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Fonte: Michael S. Lee1 e Tonya J. Webb1
1 Departamento de Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Medicina da Universidade de Maryland e o Centro de Câncer Integral Marlene e Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201
Imunohistoquímica (IHC) e imunocytoquímica (ICC) são técnicas utilizadas para visualizar a expressão e localização de antígenos específicos usando anticorpos. O primeiro uso publicado do IHC foi em 1941, quando Albert Coons usou a técnica para visualizar a presença de antígeno pneumocócico em seções de tecidos de camundongos infectados com Pneumococcus (1). O nome, imunohistoquímica, é derivado das raízes "imuno-", em referência a anticorpos, e "histo-", em referência às seções teciduais usadas no IHC. A raiz "cito-" na imunocitoquímica destaca a diferença fundamental entre ICC e IHC. Enquanto o IHC usa seções de tecido inteiro, o ICC usa células isoladas do tecido ou cultivadas na cultura. A diferença nas amostras utilizadas significa que a preparação da amostra difere tecnicamente entre iHC e ICC, mas caso contrário, os protocolos para ICC e IHC são idênticos e descobrirão que os termos são frequentemente usados de forma intercambiável.
Tanto no IHC quanto no ICC, anticorpos com etiquetas químicas ou fluorescentes, como peroxidase ou rhodamina, respectivamente, são usados para visualizar a distribuição de qualquer antígeno de interesse através de ligação específica do anticorpo marcado ao antígeno. No caso do IHC, finas fatias de tecido são imobilizadas em um slide para manter a estrutura do tecido antes de serem manchadas, permitindo a visualização de antígenos no contexto de tecidos inteiros (Figura 1). No caso do ICC, as células são distribuídas uniformemente em um slide antes de serem manchadas, permitindo a visualização da distribuição de antígenos dentro de células individuais, mas não dentro da estrutura de qualquer tecido específico. Devido às semelhanças entre os dois protocolos, este protocolo se concentrará no IHC para abordar as complexidades adicionais da preparação da amostra envolvida no IHC.
Figura 1: Esboço do Protocolo IHC. Esboço visual de um protocolo IHC para tecido embutido em parafina dissecado a partir de um rato. Este protocolo usa um anticorpo secundário biotinína e strepavidin-HRP para visualizar a localização da ligação de anticorpos. Outras opções, como anticorpos fluorescentes marcados, também são possíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A primeira grande decisão ao realizar o IHC é como preparar as seções teciduais para manter a estrutura do tecido durante todo o processo de coloração. As duas principais opções são seções fixadas de formalina de tecido embutido em parafina ou seções frescas de tecido congelado. Não há uma resposta simples sobre qual método usar, pois depende de qual análise a jusante será conduzida. A fixação de formalina de tecidos incorporados para a parafina é geralmente pensada para preservar melhor a morfologia tecidual para uma imagem ideal, enquanto o congelamento de tecido fresco pode preservar a função proteica para ensaios subsequentes fora do IHC. Além disso, seções de tecido congelado fresco têm se mostrado mais adequadas para a análise da expressão genética (2). Uma terceira consideração é se os anticorpos para o seu antígeno de interesse são adequados para seções de tecido fixo ou congelado, pois alguns anticorpos só foram otimizados para um tipo específico de seção e podem não funcionar para outros. Por fim, também é preciso determinar quanto tempo eles precisam para armazenar as seções de tecido, uma vez que amostras congeladas frescas devem ser mantidas a -80°C e podem não durar mais de um ano enquanto seções fixas podem ser armazenadas por muito mais tempo à temperatura ambiente. Estas são algumas das principais considerações para determinar se usar seções fixas de formalina de tecido embutido parafina ou seções frescas de tecido congelado. Em última análise, se alguém tem tecido suficiente, talvez seja melhor ter alguns dos dois.
Neste experimento, nos propusemos a determinar se a expressão cyclin D1 foi aumentada em baços ampliados a partir de um modelo espontâneo de desenvolvimento de linfoma. Amostras de tecido esplênico foram isoladas pela primeira vez de camundongos do tipo selvagem, camundongos transgênicos que não têm linfoma, ou camundongos transgênicos que desenvolveram linfoma espontaneamente. As amostras de tecido de baço foram fixadas em paraformaldeído, embutidas em parafina, seccionadas, manchadas usando um anticorpo primário anti-cíclin D1 seguido por um anticorpo secundário anti-rato de cavalo, e desenvolvidas usando 3,3 diaminobenzidina (DAB). As seções foram então contra-manchadas na Solução de Hematoxilina Harris e, em seguida, as seções foram imagens em ampliação de 20X.
