos em ambos indicam 300. Portanto, por exemplo, se você quiser rotular o animal como 173, você deve fazer um furo no centro da orelha direita para 100, três entalhes no ano esquerdo somando o total para 70 e um único entalhe na orelha superior direita representando o lugar da unidade "três".

Agora, vamos discutir os três estilos de punções de orelha disponíveis comercialmente: o punção de tesoura, o punção de polegar e o punção de alavanca. Cada um deles tem suas vantagens e desvantagens.

O soco do polegar requer um movimento de pinça, mas é pequeno o suficiente para caber em um tubo Eppendorf para que o tecido da orelha possa ser coletado com mais facilidade. Ergonomicamente, o punção de alavanca é mais fácil de usar do que o punção de polegar, especialmente para as orelhas mais grossas dos ratos mais velhos. O punção em tesoura não requer um movimento de pinça, evitando assim a fadiga e lesões do túnel do carpo.

Apesar de ser um método rápido e simples de identificação, a perfuração na orelha tem algumas limitações. Primeiro, o código de punção de orelha discutido acima tem um limite superior de 399, o que pode limitar o uso desse método em alguns estudos de grande escala. Outra limitação é que a maioria dos animais deve ser agarrada na nuca para ler o código, aumentando assim as vezes que são manuseados. À medida que os ratos envelhecem, a pele de suas orelhas engrossa e é difícil dar um soco na orelha sem causar sofrimento significativo ao animal. Portanto, é melhor realizar os socos na orelha em ratos jovens à medida que são desmamados. Para ratos adultos que requerem identificação, o uso de anestesia inalante deve ser considerado ao realizar socos na orelha.

Agora que você tem algumas informações básicas sobre o código do perfurador de orelha e os tipos de ferramentas disponíveis, vamos aprender como executar essa técnica em mouses.

Antes de iniciar o procedimento, recomenda-se que as ferramentas de puncionamento sejam limpas com uma solução desinfetante,enxaguado com álcool e bem seco. Evite autoclavar os punções de ouvido, pois isso acabará por embotá-los.

Para começar, decida o código experimental do animal e o punção a ser usado. Vamos usar o código 173 e o punção de tesoura como exemplos aqui. O mesmo procedimento é aplicável a qualquer outro código ou punção. Quando estiver pronto, prenda o animal segurando-o pela nuca para que as orelhas fiquem facilmente acessíveis. Comece com o buraco para 100. Coloque a orelha direita no punção de forma que o orifício do punção fique posicionado longe da margem do pavilhão auricular. Em seguida, aplique pressão para fechar a tesoura com rapidez e firmeza para cortar a pele. Em seguida, solte o punção e remova-o da orelha. Evite puxar ou torcer o punção para evitar rasgar a orelha. Para fazer um entalhe, coloque o punção na borda do pavilhão auricular no local correto, neste caso na parte superior da orelha direita para os "três" no local da unidade do código, e faça o mesmo - aplique pressão rápida e firme e abra a tesoura para removê-lo. Repita o mesmo procedimento na outra orelha para perfurar três entalhes - dois para "20" perto do canto externo e um para "50" perto do canto interno, totalizando o código para "70".

Confirme se o código correto foi perfurado antes de adicionar o animal de volta à gaiola. Novamente, limpe o punção com um desinfetante, enxágue com álcool e seque-o bem para evitar ferrugem.

Agora, vamos passar para a marcação de orelhas, que é outro método barato e fácil de executar para a identificação individual de camundongos e ratos. Há uma variedade de brincos disponíveis comercialmente. Isso inclui: etiquetas de metal com uma série de números e/ou letras gravadas nelas e etiquetas de plástico com caracteres ou códigos de barras em fundos coloridos.

Uma desvantagem das etiquetas de metal é que muitas vezes é necessário pegar o animal para ler o código. Em contraste, as etiquetas de plástico são fáceis de ler sem ter que manusear os animais. Outra vantagem das etiquetas de plástico é sua compatibilidade com imagens de ressonância magnética. Embora as etiquetas forneçam um identificador individual para um camundongo ou rato, elas não são infalíveis. As marcas podem ser perdidas devido ao excesso de higiene, dermatite ou infecção, autotrauma infligido ao tentar remover as marcas devido à intolerância, luta e comportamento agressivo de reprodução. Se vários animais estiverem alojados na mesma gaiola, a perda de uma marca de orelha pode ser problemática. Para contornar esse problema, uma forma secundária de identificação, como um código de punção na orelha oposta à etiqueta, deve ser utilizada. Uma instalação deve padronizar a escolha da orelha a ser marcada e o código a ser usado na outra orelha, e todos os códigos devem ser indicados no cartão da gaiola.

Agora vamos aprender como aplicar corretamente uma marca de orelha, pois o posicionamento incorreto pode ter várias consequências infelizes. Após a aplicação, também discutiremos a remoção da marca auricular, que geralmente é realizada em caso de infecção devido à aplicação da marca.

