3.2: Normas Internas

1. Manuseio adequado da amostra: Fazer uma solução

1. Leve um béquer limpo e massa a quantidade correta de amostra nele. Grave a massa real usada. Neste exemplo, uma solução de adenina é feita em um frasco volumoso para uso como padrão interno para a próxima análise. A massa de adenina é de 100 mgs. Não entre diretamente em um frasco volumoso porque tem um pescoço longo e a adenina não pode ser facilmente adicionada ou removida.
2. Adicione cerca de 25 mL de solvente (neste caso, sulfóxido de dimetil (DMSO)) ao béquer e deixe-o mexer para dissolver. Neste exemplo, a solução final é feita em um frasco volumoso de 50 mL, por isso adicione apenas cerca de 25 mL para que o béquer possa ser enxaguado e a solução feita até o volume final.
3. Uma vez que o sólido tenha dissolvido, despeje a solução no frasco volumoso.
4. Enxágüe o béquer e a barra de mexida com pequenas quantidades de solvente, cerca de 10 mL, e despeje a enxágue no frasco volumoso. Repita mais duas vezes. Isso ajuda a garantir a transferência adequada da solução.

2. Preparação de uma curva de calibração padrão interna

1. Prepare as amostras padrão desejadas para análise de cromatografia a gás. Neste exemplo, a cafeína é extraída do café usando acetonitrilo e, em seguida, a adenina é usada como um padrão interno para medição.
2. Para as amostras de cafeína, pese a quantidade de amostra necessária para fazer 1 mg/mL de amostra. Se usar um frasco volumoso de 10 mL, são 10 mgs.
3. Pesar o analito em um béquer, adicionar alguns mL de solvente (aqui metanol) para dissolver e, em seguida, transferir quantitativamente para o frasco volumoso usando 3 enxágues.
4. Faça mais 3 padrões de forma semelhante com 0,2, 0,5 e 2 mg/mL de cafeína.
5. Coloque 1 mL de cada padrão de cafeína em um frasco de amostra.
6. Adicione 0,2 mL de padrão interno de adenina de 2 mg/mL a cada frasco de amostra.
7. Execute o experimento de cromatografia gasosa com cada padrão de cafeína. Para cada cromatograma, calcule a razão das áreas de pico para a cafeína versus o padrão.
8. Faça um gráfico da razão de área versus a razão de concentração. A inclinação desse enredo é o fator de resposta.

3. Preparação de uma amostra real com padrão interno para cromatografia gasosa

1. Prepare a amostra desejada para análise de cromatografia gasosa. Neste exemplo, a cafeína é extraída do café usando acetrontrila.
2. Para a amostra de café, massa 2 g de café em um béquer de 100 mL. Regisso o peso exato do café.
3. Adicione 20 mL de acetonitrila ao béquer.
4. Deixe descansar por 20 minutos, mexendo com frequência.
5. Filtre a borra de café usando um papel filtro em um funil.
6. Enxágüe o papel filtro 3x com pequenas quantidades de acetonitrilo (5 mL).
7. Meça o volume final do filtrado. Deve ser cerca de 35 mL.

4. Execute a amostra e calcule a concentração

1. Pegue 1 mL da amostra do extrato de café e adicione 0,2 mL do padrão interno em um frasco. Coloque o frasco no rack de amostrador automático.
2. Execute uma análise gc da amostra. Certifique-se de que as condições de GC são de tal forma que a cafeína e a adenina separem. Neste exemplo, as separações istermais são realizadas a 200 °C.
3. Após a análise, calcule a área de pico tanto para o pico padrão interno quanto para o pico de analito. Usando suas proporções, calcule a quantidade de cafeína na amostra.

5. Resultados: Análise gc da cafeína com padrão interno

1. A análise gc da cafeína é mostrada na Figura 1. Adenina é usada como padrão interno. A razão das áreas de pico pode ser medida e plotada versus a razão das concentrações. A inclinação da trama é o fator de resposta (neste caso 1,8).
2. A Figura 2 mostra um cromatograma de uma amostra de café com padrão interno de adenina. A proporção da área de pico é de 1,78. Utilizando o fator de resposta e a concentração conhecida de adenina (0,33 mg/mL), calcula-se a concentração de cafeína na amostra desconhecida de 0,33 mg/mL.

