Name: Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a isolar células hematopoéticas primárias da medula óssea de camundongos e a transfectá-las por eletroporação com eficiência de 30%. Este método permite diferenciar mastócitos e basófilos para estudos de função gênica em imunologia.

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A colheita de medula óssea de fêmures e tíbias <ol><li> O primeiro passo do procedimento é a colheita de medula óssea de fêmures e tíbias o de um 6 - a 12 semanas de mouse antigo (que estamos usando camundongos BALB / c, mas você pode fazer este procedimento com qualquer tensão mouse). Para começar, euthanize o mouse por inalação de CO 2 (não irá ser exibido). Fêmur e tíbia colheita das pernas traseiras de cada um. Então, com uma lâmina de barbear, cortar cada extremidade do fémur para remover o quadril e joelho e para expor a medula. </li><li> De forma semelhante, corte cada extremidade da tíbia para remover o joelho eo tornozelo regiões adjacentes e para expor a medula. </li><li> Pegue uma seringa de 3 mL com uma agulha de calibre 26 e preenchê-lo com RPMI suplementado com SFB 10%, penicilina, estreptomicina e beta-mercaptoetanol (BME = 100 uM). Usando uma pinça, segure o osso por uma placa de Petri contendo RPMI mídia. Inserir a agulha da seringa em uma das extremidades do osso e pressionar o êmbolo para expulsar da medula óssea. A agulha da seringa pode ser movida para cima e para baixo dentro do osso para expulsar medula residual. </li><li> Repita o procedimento para todos os ossos, e então proceder com o estabelecimento das culturas. </li></ol> Estabelecer culturas <ol><li> Para estabelecer as culturas de medula óssea, pipetar a medula óssea vermelha para cima e para baixo várias vezes para quebrar o tecido em uma suspensão de células. </li><li> Colocar um filtro de 70 micron em cima de um tubo cônico de 50 mL, e adicione a suspensão de células para o filtro. </li><li> Lavar a placa de Petri uma vez com RPMI, em seguida, adicione a água para o filtro 70 mícron. </li><li> Usando o final de borracha de uma seringa de 1 mL êmbolo, moer os pedaços restantes de medula óssea na parte superior do filtro micron 70. </li><li> Lavar o filtro com um tempo RPMI. </li><li> Depois de lavar o filtro, centrifugar a suspensão celular a 1200 rpm por 5 minutos. </li><li> Lave o pellet celular pela ressuspensão em PBS. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro. Normalmente, obter a 90 milhões de células de ossos um rato (dois fêmures e duas tíbias). Após a contagem das células, centrifugar novamente a 1200 rpm por 5 minutos. </li><li> Ressuspender as células em uma pequena quantidade de RPMI e alíquota-los em frascos de cultura de tecidos contendo RPMI suficiente para que a concentração final é de 1 milhão de células por ml. </li><li> Adicionar citocinas para promover o desenvolvimento do seu tipo de célula de interesse. Neste caso, a citocina interleucina-3 (IL-3 = 10 ng / mL) é adicionado para promover o desenvolvimento de basófilos e mastócitos. Para adquirir basófilos, incubar por 10 dias. Para mastócitos, incubar por 5 semanas. Ao gerar mastócitos, a mídia e IL-3 deve ser trocada uma vez por semana. </li><li> Aqui está uma olhada em como mastócitos deve aparecer apenas após o plaqueamento. Esta imagem demonstra a diferenciação de células da medula mastro em basófilos e mastócitos 10 dias após a adição de interleucina-3. </li><li> Uma vez que o tipo de célula desejada é obtida, prossiga com o passo eletroporação. </li></ol> Células Electroporating <ol><li> Para começar a etapa de eletroporação, determinar o número de células no frasco de cultura. </li><li> As células são tipicamente electroporated a uma densidade de 10 milhões por mL, então transferir o número de células necessárias para tubos cônicos e centrifugar os tubos a 1200 rpm por 5 minutos. </li><li> Após a centrifugação, aspirar a mídia, lavar as células com PBS 1X, e centrifugar novamente a 1200 rpm por 5 minutos. </li><li> Aspirar o PBS e adicionar Bio-Rad Gene tampão de eletroporação Pulser para fazer uma suspensão de células de 10 milhões de células por mL. </li><li> Depois de ressuspender as células, adicionar o DNA desejado plasmídeo em uma concentração final de 10 a 20 microgramas por mL. </li><li> Alíquota de 150 microlitros da suspensão de células em poços de sua escolha em uma placa de eletroporação de 96 poços. </li><li> Coloque a placa na câmara de eletroporação placa MXcell e feche a tampa. </li><li> Antes de transfecção de mastócitos, um protocolo de eletroporação deve ser programado no MXcell menos usando um protocolo preestabelecido ou armazenados. Através de experimentos de otimização descobrimos que a mais alta eficiência de transfecção de mastócitos ocorrem usando protocolos de pulso de onda quadrada. Vamos alterar as condições de eletroporação na placa para entregar 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms, e pulsos de onda quadrada na 350V/10ms 2000uF e 1000 ohms. Uma vez que o protocolo foi definido e carregado para o dispositivo, pressione &quot;Pulse&quot; para electroporate as células. </li><li> Depois de eletroporação é completo, a transferência das células para uma placa de cultura de tecidos. Normalmente, a transferência de cada amostra de 150 microlitros eletroporação a um poço em uma placa de cultura de 48 poços contendo 300 microlitros tecido RPMI (suplementado com 10% FCS, penicilina, estreptomicina e beta-mercaptoetanol) com 10 nanogramas por ml de interleucina-3. As células são incubadas overnight a 37 ° C, em seguida, analisadas 24 horas depois de expressão e supressão. </li></ol> TranResultados sfection A imagem de microscopia fluorescente das células após a eletroporação bem sucedido usando 20 microgramas por mL GFP plasmídeo é mostrado no vídeo. Usando o eletroporação MXcell a eficácia do sistema de transfecção de cerca de 30% pode ser obtida. O sistema permite variar as condições para maximizar a eficiência de transfecção, mantendo a viabilidade das células.

