Fundamentos da Reprodução e Desmame

Fundamentals of Breeding and Weaning

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Lab Animal Research

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Fundamentals of Breeding and Weaning

5.5: Rodent Identification II

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13:54 min

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August 24, 2015

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidade de Notre Dame, IN

Milhões de ratos e ratos são criados para uso em pesquisas biomédicas a cada ano. Em todo o mundo, existem várias grandes instalações de reprodução comercial que fornecem camundongos para laboratórios de pesquisa, mas muitas instalações optam por também criar ratos e ratos internamente para reduzir custos e aumentar as opções de pesquisa. Ao se reproduzir no animal, os pesquisadores são capazes de manipular a genética dos animais, cronometrar as gestações para atender às necessidades da pesquisa e trabalhar com embriões e recém-nascidos conforme necessário.

Ratos e ratos podem ser criados em uma variedade de esquemas e métodos. Procedimentos técnicos, como o uso de citologia vaginal, visualização da área vaginal e observação de plugues copulatórios, foram desenvolvidos para auxiliar na sincronização da reprodução para corresponder aos requisitos de pesquisa. Este manuscrito é uma visão geral dos fundamentos básicos da criação de ratos e ratos e procedimentos técnicos utilizados. Descrições mais detalhadas dos complexos esquemas de reprodução, e a descrição completa dos métodos de citologia vaginal, estão disponíveis na lista de referências.

Principles

Tipos Comuns de Cepas e Ações

Ratos e ratos são comumente criados como estoques de raças superadas, cepas de raça e cepas híbridas. Animais de raça têm características semelhantes, mas não são idênticos geneticamente. Eles são criados aleatoriamente para manter a heterozigosidade ou variância genética. Em contraste, os animais de raça foram criados com pelo menos 20 gerações de acasalamento irmão-irmã ou pelos e são geneticamente homozigosos. Finalmente, os animais híbridos são a prole do acasalamento de duas cepas de raça.

Fatores que afetam o comportamento de reprodução

Existem muitos fatores que podem influenciar o desempenho de reprodução de ratos e ratos. O vigor das criadoras femininas depende em grande parte do nível de endogamia. Os animais que são superados são muito mais duros e vigorosos, assim produzem ninhadas maiores e mais fortes. Algumas cepas comumente usadas, como o mouse C57BL/6, apresentam comportamentos agressivos que podem interferir na reprodução. Ao criar uma cepa agressiva, todas as ninhadas devem ser observadas de perto. Animais de uma ninhada contendo filhotes agressivos não devem ser usados para reprodução. As flutuações de temperatura, umidade e iluminação podem causar quedas na eficiência da reprodução. Ruídos e vibrações dentro das salas de reprodução também têm sido mostrados para causar efeitos deletérios. O controle dessas variáveis dentro do criadouro minimizará alguns efeitos. ¹ Animais com modificações genéticas tendem a ser menos resistentes e férteis, e algumas das mutações podem resultar em letalidade dos filhotes antes ou logo após o nascimento.

Esquemas de reprodução

Esquemas de reprodução são semelhantes para ratos e ratos. Os sistemas comumente utilizados são o acasalamento monogâmico de uma fêmea criado a um macho ou acasalamento polígama de duas ou mais fêmeas criadas para um macho. Tanto o rato fêmea quanto o rato são poliestrosos e passam por uma estrus pós-parto aproximadamente 20-24 h após a parturição. Durante os pós-partos, a fêmea pode conceber uma ninhada. Para cepas de camundongos ou ratos que têm uma vida útil de reprodução curta devido a uma mutação genética, é comum deixar o macho na gaiola com a fêmea para que ela possa imediatamente conceber outra ninhada. Este esquema intensivo de reprodução pode ser estressante para a fêmea, pois ela está continuamente amamentando e gestando. Um esquema não intensivo envolve a separação da fêmea uma vez que ela está visivelmente grávida; ela não é devolvida à gaiola do macho até que sua ninhada tenha sido desmamada. Este sistema é muito menos exigente para a fêmea.

Reprodução para fins de manipulação genética

Animais geneticamente modificados (GEAs) são animais de nocaute que tiveram genes removidos de seu genoma ou animais transgênicos que tiveram genes de uma espécie diferente adicionados em seu genoma. Os GEAs são então criados como uma cepa de raça e são muitas vezes criados com outros GEAs para criar um animal complexo e geneticamente manipulado para projetos de pesquisa muito específicos. Esquemas complexos de reprodução são usados para criar cepas com alguns genes removidos e outros adicionados. Modelos animais para muitas doenças relacionadas a genes – incluindo, mas não restritos a, doença de Alzheimer, câncer, derrame e outras doenças sanguíneas, diabetes e pigmentos retinais – foram desenvolvidos através da engenharia genética de animais.

A maioria dos esquemas de reprodução pode contar com a genética mendeliana para fazer previsões sobre as proporções de genótipos. Quando um rato de tipo selvagem é criado com um rato com um gene modificado (um heterozigoto), os resultados esperados seriam 50% animais de tipo selvagem e 50% heterozygotes. Um rato de tipo selvagem atravessado com um rato com dois genes modificados (um homozigoto) resultará em todos os filhotes sendo heterozygotes. Quando dois animais heterozigos são cruzados, todos os três genótipos devem estar presentes nos seguintes percentuais: 25% de tipo selvagem, 50% heterozygotes e 25% homozygotes. É a partir dessas expectativas que genes letais embrionários podem ser detectados (ou seja,se não houver descendentes homozigotos produzidos).

