Microscopia de imunofluorescência: Coloração por imunofluorescência de secções de tecido embebidos em parafina

A função de uma proteína em uma célula depende em grande parte de sua localização adequada dentro da célula. A microscopia de imunofluorescência é um método pelo qual uma proteína pode ser visualizada dentro das células usando corantes fluorescentes. Um corante fluorescente é um fluoróforo, que é uma molécula que absorve energia luminosa em um comprimento de onda específico por um processo chamado excitação e, em seguida, libera imediatamente a energia em um comprimento de onda diferente, conhecido como emissão.

Os corantes fluorescentes são conjugados a um anticorpo alvo específico e introduzidos em células ou tecidos cultivados por imunocoloração. Quando esse anticorpo primário se liga à proteína de interesse, a proteína é marcada com o corante fluorescente. Alternativamente, o corante fluorescente pode ser conjugado a um anticorpo secundário, em vez do anticorpo primário, e o anticorpo secundário se liga ao complexo de anticorpos primários da proteína para rotular o alvo. Depois disso, a amostra é selada em um meio de montagem antidesbotamento para preservar a rotulagem de fluorescência e está pronta para aquisição de imagens em um microscópio de fluorescência.

Um microscópio de fluorescência é equipado com uma fonte de luz poderosa. O feixe de luz passa primeiro por um filtro de excitação, que permite a passagem apenas da luz no comprimento de onda de excitação. A luz de excitação então atinge um espelho especializado, chamado espelho dicróico ou divisor de feixe, que é projetado para refletir seletivamente o comprimento de onda de excitação em direção a uma lente objetiva. A lente então focaliza a luz em uma pequena região da amostra. Ao atingir a amostra, a luz excita os fluoróforos, que então emitem a energia luminosa em um comprimento de onda diferente. Essa luz é transmitida de volta através da lente objetiva para o espelho dicróico. Como o comprimento de onda de emissão é diferente do comprimento de onda de excitação, o espelho dicróico permite a passagem da luz de emissão. Em seguida, ele passa por um segundo filtro, chamado filtro de emissão, que elimina a luz de quaisquer outros comprimentos de onda que possam estar presentes. Depois disso, os raios de luz agora atingem a ocular ou câmera, onde apresentam uma imagem ampliada criada a partir da luz emitida pelos fluoróforos específicos. Esta imagem representa a localização da proteína de interesse dentro da célula.

Os corantes fluorescentes de ligação ao DNA são frequentemente usados junto com a imunocoloração para rotular os núcleos como um ponto de referência dentro das células. Vários fluoróforos diferentes, com diferentes comprimentos de onda de emissão de excitação, podem ser usados para diferentes proteínas dentro da mesma amostra para comparar a localização das proteínas.

Este vídeo demonstra o procedimento de coloração imunofluorescente de uma proteína de interesse em uma amostra de tecido, seguido de imagens da amostra em um microscópio de fluorescência.

Antes de iniciar o processo de coloração, as seções, que foram desidratadas durante o processo de incorporação, precisam ser reidratadas. Para fazer isso, primeiro coloque as lâminas em um suporte de lâminas e, em seguida, mergulhe completamente as lâminas em isômeros 100% Xlene. Deixe as lâminas incubarem por três minutos. Em seguida, remova as lâminas do recipiente, limpe o excesso de xileno com uma toalha de papel e coloque-as em um novo banho de xileno em um recipiente novo, por mais três minutos. Repita esta incubação a cada vez em um novo recipiente com xileno fresco e limpe as lâminas com papel toalha antes de transferir para o novo recipiente, para um total de três incubações. Em seguida, incubar as seções em uma série de soluções graduadas de etanol, começando com etanol 100% por dois minutos. Limpe o suporte de lâminas com uma toalha de papel e transfira as lâminas para um novo recipiente de etanol 100% por mais dois minutos. Continuar o ciclo de lavagem, limpando o excesso de etanol com papel toalha e transferindo as lâminas para um novo banho, seguindo as concentrações indicadas de etanol pelo tempo especificado. Após a lavagem final com etanol, sacuda o excesso de solução e incube as lâminas em 1X PBS por cinco minutos.