Figura 1. Gráfico de calibração usando um padrão interno. Um gráfico das razões de área versus razão de concentração para 3 amostras padrão de cafeína (1, 0,5 e 0,2 mg/mL) com 0,33 mg/mL padrão interno adicionado a cada um. A inclinação da linha é 1.8, que é o fator de resposta.

Figura 2. Cromograma de café com padrão interno de adenina. Um gráfico da resposta do detector fid para amostras. Os três principais picos são adenina (IS), cafeína e ácido palmítico.

A perda de amostra pode ocorrer toda vez que uma amostra é manuseada ou transferida, dificultando cálculos precisos de concentração.

Para garantir a precisão, os efeitos da perda de amostra devem ser minimizados usando uma preparação cuidadosa da amostra e limitando o número de etapas de manuseio e transferência de amostras. No entanto, a perda amostral também pode ocorrer devido a erros sistemáticos, como manipulação incompleta da amostra, efeitos matriciais e variações no procedimento analítico.

Essas fontes de perda podem ser explicadas pela adição de uma concentração conhecida de uma espécie semelhante, mas não idêntica, ao composto de interesse. Isso é chamado de padrão interno. Quaisquer perdas de amostra que ocorram no padrão interno devem ser semelhantes para o analito, permitindo que a concentração seja calculada com precisão.

Este vídeo ilustrará o uso de um padrão interno e técnica de laboratório adequada para contabilizar a perda de amostra ao determinar a concentração de um desconhecido.

Um padrão interno é uma substância adicionada em uma quantidade conhecida a padrões, amostras e brancos durante uma análise.

Em cromatografia e espectroscopia, a proporção do sinal para o padrão interno e o analito é calculada. Essa proporção, chamada de fator de resposta, é proporcional à razão entre o analito e as concentrações padrão.

O factor de resposta, R, pode ser expresso pela seguinte equação, em que A representa os sinais analíticos da amostra e do padrão interno e C representa as concentrações da amostra e do padrão interno.

Um padrão interno pode compensar erros sistemáticos e aleatórios. Por exemplo, erros aleatórios - como inconsistências ao medir uma amostra - serão os mesmos para o padrão interno e o analito. Portanto, a proporção de seus sinais não mudará.

Para erros sistemáticos, como efeitos de matriz em solução, a razão não será afetada desde que o efeito de matriz seja igual para o padrão e o analito.

Embora os padrões internos ofereçam grandes benefícios, pode ser difícil escolher um que seja adequado. Um padrão interno deve ter um sinal semelhante, mas não idêntico, ao do analito. Também não pode afetar a medição do analito de forma alguma.

Finalmente, a concentração deve ser bem conhecida. Isso é conseguido garantindo que o padrão interno não esteja nativamente presente na amostra; assim, a única fonte dele em solução é a concentração conhecida adicionada.

No experimento a seguir, a concentração de cafeína em uma amostra desconhecida será determinada por cromatografia gasosa.

Isso é obtido criando uma curva de calibração usando soluções de cafeína conhecidas, com adenina como padrão interno. A inclinação da curva de calibração é igual ao fator de resposta.

Uma vez que o fator de resposta é conhecido, a concentração do desconhecido pode ser calculada a partir da proporção da área do cromatograma medida.

Agora que você entende os fundamentos das normas internas, vamos dar uma olhada no procedimento.

Para iniciar o procedimento, pesar com precisão 100 mg do padrão interno, adenina, em um béquer limpo.

Em seguida, dissolva-o em cerca de 20 mL de dimetilsulfóxido e misture a solução.

Uma vez dissolvida a adenina, despeje a solução em um balão volumétrico de 50 mL.

Lave o copo e mexa com 10 mL de DMSO e despeje o enxágue no balão. Repita este enxágue duas vezes, para garantir a transferência adequada da solução. Encha até a marca de calibração, resultando em um padrão interno com uma concentração de 2 mg/mL.

