Análise do Ciclo Celular: Avaliação da Proliferação de Células T CD4 e CD8 Após Estimulação Usando Coloração CFSE e Citometria de Fluxo

1. Preparação

1. Antes de começar, coloque luvas de laboratório e as roupas de proteção apropriadas.
2. Esterilize todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois limpe-as completamente.
3. Prepare 50 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

1. Usando um sistema de entrega de dióxido de carbono, eutanize o rato por hipóxia. Fixar o rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina e realizar uma laparotomia longitudinal usando tesouras e fórceps.
2. Usando fórceps, mova os intestinos e o estômago do lado direito do abdômen para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago.
3. Usando fórceps cuidadosamente desprender o baço do estômago e colocá-lo na placa de Petri contendo 5 mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

1. Coloque o baço em um coador de célula de 40 μm sobre a mesma placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo.
2. Transfira o baço dissociado e o fluido em um tubo centrífuga de 15 mL.
3. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
4. Resuspenque a pelota em 2 mL de acetato de potássio para lise os eritrócitos. Aguarde 2 min e depois coma o volume de até 15 mL usando HBSS 2% FCS.
5. Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS.
6. Conte as células usando um ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração celular final para 10⁷ células/mL usando um volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Coloração de CFSE e Estimulação de células T

1. Distribua 10⁷ células de baço isolado/tubo em 4 tubos (tubos de 15 mL, rotulados de 1 a 4)
2. Adicione 3 mL HBSS 2% FCS a cada tubo.
3. Adicione 1 μL de CSFE em cada tubo (concentração final- 5 μM).
4. Incubar os tubos a 37°C em uma incubadora de CO₂ de 5% por 10 minutos.
5. Nos tubos 3 e 4, adicione 12 mL de HBSS 2% de TRFC + anticorpo anti-CD3 em uma concentração final de 2,5 μg/mL. Os tubos 3 e 4 são estimulados usando anticorpo anti-CD3, para observar o efeito no ciclo celular.
6. Nos tubos 1 e 2 adicione 12 mL de HBSS 2% FCS. As células nos tubos 1 e 2 não serão estimuladas.
7. Centrifugar todos os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte os supernantes.