Reagentes
Seções incorporadas à parafina
Seções congeladas frescas
Mancha
1. Preparação de Células para Imunocytoquímica
2. Preparação de Seções Parafina-Fixadas para Coloração
Desparafinação
Reidratação
Bloqueando atividade peroxidase endógena
Recuperação de antígenos
3. Preparação de seções recém-congeladas e incorporadas oTC para coloração
4. Mancha
Bloqueio
Incubação primária de anticorpos
Incubação secundária de anticorpos
Desenvolvimento de cores
Contra-retenção (se desejar)
Desidratação
Aplicativo de montagem e coberturas
Análise microscópica
A imunocitoquímica e a imunohistoquímica são métodos de coloração para uma proteína de interesse em células e tecidos cultos, respectivamente. O princípio básico de ambas as técnicas relacionadas envolve o uso de anticorpos específicos marcados com um sistema de detecção para identificar e visualizar a proteína e determinar sua localização dentro das células e tecidos, bem como os níveis relativos. O processo em qualquer experimento começa com a preparação da amostra.
Para a imunoctoquímica, que visualiza especificamente locais de proteínas ou antígenos nas células, isso envolve três passos. O primeiro passo é o revestimento, que implica a cultura das células em meios de crescimento em um deslizamento de cobertura ou slide, tipicamente, nos poços de uma placa de cultura. Isso é seguido pela fixação, onde um agente precipitante ou transligador como o paraformaldeído é adicionado às células para preservar a integridade estrutural das proteínas e evitar que a atividade enzimática as degrade. O último passo é a permeabilização, que envolve a adição de um detergente para tornar as membranas celulares permeáveis para a coloração.
No método de contrapartida, a imunohistoquímica, proteínas ou antígenos são visualizados em tecidos e a preparação da amostra tem cinco passos. Primeiro, todo o tecido é submetido à fixação, geralmente com paraformaldeído. Isso é seguido pela incorporação do tecido em um bloco de parafina, e, em seguida, secção deste bloco usando uma máquina chamada microtome para cortar o tecido em fatias finas que podem ser colocadas em lâminas. Em seguida, os slides são submetidos à desparafinação, ou remoção da parafina ao redor da fatia de tecido. Em seguida, um passo opcional de recuperação de antígeno pode ser realizado. Isso pode ser feito usando calor ou enzimas para desmascarar epítopos que foram cruzados durante a fixação, tornando-os disponíveis para ligação de anticorpos. Após a preparação adequada da amostra, um anticorpo primário específico do alvo é adicionado à amostra celular ou tecidual. Este anticorpo primário deve se ligar à proteína de interesse. Em seguida, um anticorpo secundário é adicionado, que detecta e se liga ao anticorpo primário. Este anticorpo secundário é conjugado ou pode se ligar a uma enzima chamada HRP. Quando seu substrato específico, DAB, é adicionado, o HRP converte isso em um precipitado marrom insolúvel. Esta mancha marrom marca a localização da proteína alvo. Os slides também estão manchados com hematoxilina, que rotula os núcleos em azul e fornece um ponto de referência espacial para determinar a localização subcelular. Depois disso, a mídia de montagem é adicionada ao slide, seguida de um deslizamento de cobertura, a fim de selar e preservar a amostra manchada. Finalmente, os slides podem ser imagens em um microscópio leve.
Neste vídeo, você observará a técnica de preparação da amostra para células banhadas e seções teciduais, seguida de imunossuagem das seções teciduais.
Primeiro, as células de interesse precisam estar sentadas em tampas. Para isso, trabalhando em uma capa de cultura de tecidos, coloque tampas individuais nos poços de uma placa de 24 poços. Em seguida, feche a faixa e ligue a luz UV para esterilizar as tampas por pelo menos 15 minutos. Em seguida, desligue a luz UV. Para levantar as células de interesse de um prato confluente de 10 centímetros, aspire a mídia, lave brevemente com PBS e adicione trippsina às células por 2 minutos. Em seguida, toque na lateral da placa para garantir que as células se despeçam e neutralizem o trypsin com a mídia. Em seguida, adicione 0. 5 mL da suspensão da célula em cada poço, certificando-se de cobrir as manchas. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 umidificada e permita que as células cresçam a 37 graus celsius até que sejam 50-70% confluentes.
