5.2: Procedimentos de Cuidados Básicos

1. Manusear camundongos imunocompetuntes (convencionais)

Foi demonstrado que as doenças imunológicas dos camundongos são muito semelhantes às dos humanos. ² Como esses animais possuem capacidades imunológicas limitadas, procedimentos no manuseio e cuidado desses animais foram projetados para minimizar o risco de doenças infecciosas através do uso de controles de engenharia, equipamentos de proteção individual para a equipe de cuidados com animais e procedimentos operacionais padrão; estes mitigam a contaminação do caging e outros equipamentos com os quais os animais estão em contato.

1. Desempacotamento de contêineres de transporte: Receber animais de outras instituições ou vendedores de animais representa um risco para os animais já alojados dentro da instalação animal. Durante o trânsito, as caixas de transporte de animais podem entrar em contato com agentes patogênicos. Portanto, deve ser realizado um procedimento adequado ao desempacotar os contêineres de transporte.
   1. Os requisitos mínimos de Equipamentos de Proteção Individual (EPI) são luvas, jaleco limpo ou esfregões, máscara de partículas e óculos de segurança ao manusear os animais.
   2. Selecione a gaiola apropriada, incluindo a tampa da barra de arame e a parte superior da barreira. A gaiola deve ser mobiliada com materiais apropriados para cama e aninhamento. Todos os caging devem ser preparados e colocados na área receptora antes da chegada dos animais.
   3. Ao chegar, as caixas de transporte são colocadas em uma sala segura e controlada pela temperatura. Em seguida, examine o recipiente em busca de danos.
   4. Desinfete as superfícies externas do recipiente de transporte com um produto de dióxido de colina para destruir quaisquer patógenos nocivos. Certifique-se de que o desinfetante esteja em contato com a caixa de acordo com as recomendações do fabricante, geralmente de 15 a 30 minutos.
   5. Coloque o contêiner em uma Estação de Transferência de Animais (ATS). O ATS fornece fluxo de ar filtrado pelo HEPA dentro do capô que fornece proteção alérgena, criando uma barreira de ar de vácuo entre o usuário e a zona de trabalho. Isso garante uma exposição mínima ao material de cama animal/dander e gaiola. O ar unidirecional também protege os animais do ar da sala circundante, minimizando a chance de contaminação.
   6. Uma vez aberto o contêiner de transporte, avalie a saúde geral dos animais. Anote qualquer animal ferido ou doente.
   7. Coloque os animais nas gaiolas montadas nos tamanhos de grupo adequados. O agrupamento deve estar de acordo com as normas espaciais e o protocolo experimental ao qual serão atribuídos.
   8. Cubra a gaiola com a tampa da barra de arame. Fixar o divisor na tampa da barra de arame para criar duas áreas na tampa.
   9. Selecione a comida apropriada e coloque a comida em um lado da tampa da barra de arame. Deixe o segundo lado aberto para permitir uma melhor circulação de ar.
   10. A água será fornecida através de garrafas de água ou de um sistema de rega automática. Garrafas de água são usadas para camundongos recém-desmamados para garantir que eles sejam capazes de manter seus níveis de hidratação. Para o IVC com rega automática, carregue o tubo de rega antes de colocá-lo no rack.
   11. Coloque a gaiola em um rack. Se usar IVCs, verifique se a gaiola está totalmente presa no rack e se o tubo de sipper está preso ao sistema de rega.
2. Gaiola mudando ratos convencionais
   1. Gaiolas de animais são trocadas em um ATS. O ATS é desinfetado no final de cada sessão.
   2. Apenas uma gaiola pode ser aberta de cada vez.
   3. O caging preparado com os materiais apropriados de cama e ninho é trazido para a sala dos animais. Um pequeno número de gaiolas são colocadas no ATS.
   4. As gaiolas IVC com tubos internos de sipper devem ser carregadas para forçar a água no sípper para remover o espaço morto de ar no tubo de sipper. Se não estiverm devidamente carregados, os ratos podem não ser capazes de fornecer pressão suficiente sobre o tubo de sipper para remover o ar dele.
   5. Os requisitos mínimos de Equipamentos de Proteção Individual (EPI) são luvas, jaleco limpo ou esfregões, máscara de partículas e óculos de segurança ao manusear os animais.
   6. Uma gaiola de animais a serem trocados é colocada em uma nova gaiola, e depois no ATS.
   7. Os animais são transferidos à mão ou com o uso de fórceps acolchos. Luvas são trocadas entre gaiolas ou entre grupos de ratos. Luvas também podem ser desinfetadas com um produto químico nãotóxico entre as gaiolas.
   8. Foi demonstrado que transferir a área de aninhamento dos camundongos para uma gaiola limpa auxilia na transição para a gaiola limpa, especialmente para machos abrigados em grupo. Outros itens de enriquecimento também são transferidos para a nova gaiola.
   9. Uma vez que o topo da gaiola ou alimentador é colocado na nova gaiola, a comida é adicionada.
   10. A parte superior da barreira é colocada na nova gaiola e a gaiola é devolvida ao rack.
   11. As gaiolas IVC devem ser adequadamente encaixadas no rack para garantir que as válvulas de ar e água estejam engajadas.

