Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

Este vídeo demonstra os diferentes passos do ensaio para indução neural em embrião de galinha. Primeiro, o embrião hospedeiro é exposto em um novo cultivo; o embrião doador é exposto em solução salina e o nó de Hensen é marcado com um corante fluorescente. O nó de Hensen é então removido do embrião doador e transplantado para o embrião hospedeiro.

O embrião hospedeiro é cultivado por 24 horas, fixado e processado para foto-oxidação sob fluorescência fraca. Com dab. O embrião é processado para hibridização in situ com um marcador neural.

Olá, sou Delphine do Laboratório Fennell no Centro de Medicina Genômica e Ambiental da Universidade Texas A&M em Houston. Hoje vamos mostrar um procedimento para realizar ensaios de indução neural no embrião de face. Utilizamos este procedimento no laboratório para estudar os efeitos de medicamentos antiepilépticos sobre as propriedades indutoras neurais do nó de Hensen.

Então vamos começar. Para o ensaio de indução neural, os ovos precisam ser preparados. Esses ovos devem ser incubados deitados de lado em uma incubadora úmida por 13 horas até o estágio três mais de Hamburger e Hamilton ou HH três mais.

Em seguida, prepare o embrião hospedeiro utilizando o novo método de cultura, que já foi demonstrado anteriormente. Em JoVE, cubra a superfície do embrião hospedeiro com 200 microlitros de solução salina. Isso facilitará a posterior transferência e posicionamento do enxerto doador.

Por fim, cubra a montagem com uma placa de cultura Falcon de 35 milímetros invertida. Para expor o embrião doador, abra o ovo batendo na casca com uma pinça. Remova a parte superior da casca e descarte-a.

Remova a albúmina espessa com pinças e incline o saco vitelino com pinças grossas para que o embrião fique voltado para cima. Após a remoção da albúmina, use tesoura fina para cortar um quadrado do saco vitelino ao redor do embrião. Retire o embrião do vitelo com uma colher e coloque em uma placa contendo PBS.

Em seguida, use pinças para destacar o embrião doador do vitelo e da área lúcida. Uma vez destacado, transfira o embrião doador para uma placa com guarda SIL contendo PBS para rotular e transplantar o enxerto. Use um puxador de microeletrodos para puxar micropipetas de capilar de vidro de 50 microlitros sob o microscópio.

Corte a ponta da micropipeta usando pinças finas. Coloque a micropipeta em uma placa de Petri forrada com uma tira de massa de modelar. Em seguida, prepare a solução de corante, que será usada para marcar o enxerto antes do transplante.

Primeiro, prepare um estoque de corante a 0,5% em um mililitro de etanol absoluto. Esse estoque pode ser armazenado a menos 20 graus Celsius no escuro. Em seguida, em um bloco térmico ajustado a 45 graus Celsius, misture 10 microlitros do estoque de corante pré-aquecido a 90 microlitros de sacarose 0,3 molar. Essa temperatura é necessária para evitar a precipitação do corante e a formação de cristais insolúveis.

Gire brevemente a solução em uma mini centrifugadora SPECT por cinco a 10 segundos. A solução de DAI está agora pronta para uso; posicione o embrião doador com pinos para insetos fixados no fundo do recipiente com tampa, com o lado dorsal voltado para cima. Uma vez que o embrião estiver fixado, reencha a micropipeta com olho D aplicando pressão suave.

Usando um conjunto de tubo aspirador. Aplique um pequeno bolo de dai ao nó de Henson. Repita, certificando-se de que todo o nó de Henson esteja marcado em seguida.

Usando uma pipeta capilar micro ou uma faca microcirúrgica, corte o nó de Hensen; o lado dorsal do nó pode ser distinguido do lado ventral porque forma um sulco, enquanto o lado ventral do nó é plano. Se necessário, marque o lado dorsal do enxerto com pó de carmim. Isso garantirá que o enxerto seja posicionado com a orientação dorsal-ventral adequada.

Usando uma pipeta Gilson de 10 microlitros, transfira o enxerto para o embrião hospedeiro com uma pipeta microcapilar. Aproxime o enxerto da região da área lucida, região de limite opaco, ao nível do nó de Hensen do embrião hospedeiro. Em seguida, use uma pipeta microcapilar ou uma faca microcirúrgica para fazer uma pequena incisão de 80 a 100 micrômetros na área.