Uma vez que as células atinjam a confluência ideal, aspire o meio de cultura de cada poço e, em seguida, fixe as células incubando-as em . 5 mL de 4% de paraformaldeído diluído em 1X PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Depois de remover o fixador, enxágue as células adicionando 1 mL de 1X PBS sobre cada deslizamento de cobertura. Aspire imediatamente o PBS e repita a lavagem mais 2 vezes para um total de 3 lavagens.
Agora, permeablize as células adicionando 0,5 mL de Triton X-100 em 1X PBS a cada poço. Deixe a placa em temperatura ambiente por 15 minutos. Aspire o tampão de permeabilização e enxágue as células adicionando 1 mL de 1X PBS em cada poço. Aspire imediatamente o PBS e repita a lavagem mais 2 vezes para um total de 3 lavagens. Agora que as células das tampas são fixas e permeabilizadas, proceder ao procedimento de coloração demonstrado para o seguinte exemplo de imunohistoquímica, com exceção de que as incubações devem ser realizadas dentro dos poços da placa de 24 poços em vez de diretamente em uma lâmina de seção de tecido.
Para começar, obtenha seções de tecido preparadas, fixas em parafina. Desparafinar os slides colocando-os em um rack de slides e, em seguida, imerso completamente em 250 mL de 100% xileno. Deixe os slides incubarem por 5 minutos no xileno. Em seguida, retire os slides do recipiente, limpe-os com uma toalha de papel e coloque-os em um novo banho de xileno em um recipiente fresco por mais 5 minutos.
Em seguida, reidratar as seções em uma série de soluções de etanol classificados começando com 100% de etanol por 3 minutos. Limpe o rack de slides com uma toalha de papel e transfira os slides para um novo recipiente de 100% de etanol por mais 3 minutos. Continue este ciclo de lavagem, secagem com uma toalha de papel, e transferindo os slides para um novo banho seguindo as concentrações indicadas de etanol para o tempo especificado. Após a lavagem final do etanol, limpe o rack com uma toalha de papel e incuba os slides em 100 mL de peróxido de hidrogênio de 0,3% por 30 minutos à temperatura ambiente, a fim de bloquear qualquer atividade peroxidase endógena. Lave os slides em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Repita esta lavagem em um recipiente de PBS 1X fresco por mais 5 minutos.
Em seguida, realize a recuperação de antígeno imergindo os slides em 250 mL de tampão citrato IHC no pH 6.0 e fervendo-os por 20 minutos. Em seguida, prossiga para o protocolo de coloração.
Para iniciar o processo de coloração para IHC, circule as seções com uma caneta hidrofóbica para identificar a área mínima que o buffer precisa cobrir. Em seguida, use uma pipeta para colocar 100 microliters de tampão de bloqueio, que neste experimento é o soro de cavalo diluído em 1X PBS, sobre a seção. Incubar os slides por 1 hora em temperatura ambiente. Depois disso, remova o tampão de bloqueio usando uma pipeta.
Em seguida, diluir o anticorpo primário e bloquear o buffer em uma diluição de 1:100 adicionando 990 microliters de soro de cavalo diluídos em 1X PBS em um 1. Tubo Eppendorf de 5 mL, seguido por 10 microlitres do anticorpo primário. Adicione 100 microliters do anticorpo primário diluído a cada seção e incubar os slides por 30 minutos à temperatura ambiente. Quando o temporizador soar, drene o anticorpo primário de cada lâmina e depois lave-os em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Repita esta lavagem mais uma vez usando pbs 1X fresco.
Enquanto os slides estão lavando em 1X PBS, diluir o anticorpo secundário a uma diluição de 1:200 adicionando 995 microliters de tampão de bloqueio a um tubo de 1,5 mL seguido por 5 microliters do anticorpo secundário, que neste caso é o anti-rato de cavalo biotinilado IGG. Adicione 100 microlitres do anticorpo secundário diluído a cada seção e, em seguida, incubar os slides por 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, remova o anticorpo secundário drenando-o das seções e, em seguida, lave os slides em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Repita esta lavagem usando pbs 1X fresco.
