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Advanced Biology

Análise do Ciclo Celular: Avaliação da Proliferação de Células T CD4 e CD8 Após Estimulação Usando Coloração CFSE e Citometria de Fluxo

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Immunology

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Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

5.9: Immunoprecipitation-Based Techniques: Purification of Endogenous Proteins Using Agarose Beads

5.11: Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

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10:57 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Perchet Thibaut^1,2,3, Meunier Sylvain^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
¹ Unidade de Linfísia, Departamento de Imunologia, Instituto Pasteur, Paris, França
² INSERM U1223, Paris, França
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, França
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, França

O ciclo celular é um processo universal de vida. Durante o ciclo celular, uma célula sofre várias modificações para se dividir em duas células filhas. Esse mecanismo ocorre ao longo da vida de um organismo em resposta às suas necessidades. Divisões celulares e desenvolvimento embrionário produzem um organismo completo a partir de um zigoto unicelular. Durante a idade adulta, o ciclo celular é central para muitos processos biológicos críticos, como reparos teciduais.

Mecanismos de divisão celular são eventos fortemente controlados onde a célula sofre modificações stepwise antes da divisão final. As células que ainda não estão no ciclo são descritas como estando na fase Gap 0 (G₀). Durante esta fase, a célula é considerada quiescente. Quando a célula começa a pedalar, quatro fases distintas são reconhecidas: Gap 1 (G_1),Síntese (S), Gap 2 (G₂) e Mitosis (M). A fase G₁ é um ponto de verificação para os recursos necessários pela célula para a síntese de DNA. Em seguida, ocorre a fase S, e a replicação do DNA começa, seguida pela interfase G_2, outro ponto de verificação que controla todos os elementos necessários para que a célula se divida. Finalmente, a célula entra na mitose e se divide em duas células filhas.

A divisão celular é um parâmetro altamente informativo em muitos sistemas biológicos diferentes. No campo da imunologia, a análise da proliferação de leucócitos pode indicar o mecanismo da resposta imune. Outros domínios da investigação também se baseiam na análise do ciclo celular. Por exemplo, a análise do ciclo celular durante o desenvolvimento do tumor melhorou nossa compreensão do câncer.

Muitos corantes fluorescentes estão agora disponíveis para rastrear a proliferação celular. Estes corantes diferem em suas propriedades químicas e espectrais. Existem duas classes diferentes de corantes: corantes proteicos se combinam permanentemente com proteínas formando uma ligação covalente, e corantes de membrana intercalam-se dentro das membranas celulares através de fortes associações hidrofóbicas. Estudos in vitro e in vivo de proliferação de células imunes por citometria de fluxo estão entre as aplicações mais comuns de ambas as classes de corantes de rastreamento celular (1, 2).

CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl é um corante fluorescente que marca células divisórias. Inicialmente, todas as células recebem a mesma quantidade de corante; dividindo células uniformemente dividir o corante que receberam entre suas duas células filhas. Consequentemente, o ciclo celular pode ser seguido pela diminuição progressiva da intensidade do corante nas células. A coloração do CFSE é seguida pela citometria de fluxo multiparamétrico convencional, uma tecnologia baseada em fluorescência de alto rendimento que permite caracterização fenotípica e funcional das células com base no seu grau de coloração de CFSE (3).

No experimento a seguir, avaliamos a proliferação de células CD4⁺ e CD8⁺ T in vitro,seguindo a estimulação do CD3, utilizando coloração de CFSE e citometria de fluxo.

Procedure

1. Preparação

Antes de começar, coloque luvas de laboratório e as roupas de proteção apropriadas.
Esterilize todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois limpe-as completamente.
Prepare 50 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

Usando um sistema de entrega de dióxido de carbono, eutanize o rato por hipóxia. Fixar o rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina e realizar uma laparotomia longitudinal usando tesouras e fórceps.
Usando fórceps, mova os intestinos e o estômago do lado direito do abdômen para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago.
Usando fórceps cuidadosamente desprender o baço do estômago e colocá-lo na placa de Petri contendo 5 mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