Para iniciar o processo de coloração, primeiro circule as seções com uma caneta PAP para identificar a área mínima que os tampões precisam cobrir. Assim que as seções estiverem claramente marcadas no slide, adicione 100 microlitros de buffer de bloqueio a cada slide, certificando-se de cobrir toda a superfície da seção. Depois que os tecidos estiverem cobertos com tampão de bloqueio, coloque as lâminas em uma câmara umidificada. Deixe as lâminas incubarem por uma hora em temperatura ambiente.

Após o tempo de incubação desejado, remova o tampão de bloqueio drenando-o da lâmina. Em seguida, dilua o anticorpo primário no tampão de bloqueio. Para uma diluição de 1:100, adicione 990 microlitros de tampão de bloqueio a um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, seguido por 10 microlitros do anticorpo primário ao mesmo tubo. Rotule uma lâmina como controle e adicione 100 microlitros de buffer de bloqueio. Esse controle ajudará a identificar qualquer ligação não específica do anticorpo secundário. Agora, adicione 100 microlitros de tampão de anticorpo primário às lâminas restantes. Incube as seções durante a noite em uma câmara umidificada a quatro graus Celsius, no escuro.

Após a incubação durante a noite, remova as seções da câmara e drene o anticorpo primário de cada lâmina e o tampão de bloqueio do controle. Coloque as lâminas em um rack de slides e lave-as três vezes em 1X PBS por dez minutos cada. Enquanto as lâminas estão lavando em 1X PBS, dilua o anticorpo secundário no tampão de bloqueio. Para uma diluição de 1:200, adicione 995 microlitros de tampão de bloqueio a um tubo de 1,5 mililitro, seguido por cinco microlitros do anticorpo secundário ao mesmo tubo. Adicione o anticorpo secundário a todas as seções, incluindo o controle, e incube-os por uma hora em uma câmara umidificada protegida da luz. Quando o cronômetro soar, remova as lâminas da incubadora. Drene o anticorpo secundário das seções. Uma vez removido o anticorpo secundário, coloque as lâminas em um suporte de lâminas e, em seguida, mergulhe completamente as lâminas em 1X PBS por 10 minutos, protegidas da luz. Repita esta lavagem três vezes, usando PBS 1X fresco para cada lavagem. Após as lavagens, adicione duas a três gotas de mídia de montagem contendo DAPI a cada lâmina e coloque uma lamínula de vidro nas amostras. Deixe as lâminas secarem durante a noite em um local escuro antes de obter imagens das seções usando um escopo fluorescente.

Durante a imagem, os detalhes da captura da imagem dependerão do microscópio específico e do software disponível. No entanto, neste exemplo específico, o software Leica Application Suite, Versão 3. 8, é usado para realizar a análise. Usando este programa, clique na guia Adquirir e, no modo Aquisição de sobreposição de imagem, ative o DAPI e o RFP. Em seguida, ajuste a Exposição, o Ganho e a Gama para DAPI e RFP, tirando uma inicial usando as configurações padrão definidas pelo software e, em seguida, otimizando o brilho modificando o tempo de exposição e o ganho, tendo em mente que as configurações ideais mínimas são desejáveis para evitar a saturação da imagem e o fotobranqueamento das amostras. A gama pode ser modificada para otimizar as áreas mais escuras de uma imagem.

Depois que as configurações forem ajustadas, pressione o botão Adquirir sobreposição para criar imagens sobrepostas das exposições DAPI e RFP. Esta imagem de exemplo, capturada usando a técnica demonstrada, mostra uma seção de tumor mamário de camundongo, corada com o anticorpo F4 / 80, que detecta um antígeno, representado em vermelho, em macrófagos e outras células mieloides. Como a mídia de montagem contendo DAPI foi usada, os núcleos são mostrados em azul. Os dados da imagem fornecerão informações sobre a intensidade e localização da proteína na seção do tecido.

Por exemplo, na imagem do tumor corado com F4/80, observa-se a coloração da superfície celular desse antígeno. Esses dados também podem fornecer informações sobre a frequência de populações de células específicas na seção de tecido. Isso pode ser quantificado contando o número de células coradas positivamente, aqui mostradas em vermelho, e comparando-o com a população total de células, mostrada em azul, e calculando a frequência usando a seguinte equação.