Imunohistoquímica e imunocitoquímica: imageamento de tecidos via microscopia de luz

Imunocitoquímica e imuno-histoquímica são métodos de coloração para uma proteína de interesse em células e tecidos cultivados, respectivamente. O princípio básico de ambas as técnicas relacionadas envolve o uso de anticorpos específicos marcados com um sistema de detecção para identificar e visualizar a proteína e determinar sua localização dentro das células e tecidos, bem como os níveis relativos. O processo em qualquer experimento começa com a preparação da amostra.

Para imunocitoquímica, que visualiza especificamente a localização de proteínas ou antígenos nas células, isso envolve três etapas. O primeiro passo é o revestimento, que envolve a cultura das células em meio de crescimento em uma lamínula ou lâmina, normalmente, nos poços de uma placa de cultura. Isso é seguido pela fixação, onde um agente precipitante ou reticulante como o paraformaldeído é adicionado às células para preservar a integridade estrutural das proteínas e evitar que a atividade enzimática as degrade. A última etapa é a permeabilização, que envolve a adição de um detergente para tornar as membranas celulares permeáveis à coloração.

No método de contrapartida, imuno-histoquímica, proteínas ou antígenos são visualizados nos tecidos e o preparo da amostra tem cinco etapas. Primeiro, todo o tecido é submetido à fixação, geralmente com paraformaldeído. Isso é seguido pela incorporação do tecido em um bloco de parafina e, em seguida, seccionamento desse bloco usando uma máquina chamada micrótomo para cortar o tecido em fatias finas que podem ser colocadas em lâminas. Em seguida, as lâminas são submetidas à desparafinização ou remoção da parafina ao redor da fatia de tecido. Em seguida, uma etapa opcional de recuperação de antígeno pode ser realizada. Isso pode ser feito usando calor ou enzimas para desmascarar epítopos que foram reticulados durante a fixação, tornando-os disponíveis para ligação de anticorpos. Após a preparação apropriada da amostra, um anticorpo primário específico do alvo é adicionado à amostra de célula ou tecido. Este anticorpo primário deve se ligar à proteína de interesse. Em seguida, um anticorpo secundário é adicionado, que detecta e se liga ao anticorpo primário. Este anticorpo secundário é conjugado ou pode se ligar a uma enzima chamada HRP. Quando seu substrato específico, DAB, é adicionado, o HRP o converte em um precipitado marrom insolúvel. Essa mancha marrom marca a localização da proteína alvo. As lâminas também são coradas com hematoxilina, que rotula os núcleos em azul e fornece um ponto de referência espacial para determinar a localização subcelular. Em seguida, adiciona-se um meio de montagem à lâmina, seguido de uma lamínula para selar e preservar a amostra corada. Finalmente, as lâminas podem ser visualizadas em um microscópio de luz.

Neste vídeo, você observará a técnica de preparação de amostras para células plaqueadas e seções de tecido, seguida de imunocoloração das seções de tecido.

Primeiro, as células de interesse precisam ser assentadas em lamínulas. Para fazer isso, trabalhando em uma capa de cultura de tecidos, coloque lamínulas individuais nos poços de uma placa de 24 poços. Em seguida, feche o caixilho e acenda a luz ultravioleta para esterilizar as lamínulas por pelo menos 15 minutos. Em seguida, desligue a luz UV. Para retirar as células de interesse de um prato confluente de 10 centímetros, aspire a mídia, lave brevemente com PBS e adicione tripsina às células por 2 minutos. Em seguida, bata na lateral da placa para garantir que as células se desprenderam e neutralize a tripsina com meio. Em seguida, adicione 0. 5 mL da suspensão celular em cada poço, certificando-se de cobrir as lamínulas. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 umidificada e deixe as células crescerem a 37 graus Celsius até que estejam 50-70% confluentes.

Assim que as células atingirem a confluência ideal, aspire o meio de cultura de cada poço e, em seguida, fixe as células incubando-as em . 5 mL de paraformaldeído a 4% diluído em PBS 1X por 20 minutos em temperatura ambiente. Após remover o fixador, enxágue as células adicionando 1 mL de 1X PBS sobre cada lamínula. Aspire imediatamente o PBS e repita o enxágue mais 2 vezes para um total de 3 lavagens.

Agora, permeie as células adicionando 0,5 mL de Triton X-100 a 0,1% em 1X PBS a cada poço. Deixe o prato em temperatura ambiente por 15 minutos. Aspire o tampão de permeabilização e, em seguida, enxágue as células adicionando 1 mL de 1X PBS em cada poço. Aspire imediatamente o PBS e repita o enxágue mais 2 vezes para um total de 3 lavagens. Agora que as células nas lamínulas estão fixadas e permeabilizadas, prossiga para o procedimento de coloração demonstrado para o seguinte exemplo de imuno-histoquímica, com a exceção de que as incubações devem ser realizadas dentro dos poços da placa de 24 poços, em vez de diretamente em uma lâmina de seção de tecido.

Para começar, obtenha seções de tecido preparadas, fixadas em formalina e embebidas em parafina. Desparafinize as lâminas colocando-as em um rack de lâminas e, em seguida, mergulhando-as completamente em 250 mL de xileno 100%. Deixe as lâminas incubarem por 5 minutos no xileno. Em seguida, remova as lâminas do recipiente, limpe-as com uma toalha de papel e coloque-as em um novo banho de xileno em um recipiente novo por mais 5 minutos.

