Imunohistoquímica e imunocitoquímica: imageamento de tecidos via microscopia de luz

A imunocitoquímica e a imunohistoquímica são métodos de coloração para uma proteína de interesse em células e tecidos cultos, respectivamente. O princípio básico de ambas as técnicas relacionadas envolve o uso de anticorpos específicos marcados com um sistema de detecção para identificar e visualizar a proteína e determinar sua localização dentro das células e tecidos, bem como os níveis relativos. O processo em qualquer experimento começa com a preparação da amostra.

Para a imunoctoquímica, que visualiza especificamente locais de proteínas ou antígenos nas células, isso envolve três passos. O primeiro passo é o revestimento, que implica a cultura das células em meios de crescimento em um deslizamento de cobertura ou slide, tipicamente, nos poços de uma placa de cultura. Isso é seguido pela fixação, onde um agente precipitante ou transligador como o paraformaldeído é adicionado às células para preservar a integridade estrutural das proteínas e evitar que a atividade enzimática as degrade. O último passo é a permeabilização, que envolve a adição de um detergente para tornar as membranas celulares permeáveis para a coloração.

No método de contrapartida, a imunohistoquímica, proteínas ou antígenos são visualizados em tecidos e a preparação da amostra tem cinco passos. Primeiro, todo o tecido é submetido à fixação, geralmente com paraformaldeído. Isso é seguido pela incorporação do tecido em um bloco de parafina, e, em seguida, secção deste bloco usando uma máquina chamada microtome para cortar o tecido em fatias finas que podem ser colocadas em lâminas. Em seguida, os slides são submetidos à desparafinação, ou remoção da parafina ao redor da fatia de tecido. Em seguida, um passo opcional de recuperação de antígeno pode ser realizado. Isso pode ser feito usando calor ou enzimas para desmascarar epítopos que foram cruzados durante a fixação, tornando-os disponíveis para ligação de anticorpos. Após a preparação adequada da amostra, um anticorpo primário específico do alvo é adicionado à amostra celular ou tecidual. Este anticorpo primário deve se ligar à proteína de interesse. Em seguida, um anticorpo secundário é adicionado, que detecta e se liga ao anticorpo primário. Este anticorpo secundário é conjugado ou pode se ligar a uma enzima chamada HRP. Quando seu substrato específico, DAB, é adicionado, o HRP converte isso em um precipitado marrom insolúvel. Esta mancha marrom marca a localização da proteína alvo. Os slides também estão manchados com hematoxilina, que rotula os núcleos em azul e fornece um ponto de referência espacial para determinar a localização subcelular. Depois disso, a mídia de montagem é adicionada ao slide, seguida de um deslizamento de cobertura, a fim de selar e preservar a amostra manchada. Finalmente, os slides podem ser imagens em um microscópio leve.

Neste vídeo, você observará a técnica de preparação da amostra para células banhadas e seções teciduais, seguida de imunossuagem das seções teciduais.

Primeiro, as células de interesse precisam estar sentadas em tampas. Para isso, trabalhando em uma capa de cultura de tecidos, coloque tampas individuais nos poços de uma placa de 24 poços. Em seguida, feche a faixa e ligue a luz UV para esterilizar as tampas por pelo menos 15 minutos. Em seguida, desligue a luz UV. Para levantar as células de interesse de um prato confluente de 10 centímetros, aspire a mídia, lave brevemente com PBS e adicione trippsina às células por 2 minutos. Em seguida, toque na lateral da placa para garantir que as células se despeçam e neutralizem o trypsin com a mídia. Em seguida, adicione 0. 5 mL da suspensão da célula em cada poço, certificando-se de cobrir as manchas. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 umidificada e permita que as células cresçam a 37 graus celsius até que sejam 50-70% confluentes.

Uma vez que as células atinjam a confluência ideal, aspire o meio de cultura de cada poço e, em seguida, fixe as células incubando-as em . 5 mL de 4% de paraformaldeído diluído em 1X PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Depois de remover o fixador, enxágue as células adicionando 1 mL de 1X PBS sobre cada deslizamento de cobertura. Aspire imediatamente o PBS e repita a lavagem mais 2 vezes para um total de 3 lavagens.

Agora, permeablize as células adicionando 0,5 mL de Triton X-100 em 1X PBS a cada poço. Deixe a placa em temperatura ambiente por 15 minutos. Aspire o tampão de permeabilização e enxágue as células adicionando 1 mL de 1X PBS em cada poço. Aspire imediatamente o PBS e repita a lavagem mais 2 vezes para um total de 3 lavagens. Agora que as células das tampas são fixas e permeabilizadas, proceder ao procedimento de coloração demonstrado para o seguinte exemplo de imunohistoquímica, com exceção de que as incubações devem ser realizadas dentro dos poços da placa de 24 poços em vez de diretamente em uma lâmina de seção de tecido.

Para começar, obtenha seções de tecido preparadas, fixas em parafina. Desparafinar os slides colocando-os em um rack de slides e, em seguida, imerso completamente em 250 mL de 100% xileno. Deixe os slides incubarem por 5 minutos no xileno. Em seguida, retire os slides do recipiente, limpe-os com uma toalha de papel e coloque-os em um novo banho de xileno em um recipiente fresco por mais 5 minutos.