2. Manipulação de camundongos imunocomprometidos

1. Desempacotamento de contêineres de transporte
   1. Animais imunocomprometidos devem ser descompactados em condições estéreis. Todos os indivíduos que manuseam camundongos deficientes imunológicos devem usar um vestido esterilizado a vapor, máscara, capô de cabelo e luvas estéreis. A técnica asséptica deve ser usada o tempo todo ao entregar esses animais.
   2. Todos os equipamentos e caging deveriam ter sido esterilizados por vapor, radiação UV ou quimicamente esterilizados com um molho de 70% de etanol por pelo menos 30 minutos Há duas opções para o ensilamento estéril: o caging padrão que foi embrulhado e o vapor esterilizado, ou o caging que é esterilizado normalmente através da irradiação pelo fornecedor. Estas gaiolas são de um uso, unidades descartáveis.
   3. Antes de manipular ratos sob o capô de fluxo laminar, o capô é pulverizado com 70% de etanol com o soprador operando. O soprador de capô deve permanecer sempre ligado para manter o ambiente estéril. Após cada uso, o capô é pulverizado com um desinfetante e limpo de todos os detritos e novamente pulverizado com 70% de etanol.
   4. Na melhor das condições, duas pessoas são necessárias para o recebimento adequado dos camundongos imunocomprometidos: uma para manusear os animais usando técnicas assépticas (o técnico estéril) e outra que manuseará itens contaminados (o técnico não estéril). A pessoa não-estérile ainda deve usar um vestido limpo, de mangas compridas; jaleco ou jaleco; máscara; capô; e luvas estéreis para evitar a contaminação do interior estéril caso precisem alcançar o capô.
   5. Prepare um capô de fluxo laminar como descrito anteriormente. É preferível ter um capuz dedicado a animais imunocomprometidos. Recomenda-se que o capô seja equipado com luzes de esterilização ultravioleta (UV) que podem ser usadas para esterilizar o interior do capô entre os usos. Um temporizador é utilizado para garantir que a superfície do capô tenha exposição adequada aos raios UV.
   6. O exterior de todos os suprimentos que são colocados no capô são pulverizados com 70% de álcool, incluindo a embalagem externa de alimentos, água e caging.
   7. Os contêineres de transporte são pulverizados com uma solução de dióxido de cloro antes de serem colocados no capô. Uma vez colocados no capô, eles devem permanecer abertos por 15-30 minutos.
   8. O manipulador de animais designado abre o alimento estéril e a água sob o capô.
   9. O técnico não-estérico abre a caixa de transporte sob o capô. Deve-se tomar cuidado com o técnico não-estérile para evitar o contato com as superfícies internas do capô e o interior da caixa de transporte.
   10. O tutor animal abre a gaiola estéril, e prepara a gaiola colocando comida e água no topo da gaiola. Os ratos são então removidos da caixa de transporte e colocados na gaiola estéril.
   11. A condição animal é notada pelo manipulador de animais estéreis. Todos os animais que pareçam doentes ou tiverem ferimentos óbvios serão segregados. Todas as gaiolas marcadas com animais que necessitam de atenção veterinária serão colocadas para manuseio, mudança de gaiola ou manipulação experimental por último, para reduzir a contaminação potencial de outros animais.
   12. A pessoa não-estérmula removerá a gaiola povoada do capô. As gaiolas podem ser colocadas em um rack padrão como gaiolas estáticas, ou em um rack ventilado como IVCs. Nos IVCs, os camundongos devem ser fornecidos com materiais adicionais de aninhamento para auxiliar na regulação térmica.
   13. O manipulador de animais deve trocar luvas após cada contêiner de transporte para evitar uma possível contaminação cruzada de grupos de animais. O número do contêiner de transporte é registrado no cartão da gaiola para rastrear a origem dos animais em caso de doença.
   14. Suprimentos não utilizados podem ser salvos para uso futuro, desde que o recipiente original possa ser recados. Comida não comida é removida da sala.
   15. Os camundongos devem passar por um período mínimo de uma semana de aclimatação antes do uso experimental.
2. Mudança de gaiola para camundongos imunocomprometidos
   1. As gaiolas do rato são trocadas pelo menos uma vez por semana, ou mais frequentemente, se consideradas necessárias.
   2. Etapas para preparação do capô, preparação de gaiolas e EPI pessoal são as mesmas para a desempacotamento dos animais.
   3. Os animais são transferidos manualmente ou com o uso de fórceps acolchos. O manipulador de animais designado deve reglove após cada 5-10 gaiolas, se as luvas estão rasgadas ou contaminadas, ou se um animal parece doente.
   4. Quaisquer gaiolas com animais aparecendo doentes serão colocadas no final da ordem de mudança da gaiola, para evitar a possível exposição de animais saudáveis a patógenos ou contaminantes.
   5. Se a comida e/ou a água devem ser adicionadas à gaiola antes da próxima mudança programada da gaiola, deve ser feita asepticamente sob o capô preparado.

