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A transferência de células adotivas é um método para introduzir células de interesse em um organismo. É uma técnica poderosa para estudar vários mecanismos biológicos, incluindo a ação de classes específicas de células imunológicas. Além disso, a transferência adotiva é um novo tratamento promissor para várias condições, como aquelas que requerem transplantes de medula óssea ou tratamentos de câncer, onde as células T do próprio paciente podem ser extraídas, alteradas para reconhecer e destruir as células cancerígenas e, em seguida, devolvidas ao corpo para combater tumores.
Em laboratório, modelos animais são frequentemente usados para estudar a transferência adotiva. Por exemplo, camundongos nocaute para CD45.1 Rag gama-c carecem de receptores fundamentais para muitas citocinas, que são essenciais para a diferenciação normal de células-tronco hematopoiéticas em linfócitos. Como resultado, os camundongos knockout têm um desenvolvimento de linfócitos comprometido e não possuem células natural killer, ou NK, células T ou células B.
A transferência adotiva pode ser usada para introduzir as células imunes ausentes nesses camundongos comprometidos, coletando primeiro tecido de camundongo doador contendo altas concentrações de células imunológicas, como o baço. O tecido é então dissociado e uma variedade de células do baço, incluindo as células imunológicas, são isoladas. Em seguida, eritrócitos indesejados, ou glóbulos vermelhos, podem ser lisados por meio da adição de tampão de lise de potássio de cloreto de amônio e os glóbulos brancos restantes, ou esplenócitos, são então separados dos detritos celulares usando centrifugação.
Finalmente, os esplenócitos purificados são injetados nos camundongos imunocomprometidos, facilitando estudos detalhados das funções dessas células. Vários dias depois, o sucesso da transferência de células imunes adotivas pode ser confirmado primeiro isolando e preparando os esplenócitos do hospedeiro da mesma maneira que o tecido doador. Em seguida, essas células são coradas usando anticorpos marcados contra os marcadores de células imunes do doador para que possam ser verificadas e classificadas usando FACS.
Para começar, coloque luvas de laboratório e o equipamento de proteção adequado. Em seguida, lave uma pinça e uma tesoura de dissecação primeiro com um detergente e depois com etanol a 70% e depois seque-as com uma toalha de papel limpa. Prepare 50 mililitros de Hank's Balanced Salt Solution, ou HBSS, com 2% de soro fetal de bezerro, ou FCS, combinando um mililitro de FCS com 49 mililitros de HBSS em um tubo de 50 mililitros. Misture pipetando suavemente a solução para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes.
Disseque o camundongo sacrificado e remova seu baço, conforme demonstrado no protocolo de vídeo JoVE Tecnologia FACS para separação de linfócitos B esplênicos. Para isolar as células imunológicas, primeiro coloque o baço em um filtro de células de 40 micrômetros em uma placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo no prato. Recupere as células aderidas enxaguando o êmbolo e o filtro com 1 mililitro de HBSS 2% FCS. Em seguida, pipetar o baço dissociado e o líquido da placa de Petri para um tubo de centrifugação de 50 mililitros. Lave a placa de Petri com 5 mililitros de HBSS 2% FCS e transfira o fluido para o tubo de 15 mililitros.
Centrifugue o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius e, em seguida, recupere o tubo com cuidado para não perturbar o pellet. Agora, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet e descarte o líquido em um recipiente de lixo apropriado. Em seguida, adicione dois mililitros de tampão de lise de potássio de cloreto de amônio ao tubo da centrífuga e pipete para cima e para baixo para ressuspender o pellet e lisar os eritrócitos. Aguarde dois minutos e, em seguida, adicione HBSS 2% FCS ao pellet ressuspenso para obter um valor total de 14 mililitros. Repita a centrifugação. Recupere o tubo com cuidado e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em 5 mililitros HBSS 2% FCS pipetando para cima e para baixo. Em seguida, conte as células em suspensão. Adicione cinco microlitros de azul de tripano a cinco microlitros de suspensão celular e misture bem por pipetagem. Em seguida, deposite suavemente uma gota de cinco microlitros de suspensão de células diluídas entre a lamínula e a lâmina de Malassez. Com o microscópio ajustado para ampliação de 40X, conte o número de células. Ajuste a concentração da célula para 10 elevado a sete células por mililitro, adicionando o volume apropriado de HBSS 2% FCS.