Agora, adicione 100 microliters de reagente complexo avidin-biotina, e incuba as seções no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave os slides imergindo-os em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Semelhante aos passos de lavagem anteriores, repita esta lavagem mais uma vez usando pbs 1X fresco. Em seguida, desenvolva os slides incubando as seções em 100 microliters de DAB por até 5 minutos. Pare o desenvolvimento imergindo as seções em 250 mL de água destilada por 5 minutos.
Agora, slides podem ser neutralizado, se desejar. Para isso, mergulhe brevemente os slides em 250 mL da Solução harris hematoxylin. Enxágüe a contra-mancha lavando as lâminas em 250 mL de água destilada por 5 minutos. Repita esta lavagem mais 1 tempo usando água fresca destilada. Em seguida, desidratar as seções. Para isso, primeiro incubar os slides em 95% de etanol por 5 minutos. Borricar os slides em uma toalha de papel, e transferi-los para um novo recipiente de 95% de etanol fresco por mais 5 minutos. Continue o ciclo de lavagem, mancha com uma toalha de papel, e transfira os slides para um novo banho, seguindo as soluções indicadas por 5 minutos cada.
Após a incubação final, borre os slides com uma toalha de papel, em seguida, adicione uma gota de mídia de montagem, como Organo-Limonene Mount, aos slides. Agora, coloque uma mancha sobre as seções, tomando cuidado para não prender bolhas de ar. Os slides estão agora prontos para serem observados sob um microscópio para análise.
Para observar as seções manchadas, use um microscópio de luz padrão para visualizar a mancha e uma câmera digital para capturar a imagem. Neste exemplo particular de IHC, tecidos de baço do tipo selvagem e camundongos espontâneos, transgênicos duplos ou DTG, são comparados para estudar a expressão Dyclin D1 em linfoma. Os tecidos foram incorporados, seccionados e manchados com anticorpo anticiclina D1, e retratados a ampliação de 20X. As células expressas cyclin D1 são indicadas pela cor marrom-avermelhada contra o fundo do tecido azul. Comparando as intensidades de coloração entre as imagens dos vários camundongos, os baços não aumentados têm quantidades relativamente baixas de expressão Cyclin D1, independentemente do genótipo do rato. Em contraste, o baço ampliado do mouse DTG, mostra uma maior coloração marrom-avermelhada indicando uma correlação entre o desenvolvimento do câncer e a expressão Cyclin D1 neste modelo de mouse.
Imunocitoquímica e imuno-histoquímica são métodos de coloração para uma proteína de interesse em células e tecidos cultivados, respectivamente. O princípio básico de ambas as técnicas relacionadas envolve o uso de anticorpos específicos marcados com um sistema de detecção para identificar e visualizar a proteína e determinar sua localização dentro das células e tecidos, bem como os níveis relativos. O processo em qualquer experimento começa com a preparação da amostra.
Para imunocitoquímica, que visualiza especificamente a localização de proteínas ou antígenos nas células, isso envolve três etapas. O primeiro passo é o revestimento, que envolve a cultura das células em meio de crescimento em uma lamínula ou lâmina, normalmente, nos poços de uma placa de cultura. Isso é seguido pela fixação, onde um agente precipitante ou reticulante como o paraformaldeído é adicionado às células para preservar a integridade estrutural das proteínas e evitar que a atividade enzimática as degrade. A última etapa é a permeabilização, que envolve a adição de um detergente para tornar as membranas celulares permeáveis à coloração.
No método de contrapartida, imuno-histoquímica, proteínas ou antígenos são visualizados nos tecidos e o preparo da amostra tem cinco etapas. Primeiro, todo o tecido é submetido à fixação, geralmente com paraformaldeído. Isso é seguido pela incorporação do tecido em um bloco de parafina e, em seguida, seccionamento desse bloco usando uma máquina chamada micrótomo para cortar o tecido em fatias finas que podem ser colocadas em lâminas. Em seguida, as lâminas são submetidas à desparafinização ou remoção da parafina ao redor da fatia de tecido. Em seguida, uma etapa opcional de recuperação de antígeno pode ser realizada. Isso pode ser feito usando calor ou enzimas para desmascarar epítopos que foram reticulados durante a fixação, tornando-os disponíveis para ligação de anticorpos. Após a preparação apropriada da amostra, um anticorpo primário específico do alvo é adicionado à amostra de célula ou tecido. Este anticorpo primário deve se ligar à proteína de interesse. Em seguida, um anticorpo secundário é adicionado, que detecta e se liga ao anticorpo primário. Este anticorpo secundário é conjugado ou pode se ligar a uma enzima chamada HRP. Quando seu substrato específico, DAB, é adicionado, o HRP o converte em um precipitado marrom insolúvel. Essa mancha marrom marca a localização da proteína alvo. As lâminas também são coradas com hematoxilina, que rotula os núcleos em azul e fornece um ponto de referência espacial para determinar a localização subcelular. Em seguida, adiciona-se um meio de montagem à lâmina, seguido de uma lamínula para selar e preservar a amostra corada. Finalmente, as lâminas podem ser visualizadas em um microscópio de luz.
