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A microscopia é um método amplamente utilizado para obter imagens da estrutura detalhada das amostras. Os microscópios ópticos, que focalizam a luz através de uma série de lentes para ampliar as amostras, estão em uso há séculos, com o primeiro microscópio composto aparecendo no século 17. Durante esse tempo, Antonie van Leeuwenhoek foi o primeiro a observar bactérias, leveduras, glóbulos vermelhos e circulação nos vasos capilares, fazendo contribuições científicas significativas e abrindo caminho para avanços microscópicos.
Os microscópios ópticos ainda são amplamente utilizados hoje em ambientes clínicos e de pesquisa para diagnóstico médico. No entanto, nos últimos 60 anos, surgiu a microscopia confocal, que ilumina a amostra através de um orifício para aumentar a resolução óptica e o contraste.
Este vídeo ilustrará os princípios operacionais da microscopia óptica e confocal, demonstrará como as imagens de alta resolução são analisadas e discutirá várias aplicações da microscopia no campo da engenharia biomédica.
Vamos começar discutindo os fundamentos da microscopia confocal. A microscopia óptica é baseada no princípio de focalizar a luz em uma amostra para obter imagens de sua estrutura detalhada. Um microscópio é formado por dois componentes de ampliação; a lente objetiva, que focaliza uma imagem real de um objeto, e a ocular, que focaliza uma imagem virtual ampliada antes de ser recebida pelo olho. A ampliação total é obtida multiplicando as ampliações dessas duas lentes.
A focagem da luz fornece um plano de foco especificado onde a ampliação e a luz da lâmpada se encontram no mesmo ponto, o que fornece a melhor resolução na imagem. Quando fora do plano focal, a área de iluminação é maior e os feixes de luz interferem de outras partes da amostra, fazendo com que a imagem fique borrada. Onde os microscópios de luz iluminam e visualizam toda a amostra em vista, um microscópio confocal utiliza um orifício entre o estágio da amostra e o detector para que apenas um pequeno feixe de luz seja focado em uma profundidade estreita de cada vez.
Consequentemente, a única área visível da amostra é o ponto de foco, fornecendo uma imagem bem resolvida. No entanto, com resolução mais alta, apenas uma pequena parte dessa amostra é fotografada por vez. Ao mover a amostra no plano XY, uma varredura raster de sua superfície pode ser realizada. Para cada ponto da varredura, o foco é otimizado ajustando a altura Z para acessar diferentes planos focais. Isso garante uma resolução máxima ponto a ponto da amostra de imagem.
Agora vamos usar esses princípios de microscopia e resolução de imagem para obter imagens de um cérebro de camundongo usando um microscópio confocal e óptico.
Tendo revisado os princípios básicos da microscopia, vamos agora realizar uma medição usando um microscópio confocal. Primeiro, ligue o microscópio na estação de trabalho do computador. Em seguida, carregue a amostra no palco e centralize-a sob a lente. Agora abra o software de imagem e selecione criar novo trabalho. Vá para a coluna da topografia e escolha o botão assistente. Selecione a ampliação mais baixa, que para este microscópio, é de 2,5x. Em seguida, use o manipulador de microscópio 3D para ajustar a posição Z da amostra e colocar a amostra em foco. Pressione o botão na lateral para que uma luz azul apareça nas bordas. Isso permite movimento e foco Z mais finos. Agora capture uma imagem de visão geral.
Aumente lentamente a ampliação da lente e ajuste a intensidade da luz e o foco para obter a ampliação desejada. Use o manipulador 3D nas direções X e Y para selecionar diferentes áreas de interesse na amostra. Depois que uma imagem for tirada com baixa ampliação, pressione avançar para obter um ponto de referência. Use o ponto de referência padrão ou especifique um novo no canto da amostra e pressione avançar. Agora, altere gradualmente o objetivo para a resolução desejada para a amostra. Para esta amostra, uma objetiva de 20x é usada para visualizar as células no tecido cerebral do camundongo. Certifique-se de que há espaço para diminuir a distância de trabalho.
