Name: Detecção e isolamento de células viáveis rato IL-17 Secretoras de T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprenda a detectar e isolar células TH17 de rato que secretam IL-17 usando ensaio de secreção de citocinas e citometria de fluxo. Este método permite análise em nível de célula única para estudos de imunologia.

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Preparar os Reagentes <ol><li> Faça um buffer contendo PBS com BSA (0,5%), e 2 mM EDTA. Porque as bolhas de ar podem bloquear colunas de separação MACS, o buffer deve ser desgaseificado e armazenado a 2-8 ° C antes do uso. </li><li> Usamos meio RPMI 1640 contendo soro do mouse 5%. O meio de cultura não deve conter BSA ou FCS, uma vez que estes compostos irão alterar a especificidade de estimulação celular. </li><li> A IL-17 Rato Ensaio Secreção - Enriquecimento Celular e Kit de Detecção da Miltenyi Biotec-. O kit contém os seguintes componentes: a IL-17 Reagente Catch, a IL-17 anticorpo de detecção (Biotina), o Anti-Biotina-PE, e as microesferas de Anti-PE. </li></ol> Estimulando a esplenócitos <ol><li> Este protocolo é realizado na presença de um controle negativo e positivo, como esplenócitos unstimulated e um contracoloração para células T. Este protocolo é realizado utilizando técnica estéril. </li><li> Preparar uma suspensão única célula de esplenócitos de camundongo que foram isolados usando o gentleMACS Dissociator ™. A concentração de células deve ser determinada através de contagem das células. Agregar as células em 200 × g por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após centrifugação, aspirar o sobrenadante fora do pellet utilizando uma pipeta. Não decantar o tubo para evitar a perda de sedimento. </li><li> Agora, voltar a suspender as células em meio de cultura e, em seguida, adicionar a um poço. Adicionar média suficiente para uma concentração de 10 milhões de células por mL e cinco milhões de células por centímetro quadrado. </li><li> Para estimular uma resposta imune em nossas células ressuspenso, acrescentamos ionomicina (1 mg / mL) e PMA (10 ng / mL) para a amostra e misture delicadamente a solução pipetando para cima e para baixo. Em seguida, os poços são rotulados em conformidade. </li><li> Agora, vamos incubar nossas células durante 3 horas a 37 ° C sem mistura para iniciar o período de estimulação. Proceder à análise de IL-17 três horas desde o início da estimulação, de modo plano nesse sentido. </li><li> Para interromper a secreção, as células são colocadas em gelo e coletamos as células estimuladas por delicadamente pipetando para cima e para baixo com tampão de frio. Células são então transferidos do bem a um tubo e são lavados uma segunda vez. </li><li> Para garantir que todas as células são coletadas, é uma boa idéia para verificar o seu prato sob um microscópio. Se as células ainda permanecem conectados, você pode coletar as células restantes lavando o prato com tampão de frio. Qualquer aglomerados de células na sua suspensão de células pode ser removido usando os filtros de pré-separação. </li></ol> Rotulagem as células com reagente Trave <ol><li> É fundamental notar, que este teste funciona perfeitamente se inferior a 2% de IL-17 são células secretoras de presente. </li><li> Se a concentração de IL-17 células secretoras deverá ser superior a 2% ajustar volumes em conformidade. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="figura 8" width="500" height="162" /></li><li> Uma armadilha potencial deste procedimento é a contaminação cruzada do Reagente Catch, que pode ocorrer durante a rotulagem quando o anticorpo bi-específico liga-se a uma célula T não secretores e armadilhas IL-17 secretada a partir de um linfócito vizinhos, gerando falsos positivos. </li><li> A fim de contornar este problema, é fundamental para as células esfriar antes de rotulagem e trabalhar com buffer de frio para lenta difusão de IL-17 e evitar essa contaminação cruzada. Além de manter as células frio, eles devem ser mantidos a uma concentração definida. </li><li> Para iniciar o procedimento de rotulagem, usamos 10 milhões de células em um tubo de 15 ml que pode ser fechado. Se os números mais altos de células têm de ser utilizados, simplesmente escala de todos os volumes em conformidade. Uma vez que a concentração celular ideal foi obtida, lave as células, adicionando 10 ml de tampão frio. </li><li> Girar as células em 300 × g por 10 minutos em centrífuga