Coloque o baço em um coador de célula de 40 μm sobre a mesma placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo.
Transfira o baço dissociado e o fluido em um tubo centrífuga de 15 mL.
Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
Resuspenque a pelota em 2 mL de acetato de potássio para lise os eritrócitos. Aguarde 2 min e depois coma o volume de até 15 mL usando HBSS 2% FCS.
Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS.
Conte as células usando um ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração celular final para 10⁷ células/mL usando um volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Coloração de CFSE e Estimulação de células T

Distribua 10⁷ células de baço isolado/tubo em 4 tubos (tubos de 15 mL, rotulados de 1 a 4)
Adicione 3 mL HBSS 2% FCS a cada tubo.
Adicione 1 μL de CSFE em cada tubo (concentração final- 5 μM).
Incubar os tubos a 37°C em uma incubadora de CO₂ de 5% por 10 minutos.
Nos tubos 3 e 4, adicione 12 mL de HBSS 2% de TRFC + anticorpo anti-CD3 em uma concentração final de 2,5 μg/mL. Os tubos 3 e 4 são estimulados usando anticorpo anti-CD3, para observar o efeito no ciclo celular.
Nos tubos 1 e 2 adicione 12 mL de HBSS 2% FCS. As células nos tubos 1 e 2 não serão estimuladas.
Centrifugar todos os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte os supernantes.
Resuspense as pelotas em 2 mL de HBSS 2%FCS.
Transfira as soluções resultantes para poços separados em uma placa de 6 poços.
Incubar as células a 37°C, 5% de CO₂ por 3 dias.

5. Mancha celular

No dia 3, adicione 2 mL HBSS 2%FCS em bem 1 e 3.
Pipeto vigorosamente e transfira as amostras em tubos FACS de 5 mL.
Continue incubando as células restantes dos poços 2-4 a 37°C, 5% DE CO₂. Eles serão analisados no dia 5 para investigar os efeitos a longo prazo da estimulação no ciclo celular.
Centrifugar os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte os supernantes.
Adicione 100 μL de mistura de anticorpos (ver Tabela 1) a cada tubo.

Anticorpo	Fluorochrome	Diluição
CD3	Azul do Pacífico	1/100
CD4	BV786	1/1600
CD8	PE	1/400
Teu1.2	BV605	1/400

Tabela 1: Composição de mistura de anticorpos. Quatro preparações de coquetéis de anticorpos utilizando conjugados concentrados de anticorpos fluorescentes e HBSS.

Incubar os tubos por 20 minutos no gelo no escuro.
Adicione 1 mL de HBSS 2%FCS e centrifugar os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C.
Descarte o supernatante e resuspenque as pelotas em 200 μL de HBSS 2% FCS.
Transfira as pelotas resuspendadas para tubos FACS novos e rotulados.
Avalie a proliferação de células T usando FACS.
No dia 5, repita o processo de coloração celular com as células dos dois poços restantes da placa de 6 poços.

6. Análise de dados

Abra o software “FlowJo” e arraste os arquivos para a janela “All sample“.
Clique duas vezes no arquivo para células não estimuladas coletadas no dia 3 para exibir um gráfico de pontos com dispersão para a frente no eixo Y e dispersão lateral no eixo X.
Clique em “Polygon” e crie uma estratégia de gating para selecionar células linfoides, células Thy1.2⁺ CD3⁺ e distinguir células CD4⁺ e CD8⁺ (ver Figura 1).

Figura 1: Estratégia gating. As células são primeiro fechadas com base em sua morfologia (esquerda: FSC-A, SSC-A). As células T são então fechadas (meio: CD3, Thy1.2) e ainda divididas em células CD4⁺ T (laranja) e células CD8⁺ T (azul) (à direita: CD4, CD8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Repita os passos com outros arquivos.
Para determinar as frequências de células divisórias e não-divisórias, visualize primeiro as populações celulares clicando em “Editor de layout“.
Arraste as células CD4 T e cd8 T de cada um dos quatro tubos para a “janela de amostra“
Gráficos representando cada população aparecerão.
Use histograma para visualizar os resultados e selecione “CFSE” como parâmetro para comparação dos diferentes tubos e das diferentes populações.
Células não divisórias mantêm níveis mais elevados de CFSE, enquanto células proliferantes dividem o conteúdo de CFSE para células divisórias
Crie um portão em células não-divisórias e aplique-o em todos os tubos.
Crie um portão sobre células divisórias e aplique-o em todos os tubos.
Para examinar a frequência de células CD3+ divididas, clique em “Table editor“.
Arraste as populações de interesse – dividindo células T CD8 e dividindo células T CD4 – em “Tabela“.
No menu “Estatística“, selecione “frequência de células T“, em seguida, clique em “Criar tabela” para revelar a frequência em uma nova tabela.
Clique em “Criar tabela“. Para revelar os valores de frequência, apareça em uma nova tabela.