Figura 1. Possíveis acasalamentos e desfechos baseados na genética mendeliana. Animais de tipo selvagem não são geneticamente modificados e são designados como (+/+). Animais heterozigos têm uma cópia de um gene modificado e são designados como (-/+); Animais homozigos têm ambas cópias de um gene modificado e são designados como (-/-).

Procedure

1. As informações necessárias ao emparelhar animais incluem cepa/estoque do animal utilizando nomenclatura adequada, datas de nascimento para o criador macho e fêmea, e a data de configuração. A manutenção precisa do registro é imperativa com colônias de reprodução.

2. A determinação sexual de ratos e ratos é feita comparando as distâncias anogenitais. No feminino, a distância entre o ânus e a genitália externa é menor do que para os machos. A presença de um saco escrotal em animais machos é outro indicador sexual.

3. Selecionar e configurar o esquema de acasalamento

NOTA: Existem dois esquemas de acasalamento que podem ser usados.

Proestrus/estrus cronometrado acasalamento: Este método depende da comparação entre fêmeas com machos no ponto de máxima receptividade e fertilidade.
1. O ciclo estrous deve ser monitorado nas fêmeas, seja por exame visual da genitália externa para alterações que sejam indicativas de proestrus e estrous, ou por citologia de secreções vaginais (veja abaixo).
2. Quando uma fêmea é determinada a estar em proestrus ou estrus, ela é emparelhada com um macho no final do dia, como os animais geralmente acasalam à noite.
3. Na manhã seguinte, a fêmea é examinada para um plugue copulatório (veja abaixo). Se não houver plugue, a fêmea pode permanecer com o macho durante o dia e verificar se há um plugue copulatório no final do dia. Alternativamente, se for determinado que ela não está mais em proestrus ou estrus, ela é removida da gaiola de reprodução.
Acasalamento cronometrado aleatório: Este método baseia-se no fato de que o ciclo edênuo dos roedores é muito curto, de 4 a 5 dias de duração.
1. Para este método, os acasalamentos podem ser configurados a qualquer momento, e as fêmeas são então verificadas por plugues copulatórios todas as manhãs e noites até que um plugue seja observado.
2. Uma fêmea é emparelhada com um macho à noite.
3. Ela é verificada para um plugue copulatório no início e no final de cada dia até que um plugue seja observado. Geralmente leva 3 ou mais dias para um plugue ser visto ao usar este método.

4. Prever a gravidez

Como a palpação de filhotes é difícil até mais tarde durante a gravidez, por volta do dia 10-12, sistemas comerciais de ultrassom para roedores foram desenvolvidos; no entanto, poucas instalações de pesquisa animal têm essa tecnologia. Portanto, a visualização de plugues copulatórios, a observação de alterações vaginais ou citologia vaginal são comumente usadas para auxiliar na previsão de quando uma fêmea concebeu uma ninhada (veja abaixo). No entanto, nenhum desses métodos é capaz de confirmar a gravidez. Uma vez observada uma ficha copulatória, a fêmea deve ser monitorada para sinais de gravidez, como ganho de peso.