refrigerada (2-8 ° C). </li><li> Após centrifugação, aspirar o sobrenadante completamente usando uma pipeta. Não decantar o sobrenadante, pois isso levará a perda de células e volumes imprecisa. Repita o passo de lavagem, que consiste na adição de 10ml de solução de frio, a centrifugação, e aspiração. </li><li> Agora que temos uma pelota de pureza desejado, ressuspender as células em 80 mL de meio de cultura frio. Para classificá-los, vamos agora adicionar 20 mL de Reagente rato Pegue IL-17. </li><li> Incubar as células por 5 minutos no gelo. </li><li> Após o período de incubação 5 minutos no gelo, retire o tubo e diluir as células em 10 ml de 37 C ° média morna. Em seguida, prenda o tubo na Rotator Tubo MACSmix e incubar os tubos a 37 ° C por 45 min em movimento contínuo. Aumentando a temperatura para 37 ° C vai re-iniciar a secreção de citocinas. </li></ol> Rotulagem as células com IL-17 anticorpo de detecção (Biotina) e Anti-Biotina-PE <ol><li> Após o período de secreção de 45 minutos a 37 ° C, colocar o tubo imediatamente em gelo. Isto irá parar a secreção de citocinas. A partir daqui é fundamental para manter as células no gelo.Trabalhando com tampão frio vai evitar a contaminação cruzada do Reagente Catch. </li><li> Encha o tubo com tampão de frio e centrifugar a 300xg a 2-8 ° C por 10 min. Aspirar o sobrenadante completamente. Repita o passo lavar mais uma vez. </li><li> O pellet celular é ressuspenso em 80 mL de tampão frio eo tubo é colocado sobre o gelo. </li><li> Para evitar a ligação inespecífica do anticorpo, recomendamos a adição de 10μl Reagente FcR Bloqueio e incubar no gelo por 5 min. Então adicionar 20 mL de anticorpo de detecção do rato IL-17 (Biotina), que é conjugado a biotina e incubar por 10 minutos no gelo. </li><li> Mais uma vez, lave as células como fizemos antes, adicionando 10 mL de tampão frio e centrifugar a 300xg a 2-8 ° C por 10 min. </li><li> Agora aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 80 mL de tampão frio. </li><li> Adicionar 20 mL de nosso anticorpo secundário, Anti-Biotina-PE. </li><li> Misture as células e solução de anticorpo secundário, e novamente incubar os tubos durante 10 minutos no gelo. </li><li> Uma vez que esta segunda incubação é completa, lavar as células com 10 mL de tampão fria e centrifugação. </li><li> O pellet pode agora ser ressuspendida em 500 mL de tampão frio. </li><li> Se as células têm que ser separados para análise a jusante, podem ser rotulados com magneticamente Anti-PE-micro e separada manualmente ou automatizado usando MACS Colunas e Separadores de MACS. </li><li> Completamos agora a rotulagem dos esplenócitos e estão prontos para análise. </li></ol> Análise FACS <ol><li> Para nossa análise, vamos comparar os esplenócitos estimulados e desestimulados por citometria de fluxo. </li><li> Antes da análise de citometria de fluxo, as células são coradas com iodeto de propídio a 0,5 mcg / mL para deixar de fora as células mortas. O Analyzer ™ MACSQuant estava carregado com 200.000 células para cada amostra e agora estamos indo olhar os gráficos de dispersão de reatividade de anticorpos relativa nas amostras. Duas considerações importantes para a análise de células raras - como a IL-17 células positivas - por citometria de fluxo são: <ul><li> definição de um portão em linfócitos na dispersão frontal versus gráfico de dispersão lado </li><li> gating e as células mortas (coradas com iodeto de propídio) e células-B (que pode causar coloração de fundo inespecífica) para aumentar ainda mais a sensibilidade de detecção </li></ul></li><li> Usamos CD4-APC anticorpos para detectar células T e os anticorpos CD45R/B220-PerCP de detectar as células B. Nós vemos as propriedades de dispersão para frente e laterais das amostras e aplicar um portão sobre a população de linfócitos. </li><li> Um segundo portão foi aplicada a ver as células mortas e as células manchadas manchado B (eixo Y). Estas células são excluídos da análise de células T. </li><li> Neste exemplo, que é essencialmente nosso controle negativo, podemos ver que há muito poucos IL-17 CD4 T secretoras de células positivas em amostras não estimuladas - cerca de 0,003% (Figura 4). Olhando para a população de células T estimuladas, podemos ver um grande número de células CD4 positivas T que secretam IL-17 - cerca de 0,367% (Figura 5A) antes da separação e 60,76% após a separação magnética com MACS Tecnologia (Figura 5B). </li></ol>