Em seguida, reidratar as secções numa série de soluções graduadas de etanol, começando com etanol a 100% durante 3 minutos. Limpe o suporte de lâminas com uma toalha de papel e transfira as lâminas para um novo recipiente de etanol 100% por mais 3 minutos. Continuar este ciclo de lavagem, secagem com papel toalha e transferência das lâminas para um novo banho seguindo as concentrações indicadas de etanol durante o tempo especificado. Após a lavagem final com etanol, limpe o rack com uma toalha de papel e incube as lâminas em 100 mL de peróxido de hidrogênio de 3% por 30 minutos em temperatura ambiente para bloquear qualquer atividade endógena da peroxidase. Lave as lâminas em 250 mL de PBS 1X por 5 minutos. Repita esta lavagem em um recipiente de PBS 1X fresco por mais 5 minutos.

Em seguida, execute a recuperação do antígeno imergindo as lâminas em 250 mL de tampão citrato IHC a pH 6,0 e fervendo-as por 20 minutos. Em seguida, prossiga para o protocolo de coloração.

Para iniciar o processo de coloração para IHC, circule as seções com uma caneta hidrofóbica para identificar a área mínima que o tampão precisa cobrir. Em seguida, use uma pipeta para colocar 100 microlitros de tampão de bloqueio, que neste experimento é soro de cavalo diluído em 1X PBS, sobre a seção. Incube as lâminas por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova o tampão de bloqueio usando uma pipeta.

Em seguida, dilua o anticorpo primário e o tampão de bloqueio em uma diluição de 1:100, adicionando 990 microlitros de soro de cavalo diluído em 1X PBS em um 1. Tubo Eppendorf de 5 mL, seguido de 10 microlitros do anticorpo primário. Adicione 100 microlitros do anticorpo primário diluído a cada seção e incube as lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente. Quando o cronômetro soar, drene o anticorpo primário de cada lâmina e lave-os em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Repita esta lavagem mais uma vez usando PBS 1X fresco.

Enquanto as lâminas estão sendo lavadas em 1X PBS, dilua o anticorpo secundário para uma diluição de 1:200 adicionando 995 microlitros de tampão de bloqueio a um tubo de 1,5 mL seguido por 5 microlitros do anticorpo secundário, que neste caso é IGG anti-camundongo de cavalo biotinilado. Adicione 100 microlitros do anticorpo secundário diluído a cada seção e, em seguida, incube as lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente. Após 30 minutos, remova o anticorpo secundário drenando-o das seções e, em seguida, lave as lâminas em 250 mL de PBS 1X por 5 minutos. Repita esta lavagem usando PBS 1X fresco.

Agora, adicione 100 microlitros de reagente complexo avidina-biotina e incube as seções no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas mergulhando-as em 250 mL de PBS 1X por 5 minutos. Semelhante às etapas de lavagem anteriores, repita esta lavagem mais uma vez usando PBS 1X fresco. Em seguida, revele as lâminas incubando as seções em 100 microlitros de DAB por até 5 minutos. Pare o desenvolvimento imergindo as seções em 250 mL de água destilada por 5 minutos.

Agora, os slides podem ser contra-corados, se desejado. Para fazer isso, mergulhe brevemente as lâminas em 250 mL de solução de hematoxilina Harris. Enxágue a contra-mancha lavando as lâminas em 250 mL de água destilada por 5 minutos. Repita esta lavagem mais 1 vez usando água destilada fresca. Em seguida, desidrate as seções. Para fazer isso, primeiro incube as lâminas em etanol a 95% por 5 minutos. Seque as lâminas em uma toalha de papel e transfira-as para um novo recipiente com etanol fresco a 95% por mais 5 minutos. Continue o ciclo de lavagem, enxugando com papel toalha e transferindo as lâminas para um novo banho, seguindo as soluções indicadas por 5 minutos cada.

Após a incubação final, seque as lâminas com uma toalha de papel e, em seguida, adicione uma gota de mídia de montagem, como o Organo-Limonene Mount, às lâminas. Agora, coloque uma lamínula sobre as seções, tomando cuidado para não prender bolhas de ar. As lâminas agora estão prontas para serem observadas ao microscópio para análise.

Para observar as seções coradas, use um microscópio de luz padrão para visualizar a mancha e uma câmera digital para capturar a imagem. Neste exemplo específico de IHQ, tecidos do baço de camundongos selvagens e espontâneos, duplamente transgênicos ou DTG são comparados para estudar a expressão de Dyclin D1 no linfoma. Os tecidos foram embebidos em parafina, seccionados e corados com anticorpo anticiclina D1 e fotografados com aumento de 20X. As células que expressam ciclina D1 são indicadas pela cor marrom-avermelhada contra o fundo azul do tecido. Comparando as intensidades de coloração entre as imagens dos vários camundongos, os baços não aumentados têm quantidades relativamente baixas de expressão de ciclina D1, independentemente do genótipo do camundongo. Em contraste, o baço aumentado do camundongo DTG mostra aumento da coloração marrom-avermelhada, indicando uma correlação entre o desenvolvimento de câncer e a expressão de ciclina D1 neste modelo de camundongo.