Para a maioria dos estudos de imunologia, medir a proliferação de células imunes é um passo fundamental e o método baseado em corante fluorescente CFSE é comumente usado. A divisão celular adequada é importante para as células imunes, uma vez que regula os níveis e a especificidade de uma resposta imune. Por exemplo, as células T proliferam para identificar e matar células cancerígenas e as células B sofrem divisão celular para produzir anticorpos específicos. A premissa geral do ensaio CSFE envolve a coloração das células com o corante fluorescente verde CFSE, que entra em células vivas e se liga às proteínas internas, resultando em rotulagem permanente. Como resultado, quando a célula pai contendo corante se divide, cada célula filha recebe metade da fluorescência da célula-mãe.

Este processo continua nas divisões subsequentes com a intensidade de corante diminuindo progressivamente a cada divisão. No ponto final desejado, a intensidade de fluorescência de cada célula é medida pela citometria de fluxo. Esses dados são então usados para quantificar o número e o padrão de divisões pelas qual as células passaram. Como mostrado aqui, a população celular com maior fluorescência é da geração dos pais. A segunda maior parte pertence à segunda geração e assim por diante. O número de picos determina o número de divisões celulares.

Além disso, se forem utilizadas células imunes primárias, populações celulares específicas, como as células T, por exemplo, podem ser rotuladas com um corante de fluorescência colorida diferente junto com a CFSE, e simultaneamente identificadas usando citometria de fluxo multicolorido. Os novos dados podem ser plotados no mesmo gráfico, mostrando agora a sub-população de células T com diferentes intensidades de coloração de CFSE, pelas quais a taxa de proliferação das células T pode ser especificamente analisada. Este vídeo demonstra o protocolo para a coloração CFSE de esplenócitos de camundongos, que são estimulados com um anticorpo anti-CD3. Isso é seguido pela coloração para rotular células T e citometria de fluxo para rastrear sua proliferação celular.

Para começar, coloque roupas de proteção adequadas e luvas de laboratório. Em seguida, lave um par de fórceps e dissecando uma tesoura primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois limpe-os com uma toalha de papel limpa. Prepare 50 mililitros da Solução de Sal Balanceado da Hank, ou HBSS, com uma concentração de 2% de soro de bezerro fetal, ou FCS, combinando um mililitro de FCS com 49 mililitros de HBSS em um tubo de 50 mililitros. Misture suavemente a solução para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes. Em seguida, isole as células do baço do rato, como demonstrado no protocolo de vídeo para o isolamento FACS de linfócitos B esplênicos.

Rotule quatro tubos de 15 mililitros de um a quatro e adicione uma vez 10 às sétimas células isoladas do baço. Em seguida, adicione três mililitros de HBSS 2% FCS a cada tubo. Em seguida, pipeta um microliter de cinco micromolar carboxyfluorescein succinimidyl éster, ou CFSE, em cada tubo. Incubar os tubos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% por 10 minutos. As células nos tubos um e dois não serão estimuladas. Eles serão usados para revelar o nível basal de proliferação de células T de CD4 e CD8.

Pipeta 10 mililitros de HBSS 2% FCS nestes tubos. Os tubos três e quatro serão estimulados por anticorpos anti-CD3, a fim de observar os efeitos no ciclo celular. Adicione 10 mililitros de HBSS 2% FCS e anticorpo anti-CD3 em uma concentração final de 2,5 microgramas por mililitro aos tubos três e quatro. Em seguida, centrifugar todos os tubos a 370 x g por sete minutos a 10 graus Celsius. Descarte os supernantes. Resuspenque as pelotas em dois mililitros de HBSS 2% FCS e pipeta as soluções resultantes em poços separados em uma placa de seis poços. Rotule cuidadosamente a placa de um a quatro para acompanhar as identidades das amostras. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por três dias.