Todos os protocolos e fichas de dados estão disponíveis em www.miltenyibiotec.com. Advertências Os reagentes contêm azida de sódio. Sob condições ácidas azida de sódio produz ácido hidrazóico, que é extremamente tóxico. Os compostos de azida deve ser diluído com água corrente antes de descartar. Estas precauções são recomendadas para evitar depósitos nas canalizações onde se podem desenvolver condições explosivas.

Células TH17 desempenhar um papel integral na imunidade adaptativa e da resposta inflamatória e são um componente fundamental na condução inflamação auto-imune. Este vídeo documenta como usar mouse Miltenyi de IL-17 Assay Secreção - Enriquecimento Celular e Kit de Detecção (PE). Ao fazer este procedimento é importante ter uma estimativa da freqüência de IL-17 em células secretoras de sua preparação célula inicial. A concentração de célula apropriada durante o período de rotulagem e secreção de citoquinas evita a contaminação cruzada por outras células em sua suspensão e garante resultados confiáveis.

<table><tbody><tr><td>Kit de Enriquecimento e Detecção de Células para Ensaio de Secreção de IL-17 de Camundongo (PE)</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Meio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solução de Iodeto de Propídio</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Reagente Bloqueador de FcR, camundongo</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit de Remoção de Células Mortas</td><td>Reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de Tubos MACSmix</td><td>Instrumento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dissociador gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Instrumento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit Inicial autoMACS Pro</td><td>Instrumento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Colunas MACS</td><td>Ferramenta</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Separador MACS</td><td>Ferramenta</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detecção e isolamento de células viáveis ​​rato il-17 secretoras de t

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

O MACS citocinas tecnologia Assay Secreção permite a detecção de citocinas secretadas no nível única célula e isolamento sensível viável células secretoras de citocinas. Para rotular IL-17 células secretoras de uma suspensão única célula de esplenócitos mouse está preparado e estimulado a 37 ° C com PMA / ionomicina para induzir a secreção de citocinas. Para parar células secreção são então colocados em gelo e são expostos à IL-17 Reagente Catch a anticorpos bi-específicos que se liga ao CD45 na superfície celular dos leucócitos e IL-17, uma vez que é secretada e pegou perto da superfície da célula. Secreção é então re-iniciados, aumentando a temperatura para 37 ° C e IL-17 é preso pelo reagente Catch. Secreção é, então, parou de novo, colocando as células no gelo. Para detectar a IL-17 presos, as células são incubadas com IL-17 específicos segundo anticorpo conjugado a biotina e um anticorpo anti-biotina-PE. Células podem agora ser analisadas diretamente por citometria de fluxo ou preparados para isolamento e enriquecimento através da rotulagem posterior com Anti-PE microesferas conjugados.

Este procedimento descreve a detecção e isolamento de leucócitos do mouse TH17 que ativamente secretam IL-17 com a estimulação.

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

A tecnologia do MACS Cytokine Secretion Assay permite a detecção de citocinas secretadas ao nível de célula única e o isolamento sensível de células viáveis...

