Normas Internas

1. Manuseio adequado da amostra: Fazer uma solução

1. Leve um béquer limpo e massa a quantidade correta de amostra nele. Grave a massa real usada. Neste exemplo, uma solução de adenina é feita em um frasco volumoso para uso como padrão interno para a próxima análise. A massa de adenina é de 100 mgs. Não entre diretamente em um frasco volumoso porque tem um pescoço longo e a adenina não pode ser facilmente adicionada ou removida.
2. Adicione cerca de 25 mL de solvente (neste caso, sulfóxido de dimetil (DMSO)) ao béquer e deixe-o mexer para dissolver. Neste exemplo, a solução final é feita em um frasco volumoso de 50 mL, por isso adicione apenas cerca de 25 mL para que o béquer possa ser enxaguado e a solução feita até o volume final.
3. Uma vez que o sólido tenha dissolvido, despeje a solução no frasco volumoso.
4. Enxágüe o béquer e a barra de mexida com pequenas quantidades de solvente, cerca de 10 mL, e despeje a enxágue no frasco volumoso. Repita mais duas vezes. Isso ajuda a garantir a transferência adequada da solução.

2. Preparação de uma curva de calibração padrão interna

1. Prepare as amostras padrão desejadas para análise de cromatografia a gás. Neste exemplo, a cafeína é extraída do café usando acetonitrilo e, em seguida, a adenina é usada como um padrão interno para medição.
2. Para as amostras de cafeína, pese a quantidade de amostra necessária para fazer 1 mg/mL de amostra. Se usar um frasco volumoso de 10 mL, são 10 mgs.
3. Pesar o analito em um béquer, adicionar alguns mL de solvente (aqui metanol) para dissolver e, em seguida, transferir quantitativamente para o frasco volumoso usando 3 enxágues.
4. Faça mais 3 padrões de forma semelhante com 0,2, 0,5 e 2 mg/mL de cafeína.
5. Coloque 1 mL de cada padrão de cafeína em um frasco de amostra.
6. Adicione 0,2 mL de padrão interno de adenina de 2 mg/mL a cada frasco de amostra.
7. Execute o experimento de cromatografia gasosa com cada padrão de cafeína. Para cada cromatograma, calcule a razão das áreas de pico para a cafeína versus o padrão.
8. Faça um gráfico da razão de área versus a razão de concentração. A inclinação desse enredo é o fator de resposta.

3. Preparação de uma amostra real com padrão interno para cromatografia gasosa

1. Prepare a amostra desejada para análise de cromatografia gasosa. Neste exemplo, a cafeína é extraída do café usando acetrontrila.
2. Para a amostra de café, massa 2 g de café em um béquer de 100 mL. Regisso o peso exato do café.
3. Adicione 20 mL de acetonitrila ao béquer.
4. Deixe descansar por 20 minutos, mexendo com frequência.
5. Filtre a borra de café usando um papel filtro em um funil.
6. Enxágüe o papel filtro 3x com pequenas quantidades de acetonitrilo (5 mL).
7. Meça o volume final do filtrado. Deve ser cerca de 35 mL.

4. Execute a amostra e calcule a concentração

1. Pegue 1 mL da amostra do extrato de café e adicione 0,2 mL do padrão interno em um frasco. Coloque o frasco no rack de amostrador automático.
2. Execute uma análise gc da amostra. Certifique-se de que as condições de GC são de tal forma que a cafeína e a adenina separem. Neste exemplo, as separações istermais são realizadas a 200 °C.
3. Após a análise, calcule a área de pico tanto para o pico padrão interno quanto para o pico de analito. Usando suas proporções, calcule a quantidade de cafeína na amostra.

5. Resultados: Análise gc da cafeína com padrão interno

1. A análise gc da cafeína é mostrada na Figura 1. Adenina é usada como padrão interno. A razão das áreas de pico pode ser medida e plotada versus a razão das concentrações. A inclinação da trama é o fator de resposta (neste caso 1,8).
2. A Figura 2 mostra um cromatograma de uma amostra de café com padrão interno de adenina. A proporção da área de pico é de 1,78. Utilizando o fator de resposta e a concentração conhecida de adenina (0,33 mg/mL), calcula-se a concentração de cafeína na amostra desconhecida de 0,33 mg/mL.

Figura 1. Gráfico de calibração usando um padrão interno. Um gráfico das razões de área versus razão de concentração para 3 amostras padrão de cafeína (1, 0,5 e 0,2 mg/mL) com 0,33 mg/mL padrão interno adicionado a cada um. A inclinação da linha é 1.8, que é o fator de resposta.

Figura 2. Cromograma de café com padrão interno de adenina. Um gráfico da resposta do detector fid para amostras. Os três principais picos são adenina (IS), cafeína e ácido palmítico.