No terceiro dia, adicione dois mililitros de HBSS 2% FCS aos poços um e três, que devem conter as células dos tubos um e três. Pipeta para cima e para baixo vigorosamente e, em seguida, transfira as amostras para tubos FACS rotulados de cinco mililitros. Coloque a placa de seis poços de volta na incubadora. Essas células remanescentes dos poços dois e quatro serão analisadas no quinto dia para investigar efeitos de longo prazo da estimulação no ciclo celular. Centrifugar os tubos a 370 x g por sete minutos a 10 graus Celsius e, em seguida, descartar os supernantes. Agora, adicione 100 microliters de mistura de anticorpos a cada tubo. Incubar os tubos por 20 minutos no gelo no escuro. Em seguida, adicione um mililitro de HBSS 2% DE FCS a cada tubo e centrifugar os tubos a 370 x g por sete minutos a 10 graus Celsius. Descarte os supernantes. Suspenda as pelotas em 200 mililitros de HBSS 2% FCS e misture bem. Transfira as pelotas resuspended para novos tubos FACS rotulados.

Em seguida, avalie a proliferação de células T usando a citometria de fluxo, como mostrado no protocolo FACS. Protea as células para selecionar células linfoides CD3-positivas e distinguir células CD4 positivos e CD8 positivos, e registrar os dados para tubos um e três. No quinto dia, repita o processo de coloração celular com as células dos dois poços restantes da placa de seis poços.

Analisaremos os efeitos da estimulação do CD3 no ciclo celular das células CD4 e CD8 positivos em três dias e cinco dias após a estimulação. Para começar, clique no ícone FlowJo e arraste seus arquivos para a janela Todas as amostras. Clique duas vezes no arquivo para as células não estimuladas coletadas no terceiro dia para exibir um gráfico de pontos com dispersão para a frente no eixo y e dispersão lateral no eixo x. Clique no polígono para circular as populações de linfócitos com base em sua morfologia. Na janela de identificação sub-populacional, nomeie os linfócitos populacionais e clique em OK. Em seguida, clique duas vezes na população circulada e na nova janela, selecione Thy1.2 no eixo y e CD3 no eixo x. Em seguida, clique no polígono para circular as células CD3 e Thy1.2 dupla positiva. Na nova janela de identificação sub-populacional, nomeie a população T-Cells e clique em OK. Em seguida, clique duas vezes na população circulada. Na nova janela, selecione CD4 no eixo y e CD8 no eixo x. Em seguida, clique no polígono para circular a população CD4 positiva. Na nova janela de identificação sub-populacional, nomeie a população CD4 T-Cells e clique em OK. Agora, clique no polígono para circular a população CD8 positiva. Na nova janela de identificação sub-populacional, nomeie a população CD8 T-Cells e clique em OK. Repita essas etapas com os outros arquivos.

Para determinar as frequências de células divisórias e não-divisórias, primeiro, visualize as populações celulares clicando no Editor de Layout. Em seguida, arraste as células T CD4 e cd8 t-cells de cada um dos quatro tubos para a janela All Sample. Gráficos representando suas populações aparecerão. Para cada tubo, clique duas vezes no gráfico de pontos para células T CD8 e selecione Histograma em Definição de Gráfico para visualizar os resultados. Selecione CFSE como parâmetro para comparar as populações celulares estimuladas versus não estimuladas em cada ponto de tempo. As células não-divisórias mantêm níveis mais elevados de CFSE, enquanto as células proliferadoras dividem o conteúdo do CFSE para células divisórias.

Agora, enquanto pressiona a tecla Shift, clique duas vezes no histograma. Na nova janela, clique no intervalo e selecione a faixa de CFSE correspondente ao pico mais alto. Na janela de identificação sub-populacional, nomeie a população não dividindo cd8 t-cells e rotule a população dividindo células CD8. Agora, repita para selecionar as células T CD4 que dividem e não dividem em cada tubo. Para examinar a frequência de células cd3 positivas, clique em Table Editor. Em seguida, arraste as populações de interesse, dividindo cd8 t-cells e dividindo cd4 t-cells, para a mesa. No menu Estatística, selecione Frequência de células T. Em seguida, clique em Criar tabela para revelar a frequência em uma nova tabela.