A tecnologia do ensaio de secreção de citocinas max permite a detecção de citocinas secretadas no nível de célula única e o isolamento sensível de células viáveis que secretam citocinas, com o objetivo de rotular células que secretam IL-17. Uma suspensão de células únicas de leucócitos de camundongo é preparada e estimulada a 37 graus Celsius com PMA e ionomicina para induzir a secreção de citocinas e, em seguida, interromper a secreção. As células são então colocadas sobre gelo, onde são expostas ao reagente capturador de IL-17.Uma vez que a secreção é reiniciada pelo aumento da temperatura para 37 graus Celsius, a IL-17 é retida pelo reagente capturador. Um anticorpo biespecífico que se liga ao CD45 na superfície celular dos leucócitos e à IL-17 à medida que ela é secretada e capturada perto da superfície celular é então interrompido novamente colocando as células no gelo. Para detectar as células com IL-17 retida, as células são incubadas com um segundo anticorpo específico para IL-17 conjugado à biotina e com um anticorpo anti-biotina conjugado a PE. As células agora podem ser analisadas diretamente por citometria de fluxo ou preparadas para isolamento e enriquecimento mediante rotulagem subsequente com microesferas conjugadas a anti-PE. Olá, meu nome é Ellie Rankin, uma das cientistas da Mill Tenney Biotech.Hoje vou mostrar a vocês um procedimento para isolar e detectar leucócitos TH17, que, quando estimulados, secretam IL-17. A IL-17 desempenha um papel importante na imunidade adaptativa e na resposta inflamatória, além de ser relevante para o desenvolvimento da inflamação autoimune. Vou mostrar como o ensaio é realizado. Para o protocolo de hoje, precisamos primeiro preparar um tampão contendo PBS com BSA e EDTA 2 milimolar, pois bolhas de ar podem obstruir as colunas de separação magnética; portanto, o tampão precisa ser desgaseificado e armazenado entre 2 e 8 graus Celsius antes do uso.Em segundo lugar, utilizamos o meio RPMI 1640 contendo 5% de soro de camundongo. O meio de cultura não deve conter BSA ou soro bovino fetal (FCS), pois esses compostos alterarão a especificidade da estimulação celular. Por fim, você precisará do kit de enriquecimento e detecção de células para ensaio de secreção de IL-17 de camundongo da MIL 10 E Biotech.O kit contém os seguintes componentes: o reagente captador de IL-17, o anticorpo de detecção de IL-17, biotina, o anti-biotina PE e os microesferas anti-PE. Logicamente, você provavelmente realizará este protocolo com um controle negativo e um positivo, como células não estimuladas, PLE cíticas e uma coloração de contraste para linfócitos T. Para nossa demonstração, focaremos apenas nas células estimuladas.Este protocolo será realizado utilizando técnica estéril. Nosso protocolo começa com uma suspensão de células isoladas de espermátides de camundongo obtidas usando o dissociador gentle max. A concentração de células deve ser previamente determinada por contagem celular.Pelotize as células a 200 Gs durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, aspiramos o sobrenadante do pellet utilizando uma pipeta. Não decante o tubo para evitar perda do pellet. Agora, as células devem ser ressuspendidas em nosso meio de cultura e, em seguida, adicione meio suficiente para uma concentração de 10 milhões de células por mililitro e 5 milhões de células por centímetro quadrado.Para estimular uma resposta imune em nossas células ressuspendidas, adicionamos ionomicina e PMA à amostra e misturamos a solução pipetando suavemente para cima e para baixo. Em seguida, as poças são rotuladas adequadamente. Agora, incubaremos por três horas a 37 graus Celsius, sem mistura, para iniciar o período de estimulação.Prossiga para a análise de IL-17 três horas após o início da estimulação. Portanto, planeje-se adequadamente. Aqui observamos células do baço de camundongo estimuladas.Observe a morfologia distinta e o agrupamento celular das células estimuladas. Para maior clareza, seguiremos apenas as células estimuladas. A partir daqui, para interromper a secreção, coletamos as células estimuladas pipetando suavemente para cima e para baixo.Com o tampão frio, as células são então transferidas do poço para um tubo e lavadas uma segunda vez. Para garantir que todas as células sejam coletadas, é recomendável verificar sua placa sob um microscópio. Caso ainda haja células aderidas, você pode coletar as células remanescentes lavando a placa.Com tampão frio, quaisquer agregados celulares na sua suspensão celular podem ser removidos utilizando os filtros de pré-participação. Uma possível armadilha desse procedimento é a contaminação cruzada do reagente de captura, que pode ocorrer durante a marcação. Quando o anticorpo biespecífico se liga a um linfócito T não secretor e captura a IL-17 secretada por um linfócito vizinho, gerando assim resultados falsos positivos, para contornar esse problema, é essencial resfriar as células antes da marcação e trabalhar com tampão frio para limitar a secreção e retardar a difusão da IL-17 e evitar essa contaminação cruzada.