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Para a maioria dos estudos de imunologia, medir a proliferação de células imunes é uma etapa fundamental e o método baseado em corante fluorescente CFSE é comumente usado. A divisão celular adequada é importante para as células imunológicas, pois regula os níveis e a especificidade de uma resposta imune. Por exemplo, as células T proliferam para identificar e matar células cancerígenas e as células B sofrem divisão celular para produzir anticorpos específicos. A premissa geral do ensaio CSFE envolve a coloração das células com o corante fluorescente verde CFSE, que entra nas células vivas e se liga de forma estável às proteínas internas, resultando em marcação permanente. Como resultado, quando a célula-mãe contendo corante se divide, cada célula-filha recebe metade da fluorescência da célula-mãe.
Este processo continua nas divisões subsequentes, com a intensidade do corante diminuindo progressivamente a cada divisão. No ponto final desejado, a intensidade de fluorescência de cada célula é medida por citometria de fluxo. Esses dados são então usados para quantificar o número e o padrão de divisões pelas quais as células passaram. Como mostrado aqui, a população de células com a maior fluorescência é da geração original. O segundo mais alto pertence à segunda geração e assim por diante. O número de picos determina o número de divisões celulares.
Além disso, se células imunes primárias forem usadas, populações de células específicas, como as células T, por exemplo, podem ser marcadas com um corante de fluorescência de cor diferente junto com CFSE e identificadas simultaneamente usando citometria de fluxo multicolorida. Os novos dados podem ser plotados no mesmo gráfico, agora mostrando a subpopulação de células T com diferentes intensidades de coloração CFSE, pela qual a taxa de proliferação das células T pode ser analisada especificamente. Este vídeo demonstra o protocolo para coloração CFSE de esplenócitos de camundongos, que são estimulados com um anticorpo anti-CD3. Isso é seguido por coloração para marcar células T e citometria de fluxo para rastrear sua proliferação celular.
Para começar, coloque roupas de proteção adequadas e luvas de laboratório. Em seguida, lave uma pinça e uma tesoura de dissecação primeiro com detergente e depois com etanol a 70% e depois seque-as com uma toalha de papel limpa. Prepare 50 mililitros de Hank's Balanced Salt Solution, ou HBSS, com uma concentração de 2% de soro fetal de bezerro, ou FCS, combinando um mililitro de FCS com 49 mililitros de HBSS em um tubo de 50 mililitros. Misture pipetando suavemente a solução para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes. Em seguida, isole as células do baço de camundongo conforme demonstrado no protocolo de vídeo para isolamento FACS de linfócitos B esplênicos.
Rotule quatro tubos de 15 mililitros de um a quatro e adicione um vezes 10 às sétimas células isoladas do baço. Em seguida, adicione três mililitros de HBSS 2% FCS a cada tubo. Em seguida, pipete um microlitro de cinco micromolares carboxifluoresceína éster succinimidílico, ou CFSE, em cada tubo. Incube os tubos a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono por 10 minutos. As células nos tubos um e dois não serão estimuladas. Eles serão usados para revelar o nível basal de proliferação de células T CD4 e CD8 esplênicas.
Pipete 10 mililitros de HBSS 2% FCS nesses tubos. Os tubos três e quatro serão estimulados por anticorpo anti-CD3 a fim de observar os efeitos no ciclo celular. Adicione 10 mililitros de HBSS 2% FCS e anticorpo anti-CD3 a uma concentração final de 2,5 microgramas por mililitro aos tubos três e quatro. Em seguida, centrifugue todos os tubos a 370 x g por sete minutos a 10 graus Celsius. Descarte os sobrenadantes. Ressuspenda os pellets em dois mililitros de HBSS 2% FCS e pipete as soluções resultantes em poços separados em uma placa de seis poços. Rotule cuidadosamente a placa de um a quatro para acompanhar as identidades das amostras. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por três dias.