5. Determinando o estágio do ciclo estrous

Inspeção Visual
NOTA: Para o acasalamento cronometrado de ratos e ratos, a observação visual da vagina para alterações que são indicativas de proestrus e estrus é o método mais rápido para determinar o estágio de ciclo estrous, e não requer nenhum equipamento especial.
1. Ao avaliar o ciclo estrous utilizando o método visual, é importante realizar a inspeção visual na mesma área no que diz respeito à iluminação do quarto, pois a fonte de luz pode alterar a cor percebida dos tecidos vaginais e dificultar a avaliação. Por exemplo, a tonalidade roxa lançada por luzes LED dificulta a detecção visual.
2. Para avaliar o estágio do ciclo estrous por observação visual, cada rato deve ser contido manualmente pela cauda, com as previs descansando sobre uma tampa da gaiola.
3. A abertura vaginal de cada fêmea é avaliada com base na condição do tecido ao redor da área vaginal e do tamanho da abertura vaginal. ²
  1. Durante o proestrus, a abertura vaginal é larga e é caracterizada pelo inchaço do tecido circundante. O tecido é rosa na cor e muito úmido. Muitas vezes há rugas ou estrias ao longo das bordas dorsal e ventral da abertura.
  2. Durante os estrus, o inchaço dos tecidos ao redor da abertura vaginal é reduzido, e os tecidos não são tão úmidos e rosados.
  3. Durante o metestrus a abertura vaginal é mínima e há um inchaço insignificante.
  4. Durante diestrus, não há inchaço dos tecidos ao redor da área vaginal, e a abertura vaginal é pequena e fechada.
Citologia vaginal
Como tanto os ratos quanto os ratos são poliestrosos, o comprimento do ciclo estrus é muito curto, variando de 4 a 5 dias. Às vezes é necessário identificar todos os quatro estágios de estrous: proestrus, estrus, metestrus e diestrus. Citologia vaginal é um método muito preciso para determinar esses estágios. Há também dois métodos de coleta de amostras: o método não invasivo de lavage vaginal, e o método invasivo de swabbing do canal vaginal.
1. Lavage vaginal
  1. Os materiais necessários são pontas estéreis de 200 μl de pipetas, lâmpadas de látex, água dupla destilada estéril (ddH₂0) e lâminas de vidro limpas.
  2. Coloque uma lâmpada de látex na extremidade de uma ponta estéril de 200 μl. Elasenhe aproximadamente 100 μl de ddH₂O estéril na pipeta.
  3. Levante o rato para fora da gaiola, e coloque-a no topo da gaiola da barra de arame com a cauda em sua direção.
  4. Segure firmemente a cauda e eleve os traseiros do mouse. O mouse agora terá apenas as patas dianteiras segurando a tampa.
  5. Se o rato urinar, espere até que a urinação pare. Caso haja urina na entrada do canal vaginal, a abertura pode ser enxaguada com um pequeno esguicho de ddH₂O. Troque a ponta que foi usada para enxaguar.
  6. Coloque a ponta preenchida com ddH₂O na abertura do canal vaginal sem penetrar no orifício.
  7. Deprimir suavemente a lâmpada para expelir um quarto a metade do volume de água (~25-50 μl) na abertura do canal vaginal. O líquido aspirará espontaneamente no canal sem inserção de ponta. Solte lentamente a pressão exercida sobre a lâmpada. O fluido vai se retirar de volta para a ponta.
  8. Evite liberar pressão muito rapidamente para evitar a aspiração de fluido na lâmpada. Uma ponta filtrada pode ser útil para este fim.
  9. Repita a etapa anterior 4-5 vezes usando a mesma ponta, lâmpada e fluido para obter um número suficiente de células em uma única amostra.
  10. Coloque o fluido na lâmina de vidro e deixe a mancha secar completamente à temperatura ambiente.
  11. Use uma nova pipeta para cada mouse.
  12. Uma vez secas, essas manchas estrous podem ser manchadas imediatamente ou armazenadas e manchadas posteriormente. A coloração wright-Giemsa é mais comumente usada para manchar os slides. Esta mancha está disponível comercialmente como uma mancha de uma etapa que não requer fixação do slide para evitar que as células se lavem durante o processo de coloração. O slide é colocado na mancha por 45-60 segundos, de acordo com as instruções do fabricante.
  13. Os slides são então examinados sob um microscópio, e as células vistas correspondem ao estágio do ciclo: 1) se a fêmea estiver em proestrus, as células são vistas como aglomerados de células epiteliais redondas e bem formadas com um núcleo que mancha mais escuro que o citoplasma; 2) se a fêmea está em estrus, a maioria das células são células epiteliais escamosas cornificadas que não têm um núcleo, são angulares na aparência e ocorrem em aglomerados densamente embalados; 3) se a fêmea estiver em metestrus, as células são tipicamente glóbulos brancos (especificamente neutrófilos com algumas células epiteliais escamosas cornificadas presentes) com núcleos manchados de escuro que têm a forma de duas salsichas ligadas; 4) durante diestrus, as células presentes são normalmente glóbulos brancos com a ocorrência de algumas células epiteliais nucleadas..
2. Swabbing vaginal
  1. Os materiais necessários são aplicadores estéreis com ponta de algodão com ponta de 2 mm de diâmetro, lâminas de microscópio de vidro limpo e soro fisiológico estéril.
  2. Molhe um aplicador de ponta de algodão com soro fisiológico.
  3. Insira a ponta do aplicador na vagina do mouse contido.
  4. Vire suavemente e role a ponta contra a parede vaginal. Remova cuidadosamente o cotonete.
  5. As células são transferidas para uma lâmina de vidro seca rolando o cotonete através do escorregador.
  6. Uma vez que o slide está seco, ele pode ser manchado com a mancha Wright-Giemsa.
    A limpeza é considerada um procedimento estressante, e quando ratos estressados podem ter interrompido ciclos estrous. Estimulação vaginal e cervical causada por swabbing pode induzir pseudopregnancy. Cotonetes repetidos da mucosa vaginal podem causar danos se não forem realizados suavemente, com a devida contenção e com os cotonetes de algodão de tamanho correto. ^3,4

Figura 2. Citologia vaginal – diferentes estágios do ciclo de estrus de roedores

6. Visualização de um plugue copulatório

Este plugue consiste em fluido vaginal e sêmen, e persiste na vagina por 12-24 h póscopulação. A presença do plugue confirma o acasalamento, mas não garante que a fêmea esteja grávida. Se a fêmea plugada estiver grávida, o primeiro dia de gestação é considerado um dia após a ção do plugue.

Levante o rato para fora da gaiola e coloque-a no topo da gaiola da barra de arame com a cauda em sua direção.
Posicione o mouse aplicando pressão logo acima da cauda para arquear a parte de trás para permitir uma melhor apresentação da abertura vaginal.
Observe sua abertura vaginal para uma massa esbranquiçada. O plugue copulatório pode não ser visualmente óbvio, mas pode ser confirmado com o uso de uma sonda sem cortes.
Usando a ponta da sonda, insira-a suavemente na abertura vaginal. A presença de um plugue copulatório impedirá o avanço da sonda dentro de 0,5 cm da abertura vaginal.
A sonda deve ser desinfetada com álcool e seca completamente antes de cada uso.