É fundamental observar que a contaminação cruzada também pode ocorrer se houver mais de 2% de células secretoras de IL-17. Se a concentração de células secretoras de IL-17 for superior a 2%, ajuste os volumes adequadamente. Portanto, além de manter as células frias, é necessário mantê-las em uma concentração definida.Para iniciar o procedimento de marcação, utilizamos 10 milhões de células em um tubo fechável de 15 mililitros. Se for necessário usar um número maior de células, basta aumentar proporcionalmente todos os volumes. Uma vez obtida a concentração ideal de células, lave-as adicionando 10 mililitros de tampão frio.Agora, centrifugue as células a 300 Gs durante 10 minutos em uma centrífuga refrigerada. Após a centrifugação, aspire completamente o sobrenadante utilizando uma pipeta. Não decante o sobrenadante, pois isso causará perda celular e volumes imprecisos. Repita a etapa de lavagem, que consiste em adicionar 10 mililitros de tampão frio, centrifugação e aspiração.Agora que temos um pellet com a pureza desejada, re-suspenda as células em qualquer quantidade de microlitros de meio de cultura frio para rotulá-las. Agora adicionaremos 20 microlitros do reagente captador de IL-17 de camundongo. Incube as células por cinco minutos em gelo.Após o período de incubação de cinco minutos no gelo, retire o tubo e dilua as células em 10 mililitros de meio aquecido a 37 graus Celsius. Em seguida, fixe o tubo no rotador de tubos máximo e incube o tubo a 37 graus Celsius por 45 minutos.Em movimento contínuo, aumentar a temperatura para 37 graus Celsius reiniciará a secreção de citocinas após o período de secreção de 45 minutos a 37 graus Celsius. Coloque o tubo imediatamente no gelo. Isso interromperá a secreção de citocinas.A partir daqui, é fundamental manter as células sobre gelo. Trabalhar com tampão frio evitará a contaminação cruzada do reagente de captura. Encha o tubo com tampão frio e centrifugue a 300 Gs a dois a oito graus Celsius por 10 minutos.Aspire completamente o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem mais uma vez. O pellet celular é ressuspenso em 80 microlitros de tampão frio e o tubo é colocado no gelo.Para evitar a ligação não específica do anticorpo, recomendamos a adição de 10 microlitros do reagente bloqueador FCR e incubação no gelo por cinco minutos. Em seguida, adicionamos 20 microlitros do anticorpo de detecção de IL-17 de camundongo conjugado à biotina e incubamos por 10 minutos no gelo. Mais uma vez, lavamos as células como feito anteriormente, adicionando 10 mililitros de tampão frio e centrifugando a 300 Gs a dois a oito graus Celsius por 10 minutos.Agora aspire e ressuspenda o pellet celular em 80 µL de tampão frio e adicione 20 µL do nosso anticorpo secundário. Anti-biotina PE. Misture as células e a solução de anticorpo secundário e, novamente, incube o tubo por 10 minutos no gelo.Após a conclusão da segunda incubação, lave as células com 10 mililitros de tampão frio e centrifugue. O pellet pode agora ser ressuspenso em 500 microlitros de tampão frio. Se as células precisarem ser separadas para análises downstream adicionais, elas podem ser marcadas magneticamente com microesferas anti-PE e separadas manualmente ou de forma automatizada utilizando colunas Max e separadores Max.Concluímos agora a marcação de nossos esplócitos e estamos prontos para a análise. Compararemos os esplócitos estimulados e não estimulados por citometria de fluxo antes da execução. As células viáveis são coradas com iodeto de propídio a 0,5 microgramas por mililitro para excluir as células mortas.O citômetro de fluxo foi carregado com 200.000 células para cada amostra e agora vamos analisar os gráficos de dispersão da reatividade relativa dos anticorpos nas amostras. Duas considerações importantes para a análise de células raras, como células positivas para IL-17, por citometria de fluxo são: definir uma porta sobre linfócitos no gráfico de dispersão para frente versus dispersão lateral e excluir as células mortas marcadas com iodeto de propídio e as células B, que podem causar marcação de fundo inespecífica. A fim de aumentar ainda mais a sensibilidade da detecção.Aqui utilizamos um anticorpo anti-CD4 A PC para detectar células T no anticorpo CD45 RB 220 per CP. Para detectar as células B, analisamos as propriedades de dispersão para frente e dispersão lateral das amostras e aplicamos um gateamento sobre a população de linfócitos. Um segundo gateamento foi aplicado para observar as células mortas marcadas e as células B marcadas no eixo Y.Essas células são excluídas da análise de linfócitos T. Neste exemplo, que é essencialmente nosso controle negativo, podemos observar que há muito poucas células T CD4 positivas secretoras de IL-17 em amostras não estimuladas, aproximadamente 0,003%. Ao analisar a população de linfócitos T estimulada, podemos ver um número considerável de células T CD4 positivas que secretam IL-17, cerca de 0,367% antes da separação e 60,76% após a separação magnética com tecnologia MACS. Acabamos de mostrar a você, por meio de documentação em vídeo, como utilizar o kit de ensaio de secreção de IL-17 para camundongo da Miltenyi Biotec para enriquecimento e detecção celular usando PE.A parte mais importante deste procedimento é ter uma ideia da frequência de células secretoras de IL-17 presentes na população inicial. A concentração correta de células garantirá que a marcação e o período de secreção de citocinas tenham menos contaminação cruzada, assegurando assim resultados confiáveis. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo ilustra um método para isolar células T natural killer invariantes, também conhecidas como células iNKT. O procedimento começa com a injeção de um glicolipídio sintético em um camundongo para estimular a ativação e proliferação de células iNKT no baço. Posteriormente, suspensões unicelulares são preparadas a partir do baço e incubadas com complexos de reconhecimento de células iNKT marcados com fluoróforos, seguidos de separação baseada em esferas magnéticas, para isolar as células...