O primeiro passo é selecionar uma etiqueta apropriada para os animais a serem identificados. Aqui, usaremos uma etiqueta de metal para demonstrar o procedimento em camundongos. Certifique-se de solicitar o aplicador apropriado para o tamanho e estilo específicos das marcas auriculares que estão sendo usadas. Remova cuidadosamente a etiqueta do suporte de papelão e oriente-a no aplicador de forma que a extremidade com o orifício fique posicionada sobre a área entalhada do aplicador. A extremidade pontiaguda da etiqueta deve estar oposta ao entalhe.

Quando estiver pronto para aplicar a marca auricular, prenda o animal para que as orelhas fiquem facilmente acessíveis. Os animais podem ter menos probabilidade de lutar se os membros posteriores puderem descansar em uma superfície como o topo da gaiola ou uma bancada. Uma vez que o animal esteja contido, posicione a ponta da marca auricular profundamente na concha da orelha de forma que os números das etiquetas fiquem voltados para as costas do animal. Em seguida, aperte firmemente o aplicador fechado; A etiqueta de orelha perfurará a orelha e travará junta. Quando você soltar, a orelha marcada cairá do aplicador. Confirme se a tag foi posicionada e aplicada corretamente. Se você preferir ter os números das marcas de orelha voltados para o nariz do animal, coloque a ponta da etiqueta na base do pavilhão auricular na parte de trás da orelha e aperte para travar a etiqueta no lugar.

As etiquetas devem ser colocadas de forma que não causem uma dobra na orelha, interfiram na mobilidade do animal ou fiquem presas em qualquer parte do enjaulamento. Se a etiqueta for colocada muito perto da borda da orelha, ela pode ser facilmente rasgada. Se posicionada muito perto da cabeça, a pele da área do pescoço pode ficar presa na etiqueta, criando irritação, dor e movimento restrito, o que pode levar ao autotrauma. Ocasionalmente, as etiquetas de metal podem causar irritação e inchaço da orelha. Isso geralmente leva a infecções do pavilhão auricular, e o tratamento imediato deve incluir a remoção da marca.

Para remover a etiqueta, umedeça um aplicador com ponta de algodão com uma solução anti-séptica e use-o para remover quaisquer detritos ao redor da etiqueta. Em casos graves de infecção, o animal pode precisar ser anestesiado. Em seguida, usando um alicate, corte a parte superior do laço da etiqueta de ponta a ponta. É importante ressaltar que não corte a superfície plana, pois isso comprimirá a etiqueta, prenderá a orelha e causará danos à orelha. Usando hemostáticos, guie suavemente a marca auricular através e para fora da orelha. Deslize a etiqueta para que a extremidade ondulada não passe, causando trauma e alargamento do orifício de perfuração. Assim que a etiqueta desaparecer, limpe a orelha com um aplicador de algodão embebido em anti-séptico e devolva o animal à gaiola. Se houver secreção purulenta do ouvido, pode ser necessário tratamento de acompanhamento e recomenda-se a consulta com a equipe veterinária para avaliação.

Agora que você sabe como marcar os animais de laboratório usando brincos e socos, vamos revisar alguns experimentos nos quais esses métodos podem ser úteis. Uma grande vantagem de usar o código de punção de orelha é que os punções podem funcionar como amostras de tecido para genotipagem, reduzindo assim o estresse para os animais causado devido ao manuseio repetido. No entanto, se você planeja usar os punções para coletar amostras de PCR, lembre-se de primeiro mergulhar o aparelho em uma solução descontaminante de superfície por pelo menos 3 minutos para remover o DNA ou RNA residual e, em seguida, enxaguar com álcool antes de usar.

A importância da técnica de identificação aumenta ainda mais se o experimento durar vários dias. Por exemplo, neste experimento, os cientistas primeiro rotularam os animais usando uma etiqueta de metal e, em seguida, injetaram no nervo ciático uma suspensão de células tumorais transgênicas expressando a proteína luciferase. Em seguida, para quantificar a progressão do câncer, eles fotografaram os animais usando bioluminescência um, dez e dezoito dias após a injeção.

Você acabou de assistir à apresentação de JoVE demonstrando os dois métodos comumente usados de identificação em roedores: marcas de orelha e punções de orelha. Agora você deve entender o código do perfurador da orelha, conhecer os diferentes tipos de brincos de roedores disponíveis comercialmente e deve ser capaz de realizar esses procedimentos com precisão sem causar desconforto significativo aos animais.

Lembre-se, cada técnica tem suas vantagens e desvantagens, que devem ser consideradas em relação às suas necessidades experimentais. Além de considerar o custo, a facilidade da técnica e o nível de dor para os animais devem ser algumas das principais considerações ao escolher o método de identificação adequado. Como sempre, obrigado por assistir!