Para definir a distância para coletar fatias, primeiro vá para a página de definição da faixa de medição e use o manipulador 3D para finalmente ajustar a amostra na direção Z. Clique em definir por último quando a parte superior da amostra estiver em foco e clique em definir primeiro quando a parte inferior da amostra estiver em foco. Certifique-se de que o número de fatias calculadas não exceda 1.000 ou o programa falhará. Verifique se não há pixels vermelhos, o que indica que a intensidade da luz está supersaturada.
Por fim, pressione concluído para obter a imagem da tomografia. Quando o software de tomografia abrir, selecione a guia de estudos para visualizar os dados em 3D e fazer medições 2D e 3D.
Agora vamos tirar uma imagem usando um microscópio óptico digital. Primeiro, ligue o microscópio e abra o software de imagem. Em seguida, carregue a amostra no palco e centralize-a sob a lente. Quando o software de imagem estiver aberto, selecione um trabalho na lista de modelos ou escolha o exame gratuito. Em seguida, adquira uma imagem de visão geral que mostre todo o estágio. Use o controlador para alterar o foco e a posição da imagem.
Quando a aquisição estiver concluída, coloque um sistema de coordenadas na imagem. O sistema de coordenadas padrão está no meio do palco. Para maior flexibilidade, as coordenadas podem ser alteradas manualmente.
Em seguida, nomeie a amostra e selecione o botão da câmera. Pressione o botão ao vivo enquanto navega pela amostra e mova o foco para baixo até que a amostra esteja claramente em foco. Se necessário, use a guia de iluminação e abertura para ajustar a iluminação. Em seguida, adquira uma imagem da amostra.
Use as ferramentas no painel de otimização de imagem, como a inclinação da lente, os níveis de iluminação na amostra e o brilho e contraste na imagem para otimizar a imagem para a nitidez desejada. Agora toque na ferramenta lápis para realizar medições. Use as ferramentas de distância e área para medir o tamanho das células na amostra.
Por fim, vá para a guia de fluxo de trabalho de resultados e configure o layout do relatório. Toque no botão salvar para salvar o trabalho para análise posterior.
Agora vamos analisar as imagens de um cérebro de camundongo que foram tiradas com microscópios ópticos confocais e digitais. A imagem confocal com ampliação de 50x é de alta resolução e fornece foco profundo com diferentes níveis de profundidade de informação.
No mapa tomográfico, a altura dessa amostra varia de um a nove mícrons. Características como amplitude, perfil de rugosidade e parâmetros de curva podem ser analisadas posteriormente. No entanto, toda a lâmina do tecido cerebral seccionado pode ser visualizada usando um microscópio óptico digital.
O zoom em uma seção mostra mais detalhes da amostra, mas com uma resolução muito menor do que a obtida com o microscópio confocal. Esta amostra foi obtida com aumento de 300x. O software dedicado oferece ferramentas para medir as dimensões da seção transversal, como o diâmetro, bem como para calcular a área interna da seção.
A microscopia digital, óptica e confocal são ferramentas padrão usadas em várias aplicações biomédicas. A oftalmoscopia a laser de varredura ou SLO é uma técnica de imagem não invasiva amplamente utilizada em oftalmologia clínica para diagnosticar e monitorar o desenvolvimento de doenças da retina.
O SLO produz imagens estereoscópicas de alto contraste que visualizam a microglia. Os macrófagos residentes da retina, que estão envolvidos em várias doenças da retina. A microscopia confocal também é usada em imagens de células vivas, o que permite aos pesquisadores visualizar a função microscópica das células biológicas em tempo real.
Esta técnica é usada para estudar a migração e proliferação celular e a dinâmica de proteínas, entre outros. Aqui, os receptores transmembranares e lisossomos foram marcados com corantes fluorescentes e sua colocalização foi analisada usando imagens de lapso de tempo para investigar a internalização do receptor.
Você acabou de assistir à introdução da JoVE à microscopia digital, óptica e confocal. Agora você deve entender os princípios de microscopia e resolução de imagem, como operar microscópios ópticos e confocais para obter imagens de amostras biológicas e várias aplicações de seu uso no campo da engenharia biomédica.
Obrigado por assistir.