Como a fêmea tem ninhadas, a data de nascimento, o tamanho da ninhada, o número nascido, o número desmamado, a razão entre filhotes machos e fêmeas e a razão dos genótipos devem ser todos registrados. Se os genótipos dentro de uma ninhada não correspondem aos genótipos dos pais, o reteste deve ser feito para verificar o genótipo verdadeiro.

7. Desmamar

A gestação para ratos e ratos é de aproximadamente 21 dias. Os jovens são desmamados aos 21-28 dias de idade. Tanto camundongos quanto ratos podem procriar até 8 semanas de idade, portanto é imperativo que os filhotes sejam separados por sexo em uma idade precoce. A reprodução intensiva exige que os filhotes de cada ninhada sejam desmamados no dia 20 para evitar que os filhotes mais velhos estejam presentes quando a próxima ninhada nascer. Para a reprodução não intensiva, os filhotes podem ficar com a mãe após 20 dias de idade, muitas vezes até 28 dias de idade. Isso pode ser muito benéfico para muitas cepas geneticamente modificadas, já que os filhotes podem não ser tão vigorosos quanto animais não silvestres ou selvagens.

Filhotes machos e fêmeas são separados no desmamar. Sempre que possível, filhotes recém-desmamados não devem ser alojados de forma singly. Se uma ninhada contém apenas um filhote de um determinado sexo, devem ser feitas tentativas de abrigar este filhote com outros do mesmo sexo. As opções de moradia possíveis são: 1) um único filhote fêmea pode permanecer com a mãe se não estiver em uma gaiola de reprodução intensiva; 2) Um único filhote feminino ou masculino pode ser colocado com outros filhotes do mesmo sexo de uma ninhada diferente da mesma idade; 3) se os pais são um par monogâmico, a fêmea pode ser removida da gaiola para permitir que um único filhote macho seja alojado com o pai; e 4) um único filhote macho pode ser alojado com irmãos do sexo feminino até 5 semanas de idade. O sexo dos filhotes deve ser verificado uma semana após a morte para evitar que ninhadas indesejadas sejam filhotes segregados incorretamente.

Os ratos e ratos desmasmamento devem ser verificados diariamente para garantir que eles estão prosperando. Embora o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório⁵ adquira que os alimentos devem ser apresentados aos animais de forma a evitar que sejam sujos por fezes e urina, os camundongos recém-desmamados devem receber uma pequena quantidade de alimento (uma pelota por rato) colocado em uma placa de vidro (placa de petri) no chão da gaiola. Isso incentivará os animais a fazer a transição para ter a comida de roedores como sua única fonte de alimento. Mesmo para animais que estão alojados em racks que fornecem água para as gaiolas através de um sistema de rega automática, uma garrafa de água pode ser adicionada à gaiola se os ratos parecerem estar desidratados.

Nome	Tipo colônia	Descrição
ICR	Outbred	Albino
Swiss-Webster	Outbred	Albino
Balb/c	Inato	Albino
FVB	Inato	Albino
C57BL/6	Inato	Cor do casaco preto
C₃H	Inato	Cor do casaco marrom
DBA/2	Inato	Cor do casaco marrom/cinza
Nus atímicos (nu/nu)	Inato	Calvo
SCID	Inato	Cores severas combinadas de ratos deficientes imunológicos-várias cores de casaco

Mesa 1. Manchas e estoques de rato comumente usados.

Nome	Tipo colônia	Descrição
Sprague-Dawley	Outbred	Albino
Wistar	Outbred	Albino
Fisher 344	Inato	Albino
Lewis	Inato	Albino
Longo Evans	Inato	Encapuzado, preto e branco

Mesa 2. Cepas e estoques de ratos comumente usados.

Milhões de ratos e ratos são criados para uso em pesquisas biomédicas todos os anos, e muitas instituições optam por isso internamente para reduzir custos e aumentar as opções de pesquisa. As vantagens da reprodução interna são, 1) os pesquisadores são capazes de manipular a genética dos animais através da reprodução seletiva 2) eles podem cronometrar as gestações para atender às necessidades de pesquisa, e 3) eles podem trabalhar com embriões e recém-nascidos conforme necessário. No entanto, para configurar um esquema de reprodução bem sucedido, deve-se entender o ciclo estrous roedor. Além disso, eles devem ter conhecimento sobre os diferentes esquemas de acasalamento, os fatores que afetam o comportamento de criação de roedores e as considerações de desmame… tudo isso será discutido nesta apresentação de vídeo.

Vamos começar com a revisão do ciclo estrous de roedores. Ambos os ratos fêmeas e camundongos são poliessos, o que significa que eles têm mais de um ciclo de estrus em um ano ou uma estação de reprodução. Cada ciclo dura de 4 a 5 dias e pode ser dividido em 4 estágios: metestrus, diestrus, proestrus e estrus. Estrus é a fase ovulatória, o que significa que se a fêmea está na fase proestrus ou estrus, ela está pronta para conceber.

