3.10: Cromatografia de troca iônica

1. Preparando a Amostra e a Coluna

1. Nesta demonstração, uma mistura de 2 proteínas será separada em uma coluna de troca de cáation: hemoglobina e citocromo C. Adicione 0,2 mL tampão de equilíbrio (pH 8.1) à amostra de proteína e vórtice para misturar completamente. Centrifuga por 2 minutos para remover qualquer espuma.
2. Coloque a coluna de troca de cation em um tubo de ensaio por 5 minutos para permitir que a resina se instale. Aperte o tubo de ensaio com a coluna em um suporte de anel para ter certeza de que está ereto.
3. Abra a tampa superior da coluna e, em seguida, a tampa inferior. Deixe o buffer na coluna escorrer sob gravidade para o tubo de ensaio.
4. Lave a coluna duas vezes com um volume de coluna (neste caso, o volume da coluna é de 0,3 mL) de tampão de equilíbrio. Deixe que o primeiro volume de coluna (0,3 mL) do tampão de equilíbrio escorra no frasco de resíduos antes de adicionar o segundo volume de coluna. Esta etapa permite que a coluna equilibre com o buffer de equilíbrio. Adicione o tampão de equilíbrio lentamente nesta etapa para não perturbar a resina.

2. Executando uma amostra de proteína através de uma coluna de troca de cation

1. Coloque a coluna em um tubo de centrífugas de 2 mL rotulado como "Unbound 1". Carregue cuidadosamente 0,1 mL da amostra de proteína na parte superior da coluna.
2. Uma vez que a amostra tenha sido carregada na parte superior da coluna, lave-a com 0,3 mL de tampão de equilíbrio adicionando o buffer na parte superior da coluna e permitindo que ela escorra por todo o caminho. Repita esta etapa 4x (para um total de 5 lavagens) e colete cada lavagem em um tubo de centrífuga separado de 2 mL. Rotule os tubos como "Unbound 1-5".
3. Para as últimas 2 lavagens, centrífuga por 10 s a 1.000 x g para garantir que todas as espécies desvinculas saiam da coluna. Qualquer amostra que se ligue à coluna não deve estar nestas lavagens, mas a amostra que não se ligar será lavada sem ser retida. A centrifugação fornece mais força para lavar materiais não vinculados da coluna.
4. Coloque a coluna em um novo tubo de coleção de centrífugas de 2 mL rotulado como "Bound 1". Coloque 0,3 mL de tampão de eluição (sal alto, pH 5,5) em cima da coluna. Centrifugar o eluente resultante para 10 s a 1.000 x g.
5. Repita a etapa de eluição mais 2 vezes colocando a coluna em um novo tubo de centrífuga, adicionando 0,3 mL e centrifugando para 10 s. Rotule estes "Bound 2 e 3".
6. Regisso regissão qualquer alteração de cor ou observações sobre as frações. A hemoglobina é uma proteína colorida que parece marrom-avermelhada, enquanto o citocromo C é de cor avermelhada.

3. Resultados: Cation-troca de Hemoglobina e Citocromo C

1. Cytochrome C tem um iPI de 10,5 e hemoglobina um iPI de 6,8. Assim, quando um tampão de equilíbrio pH 8.1 é usado, a hemoglobina não se liga à coluna porque é carregada negativamente. O Citocromo C é carregado positivamente neste pH e se liga à coluna porque o pH < pI.
2. A hemoglobina é observada nas frações não ligadas porque não está ligada à coluna.
3. O citocromo C é observado em frações vinculadas, porque estava ligado à coluna de troca de delitos.

Figura 1. Imagem de fração desvinculada (hemoglobina) e fração amarrada (citocromo C).

A cromatografia de troca iônica é amplamente utilizada na separação e isolamento de compostos carregados, particularmente grandes biomoléculas.

Este tipo de cromatografia líquida usa uma coluna de grânulos de fase estacionária compactados, chamados resina. A técnica separa os analitos com base em sua afinidade com a resina carregada.

Existem dois tipos principais dessa técnica. Na cromatografia de troca catiônica, a resina carregada negativamente é usada para ligar analitos carregados positivamente. Da mesma forma, na troca de ânions, analitos carregados negativamente se ligam à resina carregada positivamente. Os compostos não ligados são lavados através da coluna e o analito pode então ser coletado em um recipiente separado.

Este vídeo apresentará os fundamentos da cromatografia de troca iônica e demonstrará a técnica separando uma mistura de proteínas em laboratório.

A fase estacionária é um componente chave para uma separação bem-sucedida. Resinas de troca catiônica fortes normalmente apresentam grupos funcionais ácidos fortes, como o ácido sulfônico. As resinas de troca catiônica fracas apresentam grupos fracos, como os ácidos carboxílicos.

Da mesma forma, as resinas de troca aniônica fortes utilizam bases fortes, como aminas quaternárias, enquanto as resinas de troca aniônica fracas usam aminas secundárias ou terciárias. A seleção da resina dependerá das propriedades da mistura de amostras e do analito de interesse.

Os tampões usados, chamados coletivamente de fase móvel, também são importantes para a separação, principalmente em termos de pH. Para proteínas, o pH é selecionado com base em seu ponto isoelétrico, ou pI. Em um pH igual ao pI da proteína, a proteína é neutra. Acima do pI, ele terá uma carga líquida negativa, enquanto abaixo do pI, terá uma carga líquida positiva. O pH do tampão deve ser selecionado para que a proteína seja adequadamente carregada e capaz de se ligar à fase estacionária.