Como camundongos e ratos representam mais de noventa por cento dos animais usados para pesquisas biomédicas, cuidar adequadamente desses organismos é fundamental para o resultado dos experimentos. Esses procedimentos de cuidado começam logo no início, com a desembalagem dos animais dos contêineres, a troca de gaiolas, a manutenção de condições adequadas de alojamento, o fornecimento de dieta adequada e a garantia de um ambiente adequado. Embora existam procedimentos gerais que se aplicam à maioria dos camundongos e ratos em laboratório, alguns animais, como os imunocomprometidos, requerem atenção adicional para sustentá-los para fins experimentais.

Este vídeo descreverá os padrões e procedimentos de cuidados essenciais para animais imunocompetentes e imunocomprometidos. E, por último, ilustraremos alguns exemplos de experimentos que mostram como os cientistas usam esse conhecimento para diferentes fins de pesquisa.

O recebimento de animais de outras instituições representa um risco para os animais já alojados na instalação, pois durante o trânsito, as caixas de transporte podem entrar em contato com agentes patogênicos. Portanto, um procedimento adequado deve ser empregado ao desembalar os contêineres.

Antes de manusear qualquer animal, é importante usar o Equipamento de Proteção Individual ou EPI adequado. O EPI mínimo a ser usado é jaleco, luvas, óculos de segurança e uma máscara do tipo cirúrgico que reduzirá a exposição a poeira e alérgenos. O próximo passo é selecionar gaiolas apropriadas para os animais que chegam. Em seguida, forneça à gaiola materiais de cama e nidificação apropriados. E leve as gaiolas preparadas para a sala de recepção com temperatura controlada, para que estejam prontas para a transferência antes da chegada dos animais.