Uma maneira de determinar o estágio do ciclo estrous é por exame visual. Contenha manualmente o animal pela cauda e com as previs descansando sobre uma tampa da gaiola e inspecione cuidadosamente o tamanho da abertura vaginal e do tecido circundante. Durante a fase do proestrus, a abertura vaginal é larga e é caracterizada pelo inchaço do tecido circundante, que é cor rosa e muito úmido. Muitas vezes há rugas ou estrias ao longo das bordas dorsal e ventral da abertura. Durante os estrus, o inchaço em torno da abertura vaginal é reduzido e os tecidos não são tão úmidos e rosados. Durante o metestrus, a abertura vaginal é mínima e há um inchaço insignificante. Durante diestrus, não há inchaço dos tecidos ao redor da área vaginal e a abertura é pequena ou fechada.

Outra abordagem mais precisa para determinar o estágio de ciclo estrous é a citologia vaginal para a qual as amostras de células são coletadas por lavage ou swabbing. Para lavagem, coloque uma lâmpada de látex na extremidade de uma ponta estéril de 200 microliteres e elabove aproximadamente 100 microliters de água dupla estéril destilada na pipeta. Em seguida, levante o rato para fora da gaiola e coloque-a no topo da gaiola da barra de arame com a cauda em sua direção. Segure firmemente a cauda e eleve os traseiros do mouse de tal forma que apenas as patas dianteiras estejam segurando a tampa. Coloque a ponta da ponta preenchida na abertura do canal vaginal sem penetrar no orifício. Deprimir suavemente a lâmpada para expelir aproximadamente 25-50 microliters de água na abertura vaginal. O líquido aspirará espontaneamente no canal sem inserção de ponta. Solte lentamente a pressão exercida sobre a lâmpada e o fluido se retirará de volta para a ponta. Repita 4-5 vezes usando a mesma ponta, lâmpada e fluido para obter um número suficiente de células em uma única amostra. Coloque o fluido na lâmina de vidro e deixe a mancha secar completamente à temperatura ambiente. Uma vez secas, essas manchas estrous podem ser armazenadas para uso posterior, ou podem ser manchadas imediatamente usando a mancha Wright-Giemsa, que é uma mancha de um passo e não requer fixação. O slide é colocado na mancha por 45 a 60 segundos.

Por outro lado, para esfregar, molhe um aplicador de ponta de algodão de 2 mm com soro fisiológico. Insira a ponta do aplicador na vagina do mouse contido e gire suavemente e role a ponta contra a parede vaginal. Em seguida, remova o cotonete cuidadosamente e transfira as células para uma lâmina de vidro seca rolando o cotonete através do slide. Este procedimento é considerado estressante e pode causar danos se não for realizado suavemente, com a devida contenção e com os cotonetes de algodão de tamanho correto. Como lavado, uma vez que o escorregador está seco, ele pode ser manchado com a mancha Wright-Giemsa. Após a coloração, os slides podem ser examinados sob um microscópio.

Se a fêmea está em proestrus, as células são vistas como aglomerados de células epiteliais redondas, bem formadas e nucleadas com um núcleo que mancha mais escuro que o citoplasma. Se ela está em fase estrus, a maioria das células são células epiteliais escamosas cornificadas que não têm um núcleo. Eles são angulares na aparência e estão em aglomerados densamente embalados. Se a fêmea está em metestrus, as células são tipicamente glóbulos brancos, especificamente neutrófilos, com algumas células epiteliais escamosas cornificadas presentes. Durante diestrus, as células presentes são normalmente glóbulos brancos com a ocorrência de algumas células epiteliais nucleadas.

Agora que você tem uma compreensão do ciclo estrous roedor, vamos discutir como configurar o acasalamento. O primeiro passo é a determinação do sexo, que é feito comparando as distâncias anogenitais. No feminino, a distância entre o ânus e a genitália externa é menor do que para os machos. Com base nas necessidades de pesquisa e na eficiência de reprodução da cepa, o esquema de acasalamento pode ser monogâmulo – onde uma fêmea é criada para um macho ou polígama – onde duas ou mais fêmeas são criadas para um macho.

Em termos de tempo, dado que o ciclo estrous de roedores é curto de 4 a 5 dias de duração, pode-se configurar o acasalamento aleatoriamente. Ou podem configurar o “acasalamento cronometrado”, que envolve a introdução feminina à gaiola de acasalamento quando ela está no ponto de máxima receptividade e fertilidade – que é durante a fase proestrus ou estrus. Em ambos os casos, o acasalamento deve ser configurado no final de um dia, já que os roedores são noturnos e tendem a acasalar à noite. Na manhã seguinte, a fêmea é examinada para um plugue copulatório – uma massa esbranquiçada composta de fluido vaginal e sêmen que persiste por 12-24 horas após a cópula. Se o plugue copulatório não for visualmente óbvio, insira suavemente a ponta de uma sonda sem corte na abertura vaginal. A presença de um plugue copulatório impedirá o avanço da sonda dentro de 0,5 cm da abertura vaginal. Em caso de acasalamento aleatório, a aparência do plugue copulatório geralmente leva três dias. A presença de um plugue confirma que o acasalamento não garante que a fêmea esteja grávida.

Uma vez observada uma ficha copulatória, a fêmea deve ser monitorada para sinais de gravidez, como ganho de peso. Se a fêmea plugada estiver grávida, então o dia em que o plugue foi encontrado é o dia zero ou E0 embrionário e o dia seguinte é considerado como o primeiro dia de gestação, ou E1, e assim por diante até a parturição – que está dando à luz – que é entre 19 e 21 dias. Aproximadamente 20-24 horas após o parto, tanto ratos fêmeas quanto camundongos passam por uma estrus e podem engravidar novamente.