Em seguida, reidratar as seções em uma série de soluções de etanol classificados começando com 100% de etanol por 3 minutos. Limpe o rack de slides com uma toalha de papel e transfira os slides para um novo recipiente de 100% de etanol por mais 3 minutos. Continue este ciclo de lavagem, secagem com uma toalha de papel, e transferindo os slides para um novo banho seguindo as concentrações indicadas de etanol para o tempo especificado. Após a lavagem final do etanol, limpe o rack com uma toalha de papel e incuba os slides em 100 mL de peróxido de hidrogênio de 0,3% por 30 minutos à temperatura ambiente, a fim de bloquear qualquer atividade peroxidase endógena. Lave os slides em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Repita esta lavagem em um recipiente de PBS 1X fresco por mais 5 minutos.

Em seguida, realize a recuperação de antígeno imergindo os slides em 250 mL de tampão citrato IHC no pH 6.0 e fervendo-os por 20 minutos. Em seguida, prossiga para o protocolo de coloração.

Para iniciar o processo de coloração para IHC, circule as seções com uma caneta hidrofóbica para identificar a área mínima que o buffer precisa cobrir. Em seguida, use uma pipeta para colocar 100 microliters de tampão de bloqueio, que neste experimento é o soro de cavalo diluído em 1X PBS, sobre a seção. Incubar os slides por 1 hora em temperatura ambiente. Depois disso, remova o tampão de bloqueio usando uma pipeta.

Em seguida, diluir o anticorpo primário e bloquear o buffer em uma diluição de 1:100 adicionando 990 microliters de soro de cavalo diluídos em 1X PBS em um 1. Tubo Eppendorf de 5 mL, seguido por 10 microlitres do anticorpo primário. Adicione 100 microliters do anticorpo primário diluído a cada seção e incubar os slides por 30 minutos à temperatura ambiente. Quando o temporizador soar, drene o anticorpo primário de cada lâmina e depois lave-os em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Repita esta lavagem mais uma vez usando pbs 1X fresco.

Enquanto os slides estão lavando em 1X PBS, diluir o anticorpo secundário a uma diluição de 1:200 adicionando 995 microliters de tampão de bloqueio a um tubo de 1,5 mL seguido por 5 microliters do anticorpo secundário, que neste caso é o anti-rato de cavalo biotinilado IGG. Adicione 100 microlitres do anticorpo secundário diluído a cada seção e, em seguida, incubar os slides por 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, remova o anticorpo secundário drenando-o das seções e, em seguida, lave os slides em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Repita esta lavagem usando pbs 1X fresco.

Agora, adicione 100 microliters de reagente complexo avidin-biotina, e incuba as seções no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave os slides imergindo-os em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Semelhante aos passos de lavagem anteriores, repita esta lavagem mais uma vez usando pbs 1X fresco. Em seguida, desenvolva os slides incubando as seções em 100 microliters de DAB por até 5 minutos. Pare o desenvolvimento imergindo as seções em 250 mL de água destilada por 5 minutos.

Agora, slides podem ser neutralizado, se desejar. Para isso, mergulhe brevemente os slides em 250 mL da Solução harris hematoxylin. Enxágüe a contra-mancha lavando as lâminas em 250 mL de água destilada por 5 minutos. Repita esta lavagem mais 1 tempo usando água fresca destilada. Em seguida, desidratar as seções. Para isso, primeiro incubar os slides em 95% de etanol por 5 minutos. Borricar os slides em uma toalha de papel, e transferi-los para um novo recipiente de 95% de etanol fresco por mais 5 minutos. Continue o ciclo de lavagem, mancha com uma toalha de papel, e transfira os slides para um novo banho, seguindo as soluções indicadas por 5 minutos cada.

Após a incubação final, borre os slides com uma toalha de papel, em seguida, adicione uma gota de mídia de montagem, como Organo-Limonene Mount, aos slides. Agora, coloque uma mancha sobre as seções, tomando cuidado para não prender bolhas de ar. Os slides estão agora prontos para serem observados sob um microscópio para análise.

Para observar as seções manchadas, use um microscópio de luz padrão para visualizar a mancha e uma câmera digital para capturar a imagem. Neste exemplo particular de IHC, tecidos de baço do tipo selvagem e camundongos espontâneos, transgênicos duplos ou DTG, são comparados para estudar a expressão Dyclin D1 em linfoma. Os tecidos foram incorporados, seccionados e manchados com anticorpo anticiclina D1, e retratados a ampliação de 20X. As células expressas cyclin D1 são indicadas pela cor marrom-avermelhada contra o fundo do tecido azul. Comparando as intensidades de coloração entre as imagens dos vários camundongos, os baços não aumentados têm quantidades relativamente baixas de expressão Cyclin D1, independentemente do genótipo do rato. Em contraste, o baço ampliado do mouse DTG, mostra uma maior coloração marrom-avermelhada indicando uma correlação entre o desenvolvimento do câncer e a expressão Cyclin D1 neste modelo de mouse.