Imunohistoquímica e imunocitoquímica: imageamento de tecidos via microscopia de luz

1. Preparação de Células para Imunocytoquímica

1. Células de sementes de interesse em lâminas câmara ou tampas câmaras adicionando 0,5 mL de suspensão celular aos poços de uma placa de cultura de 24 poços.
   Nota: Algumas células podem exigir crescimento em tampas tratadas, como deslizamentos tratados com poli-lisina. As condições ideais de tratamento devem ser determinadas pelo usuário, dependendo do tipo celular que está sendo utilizado.
2. Coloque a placa em uma incubadora de CO₂ umidificada e permita que as células cresçam a 37°C até 50-70% confluentes.
3. Uma vez que as células atinjam a confluência ideal, remova a mídia cultural de cada poço e, em seguida, fixe as células incubando-as em 0,5 mL de 4% PFA (diluída em 1X PBS) e incubar por 20 minutos à temperatura ambiente.
4. Retire o fixador e lave os poços três vezes com 1 mL de PBS 1X.
5. Em seguida, permeabilize as células adicionando 0,5 mL de 0,1% Triton-X-100 em 1X PBS para cada poço e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
6. Aspire o tampão de permeabilização e lave os poços três vezes com 1 mL de 1X PBS.
7. As células em tampas são agora fixas e permeabilizadas. Proceda ao procedimento de coloração demonstrado para o seguinte exemplo de imunohistoquímica, com exceção de que as incubações devem ser realizadas dentro dos poços da placa de poço 24, em vez de diretamente em um slide de seção de tecido.

2. Preparação de Seções Parafina-Fixadas para Coloração

1. Obter seções de tecido embutidas de formalina preparadas.

Desparafinação

2. Mergulhe os slides em 100% xileno 2 vezes por 5 minutos cada.

Reidratação

3. Mergulhe os slides em 100% etanol 2 vezes por 3 minutos cada.
4. Mergulhe os slides em 95% de etanol por 3 min.
5. Mergulhe os slides em 70% de etanol por 3 min.
6. Mergulhe os slides em 50% de etanol por 3 min.

Bloqueando atividade peroxidase endógena

7. Incubar os slides em 100 mL de 0,3% H₂O₂ por 30 min a temperatura ambiente.
8. Lave os slides com 1X PBS 2 vezes por 5 minutos cada.

Recuperação de antígenos

9. Mergulhe os slides no tampão citrato IHC (pH 6) e ferva-os por 20 minutos.
10. As lâminas de tecido estão prontas para coloração.

3. Preparação de seções recém-congeladas e incorporadas oTC para coloração

1. Coloque 5 mm de tecido fresco isolado em um molde e adicione OCT até que a seção esteja completamente coberta.
2. Submergir lentamente o bloco tecidual em nitrogênio líquido até ficar completamente congelado. A amostra agora pode ser armazenada a -80°C por até 1 ano.
3. Uma vez pronto para a secção, transfira o bloco de tecido congelado para um criostat e permita que toda a configuração chegue a -20°C.
4. Corte seções de tecido de 5 a 10 μm de espessura usando um criostat e use pincel para colocar seções diretamente em lâminas de vidro compatíveis com IHC.
5. Deixe os slides secarem durante a noite à temperatura ambiente. Os slides também podem ser armazenados a -80°C.
6. Mergulhe os slides em 250 mL de 4% PFA por 15 minutos à temperatura ambiente para corrigir os slides antes da coloração. O método de fixação ideal deve ser determinado pelo usuário.
7. Mergulhe os slides em 250 mL de 1X PBS 2 vezes por 5 min cada.
8. Mergulhe os slides em 250 mL de 0,3% H₂O₂ por 30 min em temperatura ambiente, a fim de bloquear qualquer atividade peroxidase endógena.
9. Mergulhe os slides em 250 mL de 1X PBS 2 vezes por 5 min cada.
10. Os slides estão prontos para coloração.

4. Mancha

1. Circule o tecido com uma barreira hidrofóbica usando uma caneta de barreira.

Bloqueio

2. Usando uma pipeta, coloque 100 μL de tampão de bloqueio (soro de cavalo diluído em 1X PBS) - sobre a seção durante 1 hora em temperatura ambiente.
3. Remova o tampão de bloqueio usando uma pipeta.

Incubação primária de anticorpos

4. Incubar o tecido cercado com solução de anticorpos primários diluídos de 100 μL (cilina anti-humana do rato D1 diluída 1:100 no buffer de bloqueio) por 30 minutos à temperatura ambiente.
5. Escorra o anticorpo primário de cada slide e lave os slides com 1X PBS 2 vezes por 5 minutos cada.

Incubação secundária de anticorpos

6. Incubar a amostra com 100 μL de anticorpo secundário biotinilado diluído (cavalo antinacinado anti-rato IgG diluído 1:200) por 30 minutos à temperatura ambiente.
7. Remova o anticorpo secundário drenando as seções e lave com 1X PBS 2 vezes por 5 minutos cada.

Desenvolvimento de cores

8. Visualização usando HRP: Adicione 100 μL de reagente do complexo avidin-biotina (ABC) e incuba as seções no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente
   Nota: Anticorpos fluorescentes também podem ser usados e visualizados usando um microscópio apropriado.
9. Lave os slides com 1X PBS 2 vezes por 5 minutos cada.
10. Desenvolva os slides incubando as seções em 100 μL de DAB por até 5 min.
11. Pare o desenvolvimento adicionando água destilada (dH₂O) por 5 min a temperatura ambiente.

Contra-retenção (se desejar)

12. Mergulhe os slides brevemente na Solução de Hematoxilina Harris (ou 0,5% verde metil em acetato de sódio de 0,1M (pH 4,2)) por 10 minutos.
13. Enxágüe a contra-mancha lavando slides em dH 2 O duas_vezespor 5 min cada.

Desidratação

14. Mergulhe os slides em 95% de etanol 2 vezes por 5 min cada.
15. Mergulhe os slides em 100% etanol 2 vezes por 5 minutos cada.
16. Mergulhe os slides em 100% xileno 2 vezes por 5 minutos cada.
17. Borrida os slides com uma toalha de papel.

Aplicativo de montagem e coberturas

18. Adicione uma gota de mídia de montagem, como Organo-Limonene Mount, aos slides e coloque um deslizamento sobre as seções.

Análise microscópica

19. Observe as seções manchadas sob um microscópio apropriado para análise. Aqui um microscópio de luz padrão foi usado para observação e uma câmera digital montada foi usada para imagem.