Em um esquema intensivo de reprodução, que é comumente usado para animais com um curto período de vida devido a uma mutação genética, os animais machos são deixados na gaiola com a fêmea e filhotes, para que a fêmea possa conceber outra ninhada imediatamente. Este esquema pode ser estressante para a fêmea, pois ela está continuamente amamentando e gestando. Pelo contrário, o esquema de reprodução não intensivo envolve separar a fêmea uma vez que ela está visivelmente grávida, e não devolvê-la à gaiola do macho até que sua ninhada tenha sido desmamada, tornando este um esquema de reprodução menos exigente.

Existem muitos fatores que podem influenciar o desempenho de reprodução de ratos e ratos. Vamos rever alguns deles, que aparecem com mais frequência. O vigor das criadoras femininas depende em grande parte do nível de endogamia. Os animais que são superados são muito mais resistentes e vigorosos, assim produzem ninhadas maiores e mais fortes. Outro fator que pode afetar o desempenho da reprodução é o comportamento agressivo. Algumas cepas comumente usadas, como os camundongos C57BL/6, têm uma tendência a exibir agressão, o que pode interferir na reprodução. Ao criar uma cepa agressiva, todas as ninhadas devem ser observadas de perto. Animais de uma ninhada contendo filhotes agressivos não devem ser usados para reprodução. As flutuações de temperatura, umidade e iluminação podem causar quedas na eficiência da reprodução. Ruídos e vibrações dentro das salas de reprodução também têm sido mostrados para causar efeitos deletérios. Animais com modificações genéticas tendem a ser menos resistentes e férteis, e algumas das mutações podem resultar em letalidade dos filhotes antes ou logo após o nascimento.

Agora vamos rever brevemente como desmamar filhotes desses animais de laboratório. O tempo para começar o desmamar difere do esquema de reprodução. Em caso de reprodução não intensiva, os filhotes podem ser desmamados aos 21-28 dias de idade. Mas em caso de reprodução intensiva, os filhotes de cada ninhada são desmamados no dia 20 para evitar que os filhotes mais velhos estejam presentes quando a próxima ninhada nascer. Como os roedores podem começar a acasalar até 8 semanas, filhotes machos e fêmeas são separados no desmame. Sempre que possível, filhotes recém-desmamados não devem ser alojados de forma singly.

Se uma ninhada contém apenas um filhote de um determinado sexo, devem ser feitas tentativas de abrigar este filhote com filhotes do mesmo sexo de outra ninhada. As possíveis opções de moradia para filhotes de desmamar estão listadas no manuscrito abaixo. Os ratos e ratos desmasmamento devem ser verificados diariamente para garantir que eles estão prosperando. Para o fornecimento de alimentos, uma pequena quantidade de alimento, uma pelota por rato, deve ser colocada no chão da gaiola durante os primeiros 7-10 dias, com alimentos adicionais no topo da gaiola. Isso incentivará os animais a fazer a transição para ter a comida de roedores como sua única fonte de alimento. Para o abastecimento de água, uma garrafa deve ser adicionada mesmo que os animais estejam alojados em racks com sistema de rega automática. Isso é para evitar a desidratação.

Por último, vamos ver como os cientistas estão usando a abordagem de reprodução interna a seu favor. Uma das aplicações mais comuns de configuração do acasalamento é desenvolver camundongos com genótipo alterado. Para estudar a função de um gene, os pesquisadores frequentemente interrompem seu código genético. No entanto, esses animais como os humanos são diploides e, portanto, têm duas cópias do mesmo gene. Portanto, para interromper completamente o gene, os camundongos alterados precisam ser criados para produzir um animal com ambas as cópias disfuncionais, ou seja, um nocaute homozigoso. Camundongos com uma cópia disfuncional são chamados heterozigos ou hets.

A outra vantagem de configurar o acasalamento interno é testar o efeito da exposição pré-natal a compostos de teste. Por exemplo, aqui os pesquisadores forneceram à gestante uma dieta líquida contendo álcool de E7 a E13. Em seguida, no E13, eles dissecaram a fêmea grávida, obtiveram cérebros fetais, e os cortaram em seções finas. Por fim, a coloração dos slides revelou que a exposição ao álcool pré-natal aumentou a morte celular no tecido neural.

Por fim, a reprodução interna também permite o estudo de distúrbios pós-gravidez, como a depressão pós-parto. Neste estudo, os cientistas primeiro afastaram o lixo da represa durante o período de lactação. Então, 60 minutos depois, reintroduziu os filhotes na represa. E para induzir o estresse na fêmea, adicionou um novo intruso masculino à gaiola. Em seguida, os pesquisadores observaram a barragem para agressão materna, que inclui atacar e morder o intruso do sexo masculino, bem como para diferentes comportamentos de cuidado materno, como o preparo de filhotes e a amamentação. Os dados obtidos revelaram que o estresse tem um efeito significativo tanto na agressão materna pós-parto quanto no cuidado.

Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre fundamentos de reprodução e desmaseamento de ratos e ratos em laboratório. Agora você deve ter uma melhor compreensão do ciclo de estrus de roedores e também saber como determinar o estágio de ciclo e como usá-lo para configurar esquemas de acasalamento bem-sucedidos. Também revisamos os fatores que podem afetar o comportamento de reprodução e explicamos como e quando desmamar camundongos e filhotes de ratos. Como sempre, obrigado por assistir!

Applications and Summary

Colônias de reprodução interna oferecem flexibilidade à pesquisa, especialmente com projetos que utilizam embriões ou recém-nascidos. Utilizando técnicas como acasalamento cronometrado com plugues copulatórios e citologia vaginal, a data de concepção e gestação pode ser mais precisamente prevista. Isso permite que os pesquisadores planejem com mais cuidado seus experimentos. O controle de fatores ambientais como ciclos de luz, temperatura, umidade e vibrações otimizará os resultados de reprodução.

References

Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. A Jackson Laboratory Resource Manual. http://ko.cwru.edu/info/breeding_strategies_manual.pdf.
Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., and Taft, R. A. 2012. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7, 1-5.
McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. 2012. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J. Vis. Exp. 67, e4389. doi:10.3791/4389.
Mamrot, J., Pangestu, M., Walker, D., Gardner, D. K., and Dickerson, H. 2015. Confirmed dioestrus in pseudopregnant mice using vaginal exfoliative cytology improves embryo transfer implantation rate. Reproductive BioMedicine Online. 31. 538-543.
Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8^th ed. Washington (DC): National Academies Press.

Transcript

Millions of mice and rats are bred for use in biomedical research every year, and many institutions choose to this in-house to reduce costs and increase research options. The advantages of in-house breeding are, 1) researchers are able to manipulate the genetics of the animals through selective breeding 2) they can time pregnancies to meet research needs, and 3) they can work with embryos and neonates as necessary. However, to setup a successful breeding scheme, one should understand the rodent estrous cycle. In addition, they should have knowledge about the different mating schemes, the factors affecting rodent breeding behavior and the weaning considerations…all of which will be discussed in this video presentation.

Let’s begin with review of the rodent estrous cycle. Both female rats and mice are polyestrous, meaning they have more than one estrus cycle in a year or a breeding season. Each cycle lasts for 4-5 days and can be divided into 4 stages: metestrus, diestrus, proestrus, and estrus. Estrus is the ovulatory phase, which means that if the female is in the proestrus or the estrus phase, she is ready to conceive.

One way to determine the estrous cycle stage is by visual examination. Manually restrain the animal by the tail and with the forepaws resting on a cage lid and carefully inspect the size of the vaginal opening and the surrounding tissue. During the proestrus phase, the vaginal opening is wide and is characterized by swelling of the surrounding tissue, which is pink in color and very moist. Often there are wrinkles or striations along the dorsal and ventral edges of the opening. During the estrus, the swelling surrounding the vaginal opening is reduced and the tissues are not as moist and pink. During the metestrus, the vaginal opening is minimal and there is negligible swelling. During diestrus, there is no swelling of the tissues around the vaginal area and the opening is small or closed.

Another, more accurate approach for determining the estrous cycle stage is vaginal cytology for which cell samples are collected by either lavage or swabbing. For lavage, place a latex bulb on the end of a sterile 200-microliter tip and draw up approximately 100 microliters of sterile double distilled water into the pipette. Next, lift the mouse out of the cage and place her on the wire bar cage top with her tail towards you. Firmly grasp the tail and elevate the hindquarters of the mouse such that only the front paws are grasping the lid. Place the end of the filled tip at the opening of the vaginal canal without penetrating the orifice. Gently depress the bulb to expel approximately 25-50 microliters of water at the vaginal opening. The liquid will spontaneously aspirate into the canal without tip insertion. Slowly release the pressure exerted on the bulb and the fluid will withdraw back into the tip. Repeat 4-5 times using the same tip, bulb, and fluid to obtain a sufficient number of cells in a single sample. Place the fluid on glass slide, and allow the smear to completely dry at room temperature. Once dry, these estrous smears can be stored for later use, or they can be stained immediately using the Wright-Giemsa stain, which is a one-step stain and does not requiring fixation. The slide is placed in the stain for 45 to 60 seconds.

On the other hand, for swabbing, wet a 2 mm cotton-tipped applicator with saline. Insert the tip of the applicator into the vagina of the restrained mouse and gently turn and roll the tip against the vaginal wall. Then remove the swab carefully and transfer the cells to a dry glass slide by rolling the swab across the slide. This procedure is considered stressful and can cause damage if not performed gently, with proper restraint, and with the correct sized cotton swabs. Like lavage, once the slide is dry, it can be stained with the Wright-Giemsa stain. Following staining, the slides can be examined under a microscope.

If the female is in proestrus, the cells are seen as clusters of round, well-formed, nucleated epithelial cells with a nucleus that stains darker than the cytoplasm. If she is in estrus phase, the majority of the cells are cornified squamous epithelial cells that lack a nucleus. They are angular in appearance and are in densely packed clusters. If the female is in metestrus, the cells are typically white blood cells, specifically neutrophils, with some cornified squamous epithelial cells present. During diestrus, the cells present are normally white blood cells with the occurrence of a few nucleated epithelial cells.