À medida que mais informação genômica emerge e novas ferramentas, como siRNA são desenvolvidos, o uso de células fisiologicamente relevante se tornar cada vez mais importante para promover nossa compreensão das vias de doença, interações proteína-proteína, e transdução de sinal. As células primárias são obtidas diretamente a partir de tecidos ou fluidos e cultivadas in vitro. Estas células podem ser manipuladas em uma série de maneiras, incluindo através da introdução de material genético exógeno. É cada vez mais evidente que a maneira mais eficaz para introduzir DNA plasmídeo ou siRNA em células primário é eletroporação. Eletroporação expõe as células a pulsos elétricos, a fim de aumentar a permeabilidade transitória da membrana celular, permitindo assim exógenos ácidos nucléicos para entrar na célula. Este método de transfecção pode ser otimizada para acomodar as diferenças entre os diferentes tipos de células / linhas e, portanto, pode ser usado para transfecção mastócitos, bem como de qualquer outro osso de células derivadas da medula. Além disso, ao contrário viral mediada transfecção, eletroporação não impõe limites no tamanho do DNA transfectado, nem requerem uma preparação extensiva. Em contraste com lipídica mediada por transfecção, eletroporação pode ser menos tóxico e não resultar em aprisionamento endossomal do ácido nucléico transfectadas. Bio-Rad foi desenvolvido o sistema de eletroporação MXcell especificamente para estas células. o MXcell permite variar as condições para maximizar sua eficiência de transfecção e viabilidade celular. A fim de otimizar a eficiência de transfecção e minimizar a morte celular, uma multiplicidade de parâmetros eletroporação incluindo tensão, capacitância, resistência e comprimento do pulso pode ser ajustada e avaliados.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Eletroporação Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para eletroporação

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

É cada vez mais evidente que eletroporação é a forma mais eficaz para introduzir DNA plasmídeo ou siRNA em células primárias. O Gene Pulser sistema de eletroporação MXcell e Gene tampão de eletroporação Pulser foram desenvolvidos especificamente para transfecção ácidos nucleicos em células de mamíferos e de difícil transfecção de células, tais como vídeo primário e cells.This-tronco demonstra como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos , e depois prepará-los para eletroporação no sistema MXcell. Começamos isolando fêmur e tíbia. Medula óssea de ambos os fêmur ea tíbia são, então, colhidas e culturas são estabelecidas. Células da medula óssea cultivadas são, então, transfectadas e analisados.

Este procedimento descreve como estabelecer culturas primárias de células hematopoiéticas da medula óssea de camundongos e é seguido por transfecção usando o Gene Pulser sistema de eletroporação MXCell.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

Tornou-se cada vez mais evidente que a electroporação é a maneira mais eficaz de introduzir DNA plasmidial ou siRNA em células primárias. O Gene Pulser...

