Cromatografia de troca iônica

1. Preparando a Amostra e a Coluna

1. Nesta demonstração, uma mistura de 2 proteínas será separada em uma coluna de troca de cáation: hemoglobina e citocromo C. Adicione 0,2 mL tampão de equilíbrio (pH 8.1) à amostra de proteína e vórtice para misturar completamente. Centrifuga por 2 minutos para remover qualquer espuma.
2. Coloque a coluna de troca de cation em um tubo de ensaio por 5 minutos para permitir que a resina se instale. Aperte o tubo de ensaio com a coluna em um suporte de anel para ter certeza de que está ereto.
3. Abra a tampa superior da coluna e, em seguida, a tampa inferior. Deixe o buffer na coluna escorrer sob gravidade para o tubo de ensaio.
4. Lave a coluna duas vezes com um volume de coluna (neste caso, o volume da coluna é de 0,3 mL) de tampão de equilíbrio. Deixe que o primeiro volume de coluna (0,3 mL) do tampão de equilíbrio escorra no frasco de resíduos antes de adicionar o segundo volume de coluna. Esta etapa permite que a coluna equilibre com o buffer de equilíbrio. Adicione o tampão de equilíbrio lentamente nesta etapa para não perturbar a resina.

2. Executando uma amostra de proteína através de uma coluna de troca de cation

1. Coloque a coluna em um tubo de centrífugas de 2 mL rotulado como "Unbound 1". Carregue cuidadosamente 0,1 mL da amostra de proteína na parte superior da coluna.
2. Uma vez que a amostra tenha sido carregada na parte superior da coluna, lave-a com 0,3 mL de tampão de equilíbrio adicionando o buffer na parte superior da coluna e permitindo que ela escorra por todo o caminho. Repita esta etapa 4x (para um total de 5 lavagens) e colete cada lavagem em um tubo de centrífuga separado de 2 mL. Rotule os tubos como "Unbound 1-5".
3. Para as últimas 2 lavagens, centrífuga por 10 s a 1.000 x g para garantir que todas as espécies desvinculas saiam da coluna. Qualquer amostra que se ligue à coluna não deve estar nestas lavagens, mas a amostra que não se ligar será lavada sem ser retida. A centrifugação fornece mais força para lavar materiais não vinculados da coluna.
4. Coloque a coluna em um novo tubo de coleção de centrífugas de 2 mL rotulado como "Bound 1". Coloque 0,3 mL de tampão de eluição (sal alto, pH 5,5) em cima da coluna. Centrifugar o eluente resultante para 10 s a 1.000 x g.
5. Repita a etapa de eluição mais 2 vezes colocando a coluna em um novo tubo de centrífuga, adicionando 0,3 mL e centrifugando para 10 s. Rotule estes "Bound 2 e 3".
6. Regisso regissão qualquer alteração de cor ou observações sobre as frações. A hemoglobina é uma proteína colorida que parece marrom-avermelhada, enquanto o citocromo C é de cor avermelhada.

3. Resultados: Cation-troca de Hemoglobina e Citocromo C

1. Cytochrome C tem um iPI de 10,5 e hemoglobina um iPI de 6,8. Assim, quando um tampão de equilíbrio pH 8.1 é usado, a hemoglobina não se liga à coluna porque é carregada negativamente. O Citocromo C é carregado positivamente neste pH e se liga à coluna porque o pH < pI.
2. A hemoglobina é observada nas frações não ligadas porque não está ligada à coluna.
3. O citocromo C é observado em frações vinculadas, porque estava ligado à coluna de troca de delitos.

Figura 1. Imagem de fração desvinculada (hemoglobina) e fração amarrada (citocromo C).