Now that you have an understanding of the rodent estrous cycle, let’s discuss how to set-up mating. First step is determination of the sex, which is done by comparing the anogenital distances. In females, the distance between the anus and the external genitalia is shorter than it is for the males. Based on research needs and the strain’s breeding efficiency, the mating scheme can be monogamous — where one female is bred to one male OR polygamous — where two or more females are bred to one male.

In terms of timing, given that the rodent estrous cycle is short-only 4-5 days long-one can set up mating randomly. Or they can set up “timed mating”, which involves introducing female to the mating cage when she is at the point of maximum receptivity and fertility-that is during the proestrus or the estrus phase. In either case, the mating should be set up at the end of a day, as rodents are nocturnal and tend to mate at night. The following morning, the female is examined for a copulatory plug – a whitish mass consisting of vaginal fluid and semen that persists for 12-24 hours post-copulation. If the copulatory plug is not visually obvious, gently insert the tip of a blunt probe into the vaginal opening. The presence of a copulatory plug will impede the advancement of the probe within 0.5 cm of the vaginal opening. In case of random mating, copulatory plug appearance commonly takes three days. The presence of a plug confirms mating does not guarantee that the female is pregnant.

Once a copulatory plug is observed, the female should be monitored for signs of pregnancy such as weight gain. If the plugged female is pregnant, then the day the plug was found is embryonic day zero or E0 and the next day is considered as the first day of gestation, or E1, and so on right up to parturition-that is giving birth-which is between 19 to 21 days. Approximately 20-24 hours post partum, both female rats and mice undergo an estrus and can conceive again.

In an intensive breeding scheme, which is commonly used for animals with a short breeding life span due to a genetic mutation, the male animals are left in the cage with the female and pups, so that the female can conceive another litter immediately. This scheme can be stressful to the female as she is continually lactating and gestating. On the contrary, the non-intensive breeding scheme, involves separating the female once she is visibly pregnant, and not returning her to the male’s cage until her litter has been weaned, making this a less demanding breeding scheme.

There are many factors that can influence the breeding performance of mice and rats. Let’s review some of them, which come up more frequently. The vigor of female breeders largely depends on the level of inbreeding. Animals that are outbred are much more hardy and vigorous, thus they produce larger and stronger litters. Another factor that can affect breeding performance is aggressive behavior. Some commonly used strains, such as C57BL/6 mice, have a tendency to display aggression, which can interfere with breeding. When breeding an aggressive strain, all litters should be closely watched. Animals from a litter containing aggressive pups should not be used for breeding. Temperature, humidity, and lighting fluctuations can cause decreases in breeding efficiency. Noise and vibrations within the breeding rooms have also been shown to cause deleterious effects. Animals with genetic modifications tend to be less hardy and fertile, and some of the mutations may result in lethality of the pups before or soon after birth.

Now let’s briefly review how to wean pups of these lab animals. The time to start weaning differs with the breeding scheme. In case of non-intensive breeding, the young may be weaned at 21-28 days of age. But in case of intensive breeding, the pups of each litter are weaned at day 20 to prevent the older pups from being present when the next litter in born. Since rodents can begin mating as young as 8 weeks, male and female pups are separated at weaning. Whenever possible, newly weaned pups should not be housed singly.

If a litter contains only one pup of a given sex, attempts should be made to house this pup with pups of the same gender from another litter. The possible housing options for weaning pups are listed in the manuscript below. Weanling mice and rats should be checked daily to assure that they are thriving. For food supply, a small amount of food, one pellet per mouse, should be placed on the cage floor for the first 7-10 days, with additional food in the cage top. This will encourage the animals to transition to having rodent chow as their sole food source. For water supply, a bottle should be added even if the animals are housed on racks with automatic watering system. This is to prevent dehydration.

Lastly, let’s see how scientists are using the in-house breeding approach to their advantage. One of the most common applications of setting up mating is to develop mice with altered genotype. To study a gene’s function, researchers often disrupt its genetic code. However, these animals like humans are diploid and thus have two copies of the same gene. Therefore, in order to disrupt the gene completely, the altered mice need to be bred to produce an animal with both copies dysfunctional, in other words a homozygous knockout. Mice with one copy dysfunctional are called heterozygous or hets.

The other advantage of setting up in-house mating is testing the effect of prenatal exposure to test compounds. For example, here researchers provided pregnant female a liquid diet containing alcohol from E7 to E13. Then on E13, they dissected the pregnant female, obtained fetal brains, and sliced them into thin sections. Lastly, staining of the slides revealed that prenatal alcohol exposure increased cell death in the neural tissue.

Finally, in-house breeding also allows for the study of post pregnancy disorders like postpartum depression. In this study, scientists first moved the litter away from the dam during the lactating period. Then, 60 minutes later, reintroduced the pups to the dam. And to induce stress in the female, added a novel male intruder to the cage. Then, the researchers observed the dam for maternal aggression, which includes attacking and biting of the intruder male as well as for different maternal care behaviors like pup grooming, and nursing. The data obtained revealed that stress has a significant effect on both postpartum maternal aggression and care.

You’ve just watched JoVE’s video on fundamentals of breeding and weaning mice and rats in the laboratory. You should now have a better understanding of the rodent estrus cycle and also know how to determine the cycle stage and how to use it to set-up successful mating schemes. We also reviewed the factors that can affect the breeding behavior, and explained how and when to wean mice and rat pups. As always, thanks for watching!

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