Para iniciar a transferência adotiva, transfira dois mililitros da suspensão celular para um tubo de coleta de cinco mililitros. Centrifugar o tubo a 370 vezes g durante sete minutos a 10 graus Celsius e rejeitar em seguida o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato e centrifugue o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius. Descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de solução salina tamponada com fosfato. Usando uma seringa de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 29, injete 200 microlitros de suspensão celular no camundongo experimental por via intravenosa no seio sanguíneo retroorbital.
Quatro dias após a transferência adotiva, eutanasiar os camundongos e remover os baços. Em seguida, colha as células imunes conforme descrito na seção três. Em seguida, transfira 100 microlitros de suspensão celular de cada camundongo para dois tubos FACS rotulados como controle e transferidos. Centrifugar os tubos a 370 vezes g durante sete minutos a 10 graus Celsius e rejeitar em seguida os sobrenadantes. Agora, prepare uma mistura contendo os quatro anticorpos na diluição listada na tabela um. Adicione 100 microlitros da mistura a cada tubo e incube por 20 minutos no gelo no escuro. Em seguida, adicione um mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo e, em seguida, centrifugue os tubos a 370 vezes g por três minutos a 10 graus Celsius. Descarte os sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 200 microlitros de HBSS 2% FCS. Transfira as células ressuspensas para novos tubos FACS rotulados. Agora, use a citometria de fluxo conforme mostrado no protocolo FACS para avaliar a presença de CD45. 2 linfócitos positivos.
Agora, vamos determinar a presença de linfócitos CD45.2 que foram isolados do CD45. 1 baço hospedeiro. Para começar, clique duas vezes no ícone do FlowJo e arraste os arquivos de cada tubo na janela de todas as amostras. Em seguida, clique duas vezes no arquivo transferido para exibir as células registradas dessa amostra em um gráfico de pontos que exibe FSCA de dispersão direta no eixo x e SSCA de dispersão lateral no eixo y. Clique no polígono para circular as populações de linfócitos. Uma nova janela de identificação de subpopulação é exibida. Clique em OK. Agora, defina o eixo y para FSC-W e o eixo x para FSC-A. Selecione a população de célula única com a ferramenta de polígono, conforme demonstrado anteriormente.
Em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela para as células selecionadas. Na nova janela, selecione CD45.2 no Y e CD45.1 no X. Clique no ícone T e personalize o eixo para ampliar o gráfico. Em seguida, clique no polígono para circular as células CD45.2 positivas. Na janela de identificação da subpopulação, nomeie as células transferidas da população de células e clique em OK. Na mesma janela, clique em retângulo para selecionar as células negativas CD45.2. Na janela de identificação da subpopulação, nomeie as células hospedeiras da população de células e clique em OK. Em seguida, clique duas vezes na população circulada CD45.2, população transferida, para criar uma nova janela para as células selecionadas. Na nova janela, selecione CD3 no Y e CD4 no X.
Em seguida, clique no polígono para circular as células CD4 CD3 positivas. Nesta janela de identificação de subpopulação, nomeie sua população de células CD4 transferidas. Em seguida, repita as etapas de análise anteriores com o arquivo de mouse de controle. Por fim, para visualizar suas populações de células, clique em Editor de layout. Arraste as células transferidas e a população de células CD4 transferidas dos arquivos transferidos e de controle para a guia Editor de layout. Um gráfico de pontos representando células CD45.2 positivas e linfócitos CD4 aparecerá. CD45. 2 células transferidas devem aparecer apenas no gráfico de pontos do mouse transferido.