Na chegada da remessa, coloque as caixas de transporte em um local seguro na sala de recebimento. Examine o recipiente quanto a danos e desinfete as superfícies externas para destruir quaisquer patógenos nocivos. Certifique-se de que o desinfetante esteja em contato com a caixa por pelo menos 15 a 30 minutos, de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, coloque o contêiner na Estação de Transferência de Animais, ou ATS. Esta estação oferece fluxo de ar unidirecional filtrado de ar particulado de alta eficiência, ou HEPA, dentro do capô. O HEPA protege o usuário de alérgenos e protege os animais do ar ambiente ao redor, minimizando a chance de contaminação. Em seguida, abra o contêiner de transporte e avalie a saúde geral dos roedores. Anote qualquer animal que pareça estar ferido ou doente. Depois disso, coloque-os na gaiola já montada nos tamanhos de grupo adequados, cubra a gaiola com a tampa da barra de arame e prenda a divisória para criar duas áreas. Selecione o alimento apropriado e coloque-o de um lado e deixe o segundo lado aberto para permitir uma melhor circulação de ar. Por fim, se os animais não estiverem sendo colocados em um rack com rega automática, adicione uma garrafa de água para garantir o abastecimento adequado de água. Lembre-se de que o ATS deve ser desinfetado no final de cada sessão e o soprador deve estar desligado durante a desinfecção.

Para a troca da gaiola, coloque as duas gaiolas - uma gaiola nova com o material de cama apropriado e a gaiola usada com os animais - no ATS. Pode-se transferir os animais da gaiola antiga para a nova gaiola manualmente ou com o uso de uma pinça acolchoada. Ambos os métodos foram discutidos em outro vídeo desta coleção. Lembre-se de que apenas uma gaiola de animais pode ser aberta por vez. Para camundongos machos ou fêmeas com ninhada, foi demonstrado que a transferência da área de nidificação dos camundongos para a gaiola limpa auxilia os animais na transição. Depois que o topo da gaiola for colocado na nova gaiola, transfira os alimentos do topo da gaiola antiga para o novo topo e adicione mais comida, se necessário. Em seguida, coloque a tampa da barreira e retorne a gaiola ao rack. É uma boa prática trocar as luvas entre gaiolas ou entre grupos.

O procedimento de desempacotamento para animais imunocomprometidos é um pouco diferente, pois as coisas precisam ser estéreis. Recomenda-se que o soprador dentro do exaustor esteja ligado pelo menos 24 horas antes do uso. Como para animais imunocompensadores, na chegada do embarque, borrife o recipiente com uma solução desinfetante na sala de recebimento e deixe-o fechado por 15 a 30 minutos. No ATS designado para camundongos imunocomprometidos, borrife a capela de fluxo laminar com etanol a 70% 30 minutos antes de manipular os animais. É ideal que duas pessoas participem dessa atividade de desempacotamento - uma pessoa seria o técnico estéril usando o avental esterilizado a vapor e um par duplo de luvas estéreis para manusear os animais usando técnicas assépticas e o outro seria o técnico não estéril usando um avental de isolamento limpo e um par de luvas para manusear itens contaminados. Ambos devem usar máscara, gorro de cabelo e óculos de segurança.

Antes de abrir o contêiner de transporte dentro do capô, coloque todos os suprimentos e gaiolas neles e borrife seu exterior com álcool. E na chegada do embarque, coloque a caixa de animais recebida no capô e borrife-a com etanol 70% também. Existem duas opções para gaiolas estéreis, gaiolas padrão que foram embaladas e esterilizadas a vapor, ou unidades descartáveis que foram esterilizadas por irradiação pelo fornecedor.