Results

Neste experimento, acompanhamos a proliferação de células BAçosa CD4⁺ e CD8⁺ T na cultura in vitro. Após 3 dias, não vimos forte proliferação em células CD4⁺ e CD8⁺ T com ou sem estimulação. Isso pode ser visto no painel superior da Figura 2 onde os picos de CSFE não estão diminuindo. No entanto, após 5 dias, começamos a ver proliferação em ambas as populações, o que é evidente a partir da diminuição dos picos de CSFE (painéis inferiores, Figura 2). A coloração do CFSE demonstra claramente que tanto as células CD4⁺ quanto CD8⁺ T estavam se dividindo mais após a estimulação. Além disso, as células CD8⁺ T pareciam ser um pouco mais proliferativas do que as células CD4⁺ T após 5 dias de estimulação.

Figura 2: Proliferação de células CD4 versus CD8 T. Proliferação de células T nos dias 3 (painel superior) e dia 5 (painel inferior). O ciclo celular é comparado entre células CD4 e CD8 T com ou sem estimulação em dois dias diferentes. As células CD4 e CD8 T proliferam mais quando estimuladas. As células T estimuladas pelo CD8 proliferam mais do que as células T estimuladas pelo CD4 no dia 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Applications and Summary

Ensaios de proliferação são frequentemente usados em diferentes campos, como a imunologia, para determinar o grau de ativação das células. Também é realizado no diagnóstico oncológico para determinar a agressividade tumoral em pacientes. A coloração de CFSE é uma técnica útil para acompanhar a proliferação das populações de células imunes ao longo do tempo. Outros métodos permitem a caracterização do ciclo celular. BrdU, um equivalente de CFSE é incorporado apenas em células divisórias. O modelo recente do mouse Fucci ainda permite a detecção de fases de ciclo celular, sem coloração adicional.

References

Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).

Transcript

For most immunology studies, measuring proliferation of immune cells is a key step and the CFSE fluorescent dye-based method is commonly used. Proper cell division is important for immune cells since it regulates both levels and specificity of an immune response. For example, T-cells proliferate to identify and kill cancer cells and B-cells undergo cell division to produce specific antibodies. The overall premise of the CSFE assay involves staining the cells with the green fluorescent dye CFSE, which enters live cells and stably binds to the proteins inside, resulting in permanent labeling. As a result, when the dye-containing parent cell divides, each daughter cell gets half the fluorescence from the parent cell.

This process continues in the subsequent divisions with the dye intensity progressively decreasing with each division. At the desired endpoint, the fluorescence intensity of each cell is measured by flow cytometry. This data is then used to quantify the number and pattern of divisions the cells have gone through. As shown here, the cell population with the highest fluorescence are from the parent generation. The second highest belongs to the second generation and so on. The number of peaks determines the number of cell divisions.

In addition, if primary immune cells are used, specific cell populations, like the T-cells for example, can be labeled with a different colored fluorescence dye along with CFSE, and simultaneously identified using multicolor flow cytometry. The new data can be plotted on the same graph, now showing the T-cell sub-population with different CFSE staining intensities, by which the proliferation rate of the T-cells can be specifically analyzed. This video demonstrates the protocol for CFSE staining of mouse splenocytes, which are stimulated with an anti-CD3 antibody. This is followed by staining to label T-cells and flow cytometry to track their cell proliferation.

To begin, put on appropriate protective clothing and laboratory gloves. Next, wash a pair of forceps and dissecting scissors first with a detergent and then with 70% ethanol and then wipe them dry with a clean paper towel. Prepare 50 milliliters of Hank’s Balanced Salt Solution, or HBSS, with a 2% concentration of fetal calf serum, or FCS, by combining one milliliter of FCS with 49 milliliters of HBSS in a 50 milliliter tube. Mix by gently pipetting the solution up and down approximately 10 times. Then, isolate mouse spleen cells as demonstrated in the video protocol for FACS isolation of splenic B-lymphocytes.

