Biodistribuição de Nano-fármacos Transportadores: Aplicações de MEV

1. Injeção de nanopartículas e colheita de órgãos

1. Injete nanopartículas em um rato anestesiado por via intravenosa para permitir o direcionamento passivo.
2. Nos pontos de tempo desejados, ou seja, 1, 4 e 8 semanas, pós-injeção, eutanásia humana dos camundongos de acordo com as Diretrizes da American Veterinary Medical Association (AVMA).
3. Abra a cavidade corporal e remova cirurgicamente os órgãos de interesse. Coloque os órgãos em formalina tamponada de fosfato de 10% em um recipiente de polipropileno até a preparação da amostra.

2. Preparação da amostra de tecido

1. Use fórceps para transferir o tecido do rato do fixador para salina tamponada de fosfato (PBS). Balance a amostra por 30 minutos, substituindo o PBS a cada 10 minutos.
2. Retire o tecido e seque com um kimwipe. Em seguida, coloque-o em um molde plástico contendo o composto de temperatura de corte ideal (OUT). Armazene a -80 °C durante a noite.
3. No dia seguinte, transfira a amostra para o criostat e adefina a temperatura para -23 °C.
4. Rotular slides com o tipo de órgão e tamanho de nanopartículas, e colocá-los em uma prateleira no criostat.
5. Cubra o mandril criostat com OCT e coloque a amostra em cima. Abaixe o êmbolo extrator sobre a amostra e deixe-o equilibrar por 3-5 min.
6. Monte o mandril no suporte do espécime e oriente-o para que a lâmina possa cortar em linha reta através da amostra congelada. Leve a amostra para perto da lâmina para enfrentar o áspero. Coloque a espessura em 30 μm e corte várias seções até que uma fatia cortada uniformemente seja produzida.
7. Mude para uma frente fina, diminuindo a espessura da seção para 7-8 μm. Colete uma seção fatiada pressionando um deslizamento de vidro rotulado na fatia. Coloque dois slides em cada slide e armazene em um rack de slides. Deixe secar à temperatura ambiente.
8. Uma vez seco, desidrate as amostras mergulhando o rack de slides em 50% de etanol por 3 minutos para remover oct. Em seguida, transfira o rack para 80% de etanol por 3 min antes de colocar o rack em uma proporção de 1:1 de metanol frio para acetona por 10 min a -20 °C.
9. Remova o rack de slides e escorra o excesso de solvente em uma toalha de papel. Depois de 20-30 min, coloque os slides em uma caixa de slides e guarde em um congelador a -20 °C até a imagem.

3. Imagem de alta resolução usando SEM e EDS

1. Prepare a amostra conforme descrito em "SEM Imaging of Biological Samples". Em seguida, carregue a amostra no SEM.
2. Ligue o SEM e ajuste a distância de trabalho para cerca de 5 mm e a tensão acelerada e a corrente de feixe para 25 keV, que normalmente seria muito alta para uma amostra biológica. No entanto, a amostra é revestida para condutividade e proteção.
3. Inicie a imagem e amplie em torno de 1.000-2.000X de ampliação para ver as estruturas que conteriam as nanopartículas. Observe que, sem a detecção de dispersão traseira (BSD), não se pode distingui-los abaixo de uma determinada profundidade.
4. Insira o BSD sob os mesmos parâmetros e mova o estágio na direção z para a mesma distância de trabalho de antes.
5. Comece a fotografar em torno da mesma ampliação e verifique se você é capaz de ver alto contraste na presença de nanopartículas. Guarde as imagens.
6. Use diferentes configurações de BSD (onde as cargas no detector se alinham) para escolher a que mostra o maior contraste para as nanopartículas.
7. Zoom-in em uma área de alto contraste mostrando uma nanopartícula ou aglomerado de nanopartículas.
8. Abra a^2ª câmera da câmara e observe enquanto você insere o EDS no sistema pressionando o botão para baixo no acessório SEM. Uma vez que o EDS esteja perto, mas não tocando no BSD ou na arma, solte o botão.
9. Abra o programa asteca no computador EDS (ainda na estação de trabalho) e adquira uma imagem do SEM. Use o método "ponto e tiro" para clicar em uma área muito densa em contraste e nanopartículas.
10. O EDS mostrará o espectro de raios-X característicos a partir desse ponto. Procure por picos de bário e titânio para serem identificados no gráfico. Isso confirma que o que você está olhando são de fato as nanopartículas e não qualquer tipo de contaminação.
11. Retorne à amostra e use o software Atlas para mapear as bordas do órgão no slide. Selecione o protocolo "Órgão" para criar uma imagem de mosaico da área e deixe-o funcionar (isso pode levar algumas horas no máximo).
12. Uma vez que a imagem composta é criada e costurada pelo software, exporte-a como um arquivo Tif.
13. Abra o arquivo Tif no ImageJ, um software de código aberto, e ajuste os valores de limiar de contraste para destacar as áreas de contraste muito alto (ou seja, as nanopartículas). Use funções incorporadas para quantificar o volume de nanopartículas usando o tamanho do pixel definido no protocolo do Órgão (deve ser em torno de 100 nm).
14. Embora este procedimento se refira apenas à amostra de 1 semana do pulmão do camundongo, este procedimento é repetido com as amostras de outras semanas e outros órgãos para compilar um gráfico mostrando a distribuição.
15. Após o cálculo da bioco distribuição de cada órgão para cada semana, os gráficos de biodistribução mostrarão as mudanças na biodistribução e concentração de nanopartículas ao longo das 8 semanas. Estes mostram o pico de concentração e também fornecem informações sobre quanto tempo leva para as nanopartículas se dissiparem do órgão.