Inicie o procedimento de desembalagem abrindo o alimento estéril e, em seguida, abrindo a caixa de transporte. Neste ponto, o manipulador deve descartar o primeiro par de luvas estéreis. Em seguida, a pessoa não estéril desembrulha a gaiola estéril e a passa assepticamente para o tratador de animais, que então remove o capô e a tampa da barra de arame e os coloca de cabeça para baixo no capô. Posteriormente, o tubo do bebedor na gaiola é enchido com água na estação localizada no exaustor. Por fim, o tratador coloca o animal na gaiola, prende-o com a tampa da barra de arame, adiciona comida e coloca o gorro no lugar. Observe que o soprador do exaustor deve permanecer ligado o tempo todo para manter o ambiente estéril. No final, a pessoa não estéril remove a gaiola preenchida do capô e a coloca em um rack apropriado. Para evitar uma possível contaminação cruzada entre os grupos, o tratador do animal deve trocar as luvas após cada contêiner de transporte.

Para a mudança de gaiola dos animais imunocomprometidos, a preparação do capuz e das gaiolas e EPI são os mesmos que para a desembalagem desses animais. E a técnica de transferência é a mesma dos animais imunocompetentes, mas em condições estéreis.

Agora vamos discutir as condições adequadas de alojamento para os animais, que é outro aspecto importante da prestação de cuidados essenciais. Camundongos e ratos são alojados principalmente em gaiolas do tipo caixa de sapatos com um fundo sólido contendo material de cama. A gaiola de rato típica oferece 75 polegadas quadradas de espaço no chão, o que é adequado para um máximo de 5 ratos adultos. Por outro lado, uma gaiola de rato tem a área de 142 polegadas quadradas e é adequada para 2 ratos adultos. As gaiolas estáticas são geralmente cobertas com uma tampa de barra de arame e o material filtrante é adicionado sobre a parte superior da gaiola como um capô. As gaiolas ventiladas individualmente, ou IVCs, também têm uma tampa de barra de arame e capô, mas são colocadas em um rack que fornece fluxo de ar para a gaiola. Isso elimina a necessidade de trocar a gaiola com a mesma frequência que as gaiolas estáticas, o que pode ser benéfico para animais imunocomprometidos.

Todos os sistemas de gaiola têm uma provisão para abastecimento de comida e água. Existem comedouros colocados dentro da gaiola do animal ou uma seção da tampa da barra de arame é usada para armazenamento de alimentos. Os alimentos devem ser colocados de forma a não serem sujos pelos animais. A água é geralmente fornecida através de uma garrafa de água colocada no topo da gaiola, ou através de uma válvula de água automática que é um componente embutido da gaiola do animal. Para a opção de válvula de bebida, quando a gaiola é engatada em um rack, a água é transportada para o tubo para um sistema de irrigação automático projetado para atender às necessidades do animal em toda a instalação de animais.

O Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório afirma que todos os implementos de gaiola devem ser higienizados pelo menos a cada 2 semanas. Algumas gaiolas e acessórios podem precisar ser trocados com mais frequência, conforme ditado pelo nível de odor e amônia no gabinete.

Agora vamos falar sobre o fornecimento adequado de comida e água para animais imunocompetentes e imunocomprometidos. Existem muitos alimentos disponíveis comercialmente com composições variáveis de proteínas, carboidratos e gorduras. Idealmente, os alimentos devem conter 15-19% de proteína, 44% de carboidratos e 4-9% de gordura. Para animais imunocomprometidos, certifique-se de que a ração foi esterilizada.

A água da torneira, ou osmose reversa que é a água RO, pode ser usada para animais imunocompetentes, mas para animais imunodeficientes, a água pode ser uma fonte de contaminação e, portanto, precisa ser esterilizada. A esterilidade na água é mantida pela adição de 2 gotas de ácido clorídrico 12 molar a 8 litros de água RO, o que acidificará a água a um pH de 2,5-3 e limitará o crescimento bacteriano. Em seguida, despeje a água em garrafas individuais e cubra-as com papel alumínio. Coloque as tampas das garrafas com tubos de sorvete separadamente em um saco de autoclave e coloque tudo em uma autoclave para esterilização a vapor.