Neste vídeo, você observará a técnica de preparação de amostras para células plaqueadas e seções de tecido, seguida de imunocoloração das seções de tecido.
Primeiro, as células de interesse precisam ser assentadas em lamínulas. Para fazer isso, trabalhando em uma capa de cultura de tecidos, coloque lamínulas individuais nos poços de uma placa de 24 poços. Em seguida, feche o caixilho e acenda a luz ultravioleta para esterilizar as lamínulas por pelo menos 15 minutos. Em seguida, desligue a luz UV. Para retirar as células de interesse de um prato confluente de 10 centímetros, aspire a mídia, lave brevemente com PBS e adicione tripsina às células por 2 minutos. Em seguida, bata na lateral da placa para garantir que as células se desprenderam e neutralize a tripsina com meio. Em seguida, adicione 0. 5 mL da suspensão celular em cada poço, certificando-se de cobrir as lamínulas. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 umidificada e deixe as células crescerem a 37 graus Celsius até que estejam 50-70% confluentes.
Assim que as células atingirem a confluência ideal, aspire o meio de cultura de cada poço e, em seguida, fixe as células incubando-as em . 5 mL de paraformaldeído a 4% diluído em PBS 1X por 20 minutos em temperatura ambiente. Após remover o fixador, enxágue as células adicionando 1 mL de 1X PBS sobre cada lamínula. Aspire imediatamente o PBS e repita o enxágue mais 2 vezes para um total de 3 lavagens.
Agora, permeie as células adicionando 0,5 mL de Triton X-100 a 0,1% em 1X PBS a cada poço. Deixe o prato em temperatura ambiente por 15 minutos. Aspire o tampão de permeabilização e, em seguida, enxágue as células adicionando 1 mL de 1X PBS em cada poço. Aspire imediatamente o PBS e repita o enxágue mais 2 vezes para um total de 3 lavagens. Agora que as células nas lamínulas estão fixadas e permeabilizadas, prossiga para o procedimento de coloração demonstrado para o seguinte exemplo de imuno-histoquímica, com a exceção de que as incubações devem ser realizadas dentro dos poços da placa de 24 poços, em vez de diretamente em uma lâmina de seção de tecido.
Para começar, obtenha seções de tecido preparadas, fixadas em formalina e embebidas em parafina. Desparafinize as lâminas colocando-as em um rack de lâminas e, em seguida, mergulhando-as completamente em 250 mL de xileno 100%. Deixe as lâminas incubarem por 5 minutos no xileno. Em seguida, remova as lâminas do recipiente, limpe-as com uma toalha de papel e coloque-as em um novo banho de xileno em um recipiente novo por mais 5 minutos.
Em seguida, reidratar as secções numa série de soluções graduadas de etanol, começando com etanol a 100% durante 3 minutos. Limpe o suporte de lâminas com uma toalha de papel e transfira as lâminas para um novo recipiente de etanol 100% por mais 3 minutos. Continuar este ciclo de lavagem, secagem com papel toalha e transferência das lâminas para um novo banho seguindo as concentrações indicadas de etanol durante o tempo especificado. Após a lavagem final com etanol, limpe o rack com uma toalha de papel e incube as lâminas em 100 mL de peróxido de hidrogênio de 3% por 30 minutos em temperatura ambiente para bloquear qualquer atividade endógena da peroxidase. Lave as lâminas em 250 mL de PBS 1X por 5 minutos. Repita esta lavagem em um recipiente de PBS 1X fresco por mais 5 minutos.