A cromatografia de troca iônica é geralmente um processo de quatro etapas. Primeiro, uma coluna compactada contendo resina de troca aniônica ou catiônica é equilibrada usando tampão. Para colunas de troca aniônica, isso envolve a protonação da resina, garantindo que ela seja carregada positivamente.

Em seguida, o exemplo é carregado na coluna. O tampão deve ter baixa condutividade, pois as espécies carregadas podem competir com a amostra pelas interações com a resina. Compostos de carga oposta se ligam à resina. Moléculas que não são carregadas, ou carregam a mesma carga, permanecem não ligadas.

Na terceira etapa, a coluna é lavada com tampão adicional para remover os componentes não ligados da coluna, deixando o limite para trás.

Finalmente, a quarta etapa é a eluição do analito ligado. Isso é feito usando um gradiente de sal, onde a concentração de sal é aumentada gradualmente, ou usando um tampão de eluição de sal alto.

As moléculas que estão fracamente ligadas serão eluídas primeiro, pois o baixo teor de sal perturbará mais facilmente sua ligação iônica à resina. Os compostos que estão mais fortemente ligados eluirão com concentrações mais altas de sal.

Agora que os fundamentos da cromatografia de troca iônica foram delineados, vamos dar uma olhada em seu uso na separação de duas proteínas.

Primeiro, para preparar a mistura de proteínas para separação, adicione 0,2 mL de tampão de ligação e vórtice para misturar bem. Em seguida, centrifugue a mistura para remover qualquer espuma. Para preparar a coluna de troca catiônica, prenda-a verticalmente em um suporte de anel e deixe a resina assentar.

Abra a tampa superior da coluna e, em seguida, a inferior. Deixe o tampão escorrer sob a gravidade em um tubo abaixo.

Para preparar a coluna, equilibre-a carregando um volume de coluna de buffer, neste caso 0,3 mL. Deixe o tampão escorrer da coluna para um frasco de resíduos. Depois que um volume de coluna de buffer for encerrado, repita a etapa de equilíbrio.

Para executar o experimento, coloque um tubo de centrífuga de 2 mL rotulado como "Unbound 1" abaixo da coluna. Carregue cuidadosamente 0,1 mL da amostra de proteína no topo da coluna.

Uma vez que a amostra tenha sido carregada, lave com um volume de coluna de tampão e deixe-o fluir por todo o caminho. Repita para um total de 5 lavagens. Colete cada lavagem em seu próprio tubo, rotulado como "Unbound 1" a "5".? Nas últimas 2 lavagens, centrifugue a coluna por 10 s para garantir que todas as espécies não ligadas sejam lavadas da coluna. Coloque a coluna em um novo tubo de coleta de centrífuga de 2 mL e rotule-o como "Encadernado 1". Carregue 1 volume de coluna de tampão de eluição no topo da coluna. Centrifugar durante 10 s a 1.000 x g.

Repetir o passo de eluição mais 2 vezes para garantir a recolha da substância a analisar ligada. Rotule os tubos como "Bound 2" e "3".? Registre quaisquer alterações de cor ou observações sobre as frações.

Neste exemplo, a hemoglobina e o citocromo C foram separados. A hemoglobina tem um pI de 6,8, enquanto o citocromo C tem um pI de 10,5. No tampão de pH 8,1, a hemoglobina é carregada negativamente e não se liga à coluna. Por outro lado, o citocromo C é carregado positivamente em pH 8,1 e se liga à coluna.

A hemoglobina, uma proteína de cor acastanhada, foi encontrada nas frações não ligadas, enquanto o citocromo C, uma proteína de cor avermelhada, foi observado na fração ligada.

Existem muitas formas de cromatografia líquida, cada uma com diferentes habilidades para separar componentes de uma mistura.

Neste exemplo, a cromatografia em coluna foi usada para separar uma mistura de DNA de fita simples e dupla. A hidroxiapatita, ou HA, é uma forma cristalina de fosfato de cálcio comumente usada como fase estacionária devido aos seus íons de cálcio carregados positivamente. Nesse caso, a coluna HA era ideal para a separação do DNA, pois pode se ligar à estrutura carregada negativamente do DNA.

Outra forma de cromatografia em coluna frequentemente usada para separar proteínas é a cromatografia de afinidade de metal imobilizado, ou IMAC. No IMAC, a fase estacionária possui um ligante com um íon metálico, que se liga a uma marca de histidina na proteína de interesse.

Todos os outros componentes da mistura saem da coluna. A proteína é então eluída com uma solução de imidazol, que tem uma estrutura semelhante à histidina, e se liga mais fortemente ao íon metálico.

Uma aplicação comum da cromatografia em coluna é a cromatografia líquida de alta eficiência, ou HPLC. A HPLC é amplamente utilizada em química analítica para a identificação e separação de compostos biológicos e não biológicos em uma mistura.

A HPLC é semelhante à cromatografia em coluna demonstrada neste vídeo, exceto que é automatizada e operada em pressões muito altas. Isso permite o uso de grânulos de fase estacionária menores, com uma maior área de superfície para relação ao volume. Assim, são possíveis interações aprimoradas entre a fase estacionária e os componentes da fase móvel.

Você acabou de assistir à introdução da JoVE à cromatografia de troca iônica. Agora você deve entender os conceitos por trás disso, as 4 etapas envolvidas e algumas técnicas relacionadas.

Obrigado por assistir!