Imageamento por MEV de Amostras Biológicas

A microscopia eletrônica de varredura, ou SEM, é frequentemente usada para obter imagens de materiais biológicos em escala nano. Os microscópios ópticos, que usam luz para obter imagens de uma amostra, são muito usados para obter imagens não destrutivas de amostras biológicas, no entanto, sua resolução e profundidade de campo são limitadas, portanto, o SEM é usado para obter uma resolução mais alta de até um nanômetro.

No SEM, um feixe de elétrons é focalizado através de uma série de lentes condensadoras, que então atingem a amostra. Quando o feixe atinge a amostra, os elétrons na superfície são espalhados e medidos pelo detector.

Neste vídeo, discutiremos como o SEM funciona, demonstraremos como obter imagens de uma amostra biológica em laboratório e, finalmente, apresentaremos algumas técnicas usadas para obter imagens de amostras sensíveis.

Um microscópio eletrônico de varredura usa um feixe de elétrons de alta energia, que é gerado por um canhão de elétrons equipado com um cátodo de filamento. Os elétrons gerados são impulsionados em direção ao ânodo e, em seguida, focados usando lentes condensadoras antes de entrar na lente objetiva. A lente objetiva é calibrada para focar o feixe na amostra, onde é escaneado pela superfície. As interações dos elétrons com os átomos na amostra são usadas para estudar a topografia, composição elementar e cristalinidade da amostra. Quando o feixe de elétrons incidente atinge a superfície, ele emite elétrons secundários e retroespalhados. Os elétrons secundários são elétrons de baixa energia que são emitidos da amostra perto da superfície e fornecem informações topográficas.

Os elétrons retroespalhados, por outro lado, são refletidos na direção oposta do feixe incidente. A intensidade da interação aumenta com o aumento do peso atômico, permitindo ao usuário distinguir diferenças de composição. É necessária uma consideração especial para obter imagens de amostras biológicas com MEV, uma vez que o MEV utiliza um alto vácuo, portanto, as amostras biológicas, que normalmente têm um alto teor de água, devem ser secas primeiro. Isso pode causar colapso da estrutura de amostras sensíveis, especialmente células. Assim, as células são tratadas com um fixador, enxaguadas e depois desidratadas lentamente, lavando com quantidades crescentes de etanol.

Para materiais biológicos rígidos, como o andaime de tecido de colágeno-hidroxiapatita usado nesta demonstração, a amostra é seca por um período de vários dias sob alto vácuo.

Finalmente, como a imagem SEM típica requer uma superfície condutora, as amostras biológicas geralmente são revestidas com uma fina camada de metal antes da imagem. Agora que discutimos como o SEM funciona e como preparar uma amostra biológica para imagem, vamos dar uma olhada em como preparar e obter imagens de um andaime de tecido de colágeno-hidroxiapatita.

Primeiro, monte a amostra de biomaterial em um stub SEM usando fita de carbono condutora e certifique-se de que a amostra esteja seca e sem contaminação na superfície.

Em seguida, coloque a amostra montada na câmara de um revestidor por pulverização catódica, bombeie a câmara e cubra a amostra por cerca de 40 segundos para obter uma camada fina de metal de quatro a seis nanômetros de espessura, neste caso ouro, com cobertura adequada. Uma vez revestido, remova a amostra e use fita condutora para conectar o toco ao topo da amostra, que agora está revestida com metal condutor.

Por fim, monte o stub no SEM stage e aperte o parafuso na lateral. Agora, o exemplo está pronto para ser criado com SEM. Primeiro, carregue o stage na câmara SEM e sele a porta, depois aperte o botão de transferência para abrir a passagem da câmara de carregamento para o vácuo. Assim que a porta interna estiver aberta, aparafuse a haste de metal no stage e empurre a amostra para dentro da câmara de vácuo, depois desparafuse a haste de metal e retraia-a totalmente para dentro da câmara de carga e, em seguida, pressione armazenar para fechar a câmara de vácuo.

Agora vamos criar a imagem da amostra usando SEM.

Primeiro, mova o palco usando o controlador e navegue a amostra para o campo de visão e, em seguida, mova a amostra verticalmente até que a distância de trabalho seja de cinco a 10 milímetros. Ligue o feixe de elétrons e selecione o detector de elétrons secundários, defina o feixe para cinco quiloelétron-volts inicialmente e, em seguida, aumente até 20 a 30 quiloelétron-volts conforme necessário. Se a imagem não estiver nítida, gire os botões de foco, brilho e contraste até que uma imagem nítida apareça.

Use a navegação do estágio e as direções X e Y para localizar um novo ponto na amostra e, em seguida, aumente a ampliação até que os recursos desejados fiquem visíveis. Ajuste o foco, o contraste e o brilho conforme necessário para melhorar a qualidade da imagem. Pode ser necessário diminuir a velocidade de digitalização e ativar a média de linha para obter uma imagem melhor e, em seguida, salvar a imagem.

As imagens SEM revelam uma estrutura altamente tridimensional e porosa com características fibrosas menores que 25 mícrons. Esses recursos seriam difíceis de visualizar usando microscopia óptica, pois a microscopia óptica tem uma profundidade de campo muito menor.

Existem muitos desafios associados à imagem de estruturas biológicas com MEV, incluindo colapso da estrutura ou danos causados pelo feixe de elétrons de alta energia. Vamos agora dar uma olhada em como a técnica geral de SEM é aplicada a esses tipos de amostras sensíveis. Estruturas biológicas delicadas, como esses tecidos vegetais jovens, ou aquelas com alto teor de água, devem ser tratadas por meio de um processo de fixação antes da imagem.

Esses meristemas florais foram imediatamente tratados com uma solução fixadora de formalina/ácido acético recém-preparada. O tecido fixado foi dissecado em etanol, colocado em um recipiente de tela e desidratado por meio de uma série de etanol de 70%, 80%, 90% e 100% de etanol. Finalmente, os tecidos vegetais foram secos usando um secador de ponto crítico, montados e revestidos com um fino revestimento de metal.

Após a imagem de MEV, fica claro que as estruturas não tratadas foram fortemente danificadas pelo processo de secagem e apresentaram um colapso considerável na estrutura, enquanto as que foram fixadas mantiveram sua estrutura nativa. Alternativamente, células e outros espécimes com alto teor de água podem ser fotografados usando SEM ambiental ou ESEM. O ESEM utiliza um feixe de elétrons de alta energia que é varrido sobre a amostra, como no SEM convencional, no entanto, permite a imagem de amostras úmidas ou não revestidas, mantendo um ambiente gasoso dentro da câmara.

Isso é feito separando a câmara de alto vácuo contendo o canhão de elétrons da câmara de amostra usando duas aberturas. O feixe de elétrons incorre em perdas significativas devido ao espalhamento por moléculas de gás, mas normalmente é uma energia alta o suficiente para a geração de imagens. Aqui, as células foram cultivadas em um chip de silício, funcionalizadas com pontos quânticos e fixadas usando um protocolo de fixação de glutaraldeído. As células foram fotografadas na água e mostram a estrutura não colapsada da célula com pontos quânticos individuais visíveis na superfície da célula.

Você acabou de assistir à introdução da JoVE à visualização de biomateriais usando SEM. Agora você deve entender como funciona o SEM, como as amostras biológicas são preparadas e fotografadas, bem como algumas aplicações da técnica para estruturas sensíveis.

Obrigado por assistir!