Agora vamos discutir as condições ambientais padrão essenciais para o cuidado dos animais.

Ao nível das gaiolas, a habitação social é obrigatória, a menos que seja cientificamente justificada ou se um animal for incompatível com todos os outros. Enriquecer o ambiente com cabanas de papel e materiais de nidificação permite que os animais exibam comportamentos específicos da espécie, como construção de ninhos e escavação, o que, por sua vez, diminui o nível de estresse e aumenta o bem-estar geral dos animais. Os materiais de nidificação também fornecem uma área de dormir saturada de feromônios calmantes que auxiliam no alojamento de vários camundongos machos na mesma gaiola. Como mencionado anteriormente, mover a área de nidificação para a gaiola limpa após a troca da gaiola ajuda a prevenir a agressão, especialmente nos machos, à medida que os animais são introduzidos em um novo ambiente. Para animais nus atímicos, deve-se considerar o fornecimento de cama adicional e materiais de nidificação do tipo papel picado em suas gaiolas para auxiliar na termorregulação.

No nível da sala, a temperatura para camundongos e ratos deve estar entre 68 e 79? F. O nível de umidade ambiente deve ser de 30 a 70%, pois níveis mais baixos podem resultar em uma condição conhecida como ringtail. O terceiro parâmetro da sala é a iluminação. Isso inclui intensidade de luz e ciclos. Normalmente, a sala dos animais é definida para um ciclo de luz de 12 horas/escuro de 12 horas. A intensidade da iluminação deve variar de acordo com a atividade na sala. Quando os técnicos estão trabalhando, níveis de iluminação mais altos podem ser usados. No entanto, deve ser reduzido para aproximadamente 325 lux assim que toda a atividade for concluída. Por fim, o fluxo de ar dentro da sala também deve ser cuidadosamente controlado. Um mínimo de 10-15 trocas de ar de 100% de ar fresco deve ocorrer a cada hora. Isso diminui micróbios e odores na sala dos animais.

Por fim, vamos ver como os pesquisadores estão usando esse conhecimento sobre alojamento de animais de laboratório, dieta e preferências ambientais em seus experimentos.

Como discutido anteriormente, os animais de laboratório geralmente exibem comportamento de construção de ninhos, o que reduz o estresse, e os pesquisadores usaram isso como um indicador do bem-estar animal. Neste experimento em particular, os cientistas desenvolveram um sistema imparcial para pontuar o ninho construído e, em seguida, o usaram para estudar o efeito da temperatura ambiente no comportamento de construção do ninho. Como você pode ver, um aumento na temperatura causou uma queda significativa na pontuação, destacando o papel da temperatura ambiente no bem-estar animal.

Dado que camundongos e ratos adoram carboidratos, os pesquisadores usaram rações de diferentes formas para testar a função motora do animal. Isso inclui analisar a destreza durante diferentes tipos de tarefas de manipulação de alimentos e examinar o comportamento de alcance após intervenções cirúrgicas ou farmacológicas.

Por último, sabe-se que camundongos e ratos são noturnos e não preferem áreas iluminadas. Os cientistas usam esse conhecimento para construir um ambiente para estudar a ansiedade nessas espécies. Por exemplo, aqui os pesquisadores introduziram animais em campo aberto simples e estudaram o tempo gasto pelo tipo selvagem e camundongos knockout nas zonas internas e externas, para analisar o efeito do knockdown do gene no comportamento semelhante à ansiedade.

Você acabou de assistir à introdução de JoVE aos procedimentos de cuidados essenciais para camundongos e ratos. Agora você deve ter uma melhor compreensão das medidas que devem ser tomadas para garantir que o meio ambiente e o manuseio desses animais não causem nenhum dano à saúde animal e também devem saber como os pesquisadores podem modificar esses parâmetros para atingir diferentes objetivos científicos. Como sempre, obrigado por assistir!