Em seguida, execute a recuperação do antígeno imergindo as lâminas em 250 mL de tampão citrato IHC a pH 6,0 e fervendo-as por 20 minutos. Em seguida, prossiga para o protocolo de coloração.
Para iniciar o processo de coloração para IHC, circule as seções com uma caneta hidrofóbica para identificar a área mínima que o tampão precisa cobrir. Em seguida, use uma pipeta para colocar 100 microlitros de tampão de bloqueio, que neste experimento é soro de cavalo diluído em 1X PBS, sobre a seção. Incube as lâminas por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, remova o tampão de bloqueio usando uma pipeta.
Em seguida, dilua o anticorpo primário e o tampão de bloqueio em uma diluição de 1:100, adicionando 990 microlitros de soro de cavalo diluído em 1X PBS em um 1. Tubo Eppendorf de 5 mL, seguido de 10 microlitros do anticorpo primário. Adicione 100 microlitros do anticorpo primário diluído a cada seção e incube as lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente. Quando o cronômetro soar, drene o anticorpo primário de cada lâmina e lave-os em 250 mL de 1X PBS por 5 minutos. Repita esta lavagem mais uma vez usando PBS 1X fresco.
Enquanto as lâminas estão sendo lavadas em 1X PBS, dilua o anticorpo secundário para uma diluição de 1:200 adicionando 995 microlitros de tampão de bloqueio a um tubo de 1,5 mL seguido por 5 microlitros do anticorpo secundário, que neste caso é IGG anti-camundongo de cavalo biotinilado. Adicione 100 microlitros do anticorpo secundário diluído a cada seção e, em seguida, incube as lâminas por 30 minutos em temperatura ambiente. Após 30 minutos, remova o anticorpo secundário drenando-o das seções e, em seguida, lave as lâminas em 250 mL de PBS 1X por 5 minutos. Repita esta lavagem usando PBS 1X fresco.
Agora, adicione 100 microlitros de reagente complexo avidina-biotina e incube as seções no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as lâminas mergulhando-as em 250 mL de PBS 1X por 5 minutos. Semelhante às etapas de lavagem anteriores, repita esta lavagem mais uma vez usando PBS 1X fresco. Em seguida, revele as lâminas incubando as seções em 100 microlitros de DAB por até 5 minutos. Pare o desenvolvimento imergindo as seções em 250 mL de água destilada por 5 minutos.
Agora, os slides podem ser contra-corados, se desejado. Para fazer isso, mergulhe brevemente as lâminas em 250 mL de solução de hematoxilina Harris. Enxágue a contra-mancha lavando as lâminas em 250 mL de água destilada por 5 minutos. Repita esta lavagem mais 1 vez usando água destilada fresca. Em seguida, desidrate as seções. Para fazer isso, primeiro incube as lâminas em etanol a 95% por 5 minutos. Seque as lâminas em uma toalha de papel e transfira-as para um novo recipiente com etanol fresco a 95% por mais 5 minutos. Continue o ciclo de lavagem, enxugando com papel toalha e transferindo as lâminas para um novo banho, seguindo as soluções indicadas por 5 minutos cada.
Após a incubação final, seque as lâminas com uma toalha de papel e, em seguida, adicione uma gota de mídia de montagem, como o Organo-Limonene Mount, às lâminas. Agora, coloque uma lamínula sobre as seções, tomando cuidado para não prender bolhas de ar. As lâminas agora estão prontas para serem observadas ao microscópio para análise.
Para observar as seções coradas, use um microscópio de luz padrão para visualizar a mancha e uma câmera digital para capturar a imagem. Neste exemplo específico de IHQ, tecidos do baço de camundongos selvagens e espontâneos, duplamente transgênicos ou DTG são comparados para estudar a expressão de Dyclin D1 no linfoma. Os tecidos foram embebidos em parafina, seccionados e corados com anticorpo anticiclina D1 e fotografados com aumento de 20X. As células que expressam ciclina D1 são indicadas pela cor marrom-avermelhada contra o fundo azul do tecido. Comparando as intensidades de coloração entre as imagens dos vários camundongos, os baços não aumentados têm quantidades relativamente baixas de expressão de ciclina D1, independentemente do genótipo do camundongo. Em contraste, o baço aumentado do camundongo DTG mostra aumento da coloração marrom-avermelhada, indicando uma correlação entre o desenvolvimento de câncer e a expressão de ciclina D1 neste modelo de camundongo.
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