No terceiro dia, adicione dois mililitros de HBSS 2% FCS aos poços um e três, que devem conter as células dos tubos um e três. Pipete vigorosamente para cima e para baixo e, em seguida, transfira as amostras para tubos FACS de cinco mililitros rotulados. Coloque a placa de seis poços de volta na incubadora. Essas células restantes dos poços dois e quatro serão analisadas no quinto dia para investigar os efeitos a longo prazo da estimulação no ciclo celular. Centrifugar os tubos a 370 x g durante sete minutos a 10 graus Celsius e rejeitar em seguida os sobrenadantes. Agora, adicione 100 microlitros de mistura de anticorpos a cada tubo. Incube os tubos por 20 minutos no gelo no escuro. Em seguida, adicione um mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo e centrifugue os tubos a 370 x g por sete minutos a 10 graus Celsius. Descarte os sobrenadantes. Ressuspenda os pellets em 200 mililitros de HBSS 2% FCS e misture bem. Transfira os pellets ressuspensos para novos tubos FACS rotulados.
Em seguida, avalie a proliferação de células T usando citometria de fluxo, conforme mostrado no protocolo FACS. Gate as células para selecionar células linfóides CD3-positivas e distinguir células CD4-positivas e CD8-positivas, e registre os dados para os tubos um e três. No quinto dia, repita o processo de coloração celular com as células dos dois poços restantes da placa de seis poços.
Analisaremos os efeitos da estimulação de CD3 no ciclo celular de células CD4 e CD8-positivas em três dias e cinco dias pós-estimulação. Para começar, clique no ícone FlowJo e arraste seus arquivos para a janela Todas as amostras. Clique duas vezes no arquivo das células não estimuladas coletadas no terceiro dia para exibir um gráfico de pontos com dispersão direta no eixo y e dispersão lateral no eixo x. Clique no polígono para circular as populações de linfócitos com base em sua morfologia. Na janela de identificação da subpopulação, nomeie os linfócitos da população e clique em OK. Em seguida, clique duas vezes na população circulada e, na nova janela, selecione Thy1.2 no eixo y e CD3 no eixo x. Em seguida, clique no polígono para circundar as células duplamente positivas CD3 e Thy1.2. Na nova janela de identificação da subpopulação, nomeie as células T da população e clique em OK. Em seguida, clique duas vezes na população circulada. Na nova janela, selecione CD4 no eixo y e CD8 no eixo x. Em seguida, clique no polígono para circular a população CD4-positiva. Na nova janela de identificação da subpopulação, nomeie a população como Células T CD4 e clique em OK. Agora, clique no polígono para circular a população CD8-positiva. Na nova janela de identificação da subpopulação, nomeie a população como Células T CD8 e clique em OK. Repita essas etapas com os outros arquivos.
Para determinar as frequências de células divisórias e não divisórias, primeiro visualize as populações de células clicando em Editor de layout. Em seguida, arraste as células T CD4 e as células T CD8 de cada um dos quatro tubos para a janela Todas as amostras. Gráficos representando suas populações aparecerão. Para cada tubo, clique duas vezes no gráfico de pontos para células T CD8 e selecione Histograma em Definição de gráfico para visualizar os resultados. Selecione CFSE como parâmetro para comparar as populações de células estimuladas versus não estimuladas em cada ponto de tempo. As células que não se dividem mantêm níveis mais altos de CFSE, enquanto as células em proliferação dividem o conteúdo de CFSE em células em divisão.
Agora, enquanto pressiona a tecla Shift, clique duas vezes no histograma. Na nova janela, clique em intervalo e selecione o intervalo de CFSE correspondente ao pico mais alto. Na janela de identificação da subpopulação, nomeie a população como Células T CD8 não divididas e rotule a população como Células CD8 em divisão. Agora, repita para selecionar as células T CD4 que se dividem e não se dividem em cada tubo. Para examinar a frequência de divisão de células CD3-positivas, clique em Editor de Tabelas. Em seguida, arraste as populações de interesse, Dividindo células T CD8 e Dividindo células T CD4, para a tabela. No menu Estatística, selecione Frequência de células T. Em seguida, clique em Criar tabela para revelar a frequência em uma nova tabela.