Este procedimento começa com a coleta de fêmures e tíbias de camundongo. Após a remoção das articulações do quadril, joelho e tornozelo, a medula é isolada mediante injeção de meio RPMI na extremidade aberta do osso. Após obter uma suspensão de células simples, as células da medula óssea são diferenciadas em mastócitos, carregadas em placas de eletroporação de 96 poços e, em seguida, transfectadas.Utilizando o sistema de eletroporação de células gene pulse ou MX. Usando protocolos de pulsos de onda quadrada, podem ser obtidas eficiências de transfeção de cerca de 30%. O primeiro passo do procedimento é coletar a medula óssea do fêmur e da tíbia de um camundongo com idade entre seis e doze semanas.Para iniciar, eutanizar o camundongo por inalação de CO2, coletar o fêmur e o olho da tíbia das patas traseiras de cada camundongo. Em seguida, com a lâmina de barbear, cortar cada extremidade do fêmur para remover as articulações do quadril e do joelho e expor a medula de maneira semelhante. Cortar cada extremidade do olho da tíbia para remover as regiões adjacentes ao joelho e ao tornozelo e expor a medula.Em seguida, pegue uma seringa com agulha de calibre 26 e meio e adicione RPMI suplementado com 10% de FBS, penicilina, estreptomicina, beamer, etanol capita e L-glutamina. Usando pinças, segure o osso sobre uma placa de Petri contendo meio RPMI. Insira a agulha da seringa em uma das extremidades do osso e pressione o êmbolo para lavar e remover a medula óssea.A agulha da seringa pode ser movida para cima e para baixo dentro do osso para lavar a medula residual. Repita o procedimento para todos os ossos e, em seguida, prossiga com o estabelecimento das culturas. Para estabelecer as culturas de medula óssea, pipete a medula óssea lavada para cima e para baixo várias vezes para dissociar o tecido em uma suspensão celular.Em seguida, coloque um filtro de 70 micrômetros sobre um tubo cônico de 50 mililitros e adicione a suspensão celular ao filtro. Depois, enxágue a placa de Petri uma vez com RPMI. Em seguida, adicione o enxágue ao filtro de 70 micrômetros, utilizando a extremidade de borracha do êmbolo de uma seringa de um mililitro para moer os fragmentos de medula óssea que permanecerem sobre o filtro de 70 micrômetros.Lave o filtro uma vez com RPMI após a lavagem do filtro. Centrifugue a suspensão celular a 1200 RPM durante cinco minutos. Lave o pellet celular ressuspendendo-o em PBS.Conte as células utilizando um hemocitômetro. Normalmente, obtemos aproximadamente 90 milhões de células dos ossos de um camundongo, dois fêmures mais duas tíbias. Após a contagem das células, centrifugue-as novamente a 1200 RPM por cinco minutos.Resuspenda as células em uma pequena quantidade de RPMI e distribua-as em frascos de cultura de tecidos, contendo RPMI suficiente para que a concentração final seja de 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, adicione citocinas para promover o desenvolvimento do tipo celular de interesse. Neste caso, a citocina interleucina-3 é adicionada para promover o desenvolvimento de basófilos e mastócitos; para obter basófilos, incube por 10 dias; para mastócitos, incube por cinco semanas ao gerar mastócitos.O meio e a IL-3 devem ser trocados uma vez por semana. Veja a seguir como as células da medula óssea devem aparecer logo após o plaqueamento. Esta imagem demonstra a diferenciação das células da medula óssea em basófilos e mastócitos 10 dias após a adição da interleucina-3.Uma vez obtido o tipo celular desejado, prossiga com a etapa de eletroporação. Para iniciar a etapa de eletroporação, determine o número de células na cultura. As células de frasco são tipicamente eletroporadas numa densidade de 10 milhões por mililitro.Transfira o número necessário de células para tubos cônicos e centrifugue os tubos a 1200 RPM durante cinco minutos. Após a centrifugação, aspire o meio, lave as células com um XPBS e centrifugue novamente a 1200 RPM durante cinco minutos. Em seguida, aspire o PBS e adicione o tampão de eletroporação BioRad Gene Pulser para obter uma suspensão celular de 10 milhões de células por mililitro.Após ressuspender as células, adicione o DNA plasmidial desejado numa concentração final de 10 a 20 microgramas por mililitro. Misture suavemente a solução celular e transfira 150 microlitros da suspensão celular para os poços de sua escolha em uma placa de eletroporação de 96 poços. Em seguida, coloque a placa de eletroporação na câmara da placa MXL e feche a tampa antes da transfeção das células da medula óssea e da eletroporação.O protocolo deve ser programado no MXL, a menos que se utilize um protocolo predefinido ou armazenado. Por meio de experimentos de otimização, descobrimos que as maiores eficiências de transfeção de células da medula óssea ocorrem com protocolos de pulsos quadrados. Vamos variar as condições de eletroporação na placa para aplicar pulsos quadrados de 2000 microfases em mil ohms. Uma vez que o protocolo tenha sido configurado e carregado no aparelho, pressione pulsar para tratar as células; após a eletroporação estar concluída, transfira as células para uma placa de cultura de tecidos.Normalmente, transferimos cada amostra de eletroporação de 150 microlitros para um poço de uma placa de cultura de tecidos de 48 poços contendo 300 microlitros de RPMI com 10 nanogramas por mililitro. As células de interleucina três são incubadas durante a noite a 37 graus Celsius e, em seguida, analisadas 24 horas depois quanto à expressão e supressão. Esta é uma imagem de microscopia fluorescente das células.Após eletroporação bem-sucedida utilizando plasmídeo GFP a 20 microgramas por mililitro, com o sistema de eletroporação de células MX, podem ser obtidas eficiências de transfeção de cerca de 30%. O sistema permite variar as condições para maximizar a eficiência de transfeção mantendo a viabilidade celular. O sistema de células MX é especialmente útil para células mamíferas primárias, como essas células hematopoiéticas de camundongo.Acabamos de mostrar como isolar células da medula óssea de camundongos e transfectar mastócitos diferenciados utilizando o sistema de eletroporação de células MX. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

the-preparation-primary-hematopoietic-cell-cultures-from-murine-bone

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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