Isolando células T assassinas naturais invariantes de um modelo de camundongo

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

A análise in vitro da recombinação de troca de classe em camundongos é desafiadora devido às moléculas de IgE citofílicas ligadas aos receptores Fc na superfície das células B.  Descrevemos um método para detecção de IgE usando clivagem mediada por tripsina de IgE ligada à superfície antes da fixação e permeabilização para coloração de fluorescência citoplasmática.

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

As células T CD4+ virgens polarizam para vários subconjuntos, dependendo do ambiente no momento da ativação.  A diferenciação de células T CD4+ virgens em vários subconjuntos efetores pode ser alcançada in vitro através da adição de estímulos de receptores de células T e sinais específicos de citocinas.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Aqui, descrevemos um protocolo para analisar o fenótipo de células T reguladoras (Treg) isoladas de camundongos infectados pelo vírus da coriomeningite linfocítica ingênua e crônica. Além disso, fornecemos um processo para avaliar a atividade supressora das células Treg.

Fenotípica e análise funcional de células reguladoras T ativadas isolados de ratinhos infectados com o vírus da coriomeningite linfocítica crônica

Descrevemos aqui um modelo de camundongo repórter transgênico para visualizar as células produtoras de IL-22 dentro de diferentes tecidos de camundongos. Este método pode ser usado para rastrear a localização de outras citocinas ou proteínas secretas no camundongo.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Este artigo descreve protocolos de avaliação da resposta Tfh e GC B no modelo de camundongos de infecção por vírus influenza.

Avaliação de células auxiliares tolas e resposta do centro germinal durante a infecção pelo vírus da influenza A em camundongos

As células linfoides inatas do grupo 2 (ILC2s), implicadas na inflamação do tipo 2, participam principalmente da resposta à infecção por helmintos, doenças alérgicas, homeostase metabólica e reparo tecidual. Neste estudo, é demonstrado um procedimento para isolar ILC2s da mucosa nasal murina e detectar a expressão de CD226.

Isolamento de Células Linfoides Inatas do Grupo 2 da Mucosa Nasal de Camundongos para Detecção da Expressão de CD226

Este protocolo descreve a diferenciação de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas in vitro. Especificamente, quando combinado com uma abordagem baseada em citometria de fluxo multiparâmetro, 90% de pureza de células Th17 patogênicas podem ser obtidas de células T CD4 + virgens usando este método de diferenciação.

Diferenciação in vitro de células T CD4+ virgens em células Th17 patogênicas em camundongos

O presente estudo apresenta protocolos para avaliar o compromisso de destino precoce de células TFH específicas do vírus e manipular a expressão gênica nessas células.

Acesso à diferenciação precoce de células T CD4+ foliculares específicas de vírus em camundongos infectados por LCMV agudo

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

Aprenda a detectar e isolar células TH17 de rato que secretam IL-17 usando ensaio de secreção de citocinas e citometria de fluxo. Este método permite análise em nível de célula única para estudos de imunologia.

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

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