Label four 15-milliliter tubes one through four and add one times 10 to the seventh isolated spleen cells. Next, add three milliliters of HBSS 2% FCS to each tube. Then, pipette one microliter of five micromolar carboxyfluorescein succinimidyl ester, or CFSE, into each tube. Incubate the tubes at 37 degrees Celsius in a 5% carbon dioxide incubator for 10 minutes. The cells in tubes one and two will not be stimulated. They will be used to reveal the basal level of proliferation of splenic CD4 and CD8 T-cells.

Pipette 10 milliliters of HBSS 2% FCS into these tubes. Tubes three and four will be stimulated by anti-CD3 antibody in order to observe the effects on the cell cycle. Add 10 milliliters of HBSS 2% FCS and anti-CD3 antibody at a final concentration of 2.5 micrograms per milliliter to tubes three and four. Next, centrifuge all of the tubes at 370 x g for seven minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatants. Resuspend the pellets in two milliliters of HBSS 2% FCS and pipette the resulting solutions into separate wells on a six-well plate. Carefully label the plate from one to four to keep track of sample identities. Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5% CO2 for three days.

On day three, add two milliliters of HBSS 2% FCS to wells one and three, which should contain the cells from tubes one and three. Pipette up and down vigorously and then transfer the samples into labeled five-milliliter FACS tubes. Place the six-well plate back into the incubator. These remaining cells from wells two and four will be analyzed on day five to investigate long-term effects of stimulation on the cell cycle. Centrifuge the tubes at 370 x g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then discard the supernatants. Now, add 100 microliters of antibody mix to each tube. Incubate the tubes for 20 minutes on ice in the dark. Next, add one milliliter of HBSS 2% FCS to each tube and centrifuge the tubes at 370 x g for seven minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatants. Re-suspend the pellets in 200 milliliters of HBSS 2% FCS and mix well. Transfer the resuspended pellets to new labeled FACS tubes.

Then, evaluate T-cell proliferation using flow cytometry as shown in the FACS protocol. Gate the cells to select lymphoid CD3-positive cells and to distinguish CD4-positive and CD8-positive cells, and record the data for tubes one and three. On day five, repeat the cell-staining process with the cells from the remaining two wells of the six-well plate.

We will analyze the effects of CD3 stimulation on the cell cycle of CD4 and CD8-positive cells at three days and five days post-stimulation. To begin, click on the FlowJo icon and drag your files into the All Sample window. Double-click on the file for the unstimulated cells collected on day three to display a dot plot with forward scatter on the y-axis and side scatter on the x-axis. Click on polygon to circle the lymphocyte populations based on their morphology. In the sub-population identification window, name the population lymphocytes and click OK. Next, double-click on the circled population and in the new window, select Thy1.2 on the y-axis and CD3 on the x-axis. Then, click on polygon to circle the CD3 and Thy1.2 double positive cells. In the new sub-population identification window, name the population T-Cells and click OK. Next, double-click on the circled population. In the new window, select CD4 on the y-axis and CD8 on the x-axis. Then, click on polygon to circle the CD4-positive population. In the new sub-population identification window, name the population CD4 T-Cells and click OK. Now, click on polygon to circle the CD8-positive population. In the new sub-population identification window, name the population CD8 T-Cells and click OK. Repeat these steps with the other files.

To determine the frequencies of dividing and non-dividing cells, first, visualize the cell populations by clicking on Layout Editor. Then, drag the CD4 T-cells and CD8 T-cells from each of the four tubes to the All Sample window. Graphs representing your populations will appear. For each tube, double-click on the dot plot for CD8 T-cells and select Histogram under Graph Definition to visualize the results. Select CFSE as the parameter to compare the stimulated versus unstimulated cell populations at each time point. Non-dividing cells maintain higher levels of CFSE whereas proliferating cells split the content of CFSE to dividing cells.

Now, while pressing the Shift key, double-click on the histogram. In the new window, click range and select the range of CFSE corresponding to the highest peak. In the sub-population identification window, name the population Non-Dividing CD8 T-Cells and label the population Dividing CD8 Cells. Now, repeat to select the dividing and non-dividing CD4 T-cells in each tube. To examine the frequency of dividing CD3-positive cells, click on Table Editor. Then, drag the populations of interest, Dividing CD8 T-Cells and Dividing CD4 T-Cells, into table. On the Statistic menu, select Frequency of T-cells. Then, click on Create Table to reveal the frequency in a new table.

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