Limite opaco da área de Lucita ao nível do nó de Hensen do embrião hospedeiro. Utilizando uma pipeta microcapilar ou uma faca microcirúrgica, posicione o enxerto de modo que o lado ventral fique voltado para você e a extremidade posterior esteja paralela à região equivalente no embrião hospedeiro O. Uma vez posicionado, remova o salino do embrião hospedeiro, certificando-se de que o enxerto permaneça próximo ao local do hospedeiro, e processe o embrião hospedeiro para novo cultivo por 18 a 22 horas, conforme descrito em nossa submissão anterior.

Após 24 horas de cultivo, o embrião é retirado do incubador e fixado em um prato tipo charuto. O P-B-S-P-B-S é removido e substituído por paraformaldeído a 4%. Em seguida, o embrião é fixado por 24 horas.

Descarte o fixador em um recipiente apropriado para resíduos perigosos e adicione PBS à placa de fixação. Remova os alfinetes de inseto com pinça após os alfinetes terem sido retirados. Utilize uma pipeta Pasteur de ponta romba para transferir o embrião para um frasco de cintilação contendo PBS.

Lave o embrião duas vezes em PBS durante cinco minutos cada e uma vez em solução tampão para twist durante cinco minutos após a lavagem; transfira o embrião para uma lâmina de vidro com cavidade contendo 0,1 mililitros de tampão Tris. Substitua a solução de tampão Tris por 0,1 mililitro de solução de DAB. Descarte a ponta de einor no balde contendo solução de hipoclorito.

Para descontaminar o DAB, coloque uma lamínula sobre a lâmina de cavidade sob foco de fluorescência de isotiocianato de fluoresceína FEI. O objetivo do microscópio nas células doadora de enxerto aparecerá em vermelho fluorescente e exposto à fluorescência FEI até que todas as células vermelhas fluorescentes se tornem marrons. Isso ocorre porque o fluorocromo em pasta é fotoconvertido em cristais marrons insolúveis pela exposição ao comprimento de onda de excitação FEI.

4 88 nanômetros na presença de dab. Esse processo leva entre 20 minutos e duas horas. Após a conclusão da reação de foto-oxidação, remova a lamínula usando pinça fina.

Transfira o embrião para um frasco de cintilação de 20 mililitros contendo PBTW ou PBS com 0,1% de tween 20. Por fim, desative o DAB da lamínula, lâmina e cavidade de vidro. Deslize incubando uma solução de hipoclorito para processar o embrião para visualização.

Prossiga com a hibridização in situ, incubando o embrião apenas com a sonda marcada com DIG. Em seguida, inicie a fotografia e o corte conforme descrito no JoVE Video dois. A seguir, tem-se um exemplo de um ensaio de indução neural.

Inicialmente, o enxerto é posicionado na borda entre a área lucita e a área alpaca do embrião hospedeiro. Tanto os embriões doadores quanto os hospedeiros estão no estágio três mais. Após nove horas em cultura, o enxerto começa a se diferenciar e induzir o que parece ser uma cabeça em miniatura no estágio oito menos.

Após 24 horas em cultura, a indução neural está completa após a fixação. O embrião é processado para foto-oxidação. Inicialmente, células marcadas com corante do olho derivadas do doador são mostradas como tendo proliferado para formar um minúsculo Noor, visto aqui em vermelho.

Após a foto-oxidação, essas células apresentam-se marrons. Em seguida, o embrião é processado com hibridização in situ em montagem inteira para o marcador neural. O otx dois foi desenvolvido no laboratório da Dra. Bonelli.

O enxerto doador induz a expressão de OTX dois a partir do tecido derivado do hospedeiro. Acabamos de mostrar como realizar um ensaio de indução neural no embrião de bochecha. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de remover todo o fluido da região ao redor do enxerto após o transplante, utilizando uma pipeta.

Isso garantirá que o enxerto esteja firmemente posicionado e que não se desloque do embrião hospedeiro durante o cultivo. É isso. Obrigado. Boa sorte em seus experimentos.