Em seguida, pesar 100 mg de cafeína em um copo para preparar uma solução estoque. Dissolva a cafeína com uma pequena quantidade de metanol. Em seguida, utilizar 3 enxaguamentos para transferir esta solução para um balão volumétrico novo de 25 ml. Esta é a solução-mãe de 4 mg/ml. Use-o para criar 3 padrões de cafeína.

Em seguida, adicione 0,2 mL do padrão interno, adenina, a cada frasco. Encha cada um até o volume final com metanol. Transfira cada solução para um frasco de amostra.

Execute cada padrão de cafeína através de um cromatógrafo gasoso. Calcule a proporção de áreas de pico para a cafeína versus o padrão de adenina.

Primeiro, pesar 2 g de café em um copo de 100 mL e registrar o peso.

Em seguida, adicione 20 mL de metanol para extrair a cafeína do café. Deixe a solução mexer por 20 min.

Usando um funil B?chner, filtre a borra de café. Lave o béquer com uma pequena quantidade de metanol e despeje esse enxágue no funil. Repita o enxágue duas vezes.

Medir o volume final do filtrado; deve ser de aproximadamente 35 mL.

Para preparar a amostra para análise, adicione 1 mL do extrato de café a um frasco de amostra. Em seguida, adicione 0,2 mL do padrão interno de adenina e coloque o frasco no suporte do amostrador automático do instrumento.

Execute uma análise de cromatografia gasosa da amostra, garantindo que as condições sejam tais que a cafeína e a adenina estejam separadas.

Depois de concluir a análise, calcule a área do pico para o padrão interno e o analito.

Uma vez analisadas todas as amostras, pode determinar-se a curva de calibração padrão para as soluções de cafeína/adenina, traçando graficamente as relações entre as áreas dos picos e as razões das concentrações. A inclinação dessa linha, que representa o fator de resposta, foi de 1,8.

Em seguida, os dados de GC da amostra de café extraída são analisados. A proporção das áreas de pico foi calculada em 1,78. Usando o fator de resposta e a concentração conhecida do padrão interno, adenina, a concentração de cafeína na amostra desconhecida foi calculada em 0,33 mg / mL.

Muitos tipos diferentes de reações, em vários discípulos científicos, utilizam padrões internos para minimizar os efeitos de erros e perda de amostra.

Os efeitos da perda de amostra encontrados durante a preparação da amostra podem ser minimizados usando padrões internos, mantendo sua taxa de concentração quase constante.

Neste exemplo, lipídios bioativos foram extraídos de células lisadas usando um processo de extração líquido-líquido. Padrões internos de isótopos estáveis foram adicionados no início da extração para contabilizar erros durante a preparação da amostra.

Os padrões internos não foram apenas críticos para a preparação dos lipídios bioativos, mas também para a análise. Os lipídios foram separados por cromatografia líquida de alta eficiência e analisados por espectrometria de massas.

Na espectroscopia, os padrões internos podem ajudar a corrigir erros aleatórios devido a mudanças na intensidade da fonte de luz. Se uma lâmpada ou outra fonte de luz tiver potência variável, isso afetará a absorção e, consequentemente, a emissão de uma amostra. No entanto, a proporção de um padrão interno para o analito permanecerá constante, mesmo que a fonte de luz não o faça.

Na cromatografia, uma das maiores fontes de erro é a injeção. Os amostradores automáticos ajudam a minimizar isso, mas o erro ainda pode ser de 1 a 2% de desvio padrão relativo.

Neste exemplo, os padrões de vapor contendo um padrão interno foram analisados usando cromatografia gasosa para estabelecer uma curva de calibração. Uma vez concluído, a amostra desconhecida pôde ser medida e as perdas devido à volatilidade da amostra contabilizadas.

Você acabou de assistir à introdução da JoVE aos padrões internos. Agora você deve entender as práticas recomendadas para minimizar a perda de amostras, padrões internos e fatores de resposta.

Obrigado por assistir!