Transferência de células adotivas: introduzindo esplenócitos de camundongos doadores para um camundongo hospedeiro e avaliando o sucesso via FACS

1. Preparação

1. Antes de começar, coloque luvas de laboratório e as roupas de proteção apropriadas.
2. Esterilize todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque bem.
3. Prepare 50 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

1. Usando um sistema de entrega de dióxido de carbono, eutanize o rato por hipóxia. Fixar o rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina e realizar uma laparotomia longitudinal usando tesouras e fórceps.
2. O uso de fórceps move os intestinos e o estômago do lado direito do abdômen para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago.
3. Usando fórceps cuidadosamente desprender o baço do estômago e colocá-lo na placa de Petri contendo 5 mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

1. Coloque o baço em um coador de célula de 40 μm sobre a placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo.
2. Recupere as células aderidas enxaguando o êmbolo e o coador com 1 mL de HBSS 2% FCS.
3. Transfira o baço dissociado e o fluido em um tubo centrífuga de 15 mL.
4. Lave a placa de Petri com 5 mililitros de HBSS 2% FCS e transfira o fluido para o tubo de 15 mL.
5. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
6. Resuspenque a pelota em 2 mL de cloreto de amônio de potássio para cima e para baixo para resuspensar a pelota e lise os eritrócitos.
7. Aguarde 2 min e adicione HBSS 2% FCS à pelota resuspended para obter o volume de até 14 mL.
8. Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS por pipetar para cima e para baixo.
9. Conte as células usando o ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração final da célula para 10⁷ células/mL usando o volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Transferência Adotiva

1. Transfira 2 mL de suspensão celular obtida em um tubo de coleta de 5 mL.
2. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e, em seguida, descartar o supernasal.
3. Resuspenda a pelota em 2 mL de PBS e centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C.
4. Descarte a supernasce e a pelota resuspend em 200 μL de PBS.
5. Usando uma seringa de 0,5 mL com uma agulha de 29G injete 200 μL de suspensão celular no camundongo experimental intravenosamente no seio sanguíneo retro-orbital.
6. Como controle, injete um segundo rato no mesmo seio sanguíneo com 200 μL de soro fisco tamponado.

5. Colheita e Coloração de Células

1. Quatro dias após a transferência adotiva, eutanásia ratos e remover o baço.
2. Colher os esplenócitos como descrito na seção 3.
3. Transfira 100 μL de suspensões celulares de cada mouse para dois tubos FACS, rotulados como "controle" e "transferidos".
4. Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e, em seguida, descartar os sobrenantes.
5. Prepare uma mistura contendo os quatro anticorpos nas diluições listadas na Tabela 1.

Anticorpos	Fluorochrome	Diluição
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

Tabela 1: Mistura de anticorpos. Preparação de quatro coquetéis anticorpos utilizando conjugados concentrados de anticorpos fluorescentes e HBSS.

6. Adicione 100 μL da mistura a cada tubo e, em seguida, incubar por 20 minutos no gelo no escuro.
7. Adicione 1 mL de HBSS 2%FCS e, em seguida, centrifugar os tubos a 370 x g por 3 min a 10°C.
8. Descarte os supernantes e resuspenque as pelotas em 200 μL de HBSS 2% FCS.
9. Transfira as células resuspendadas para tubos FACS novos e rotulados.
10. Utilizando citometria de fluxo, como mostrado no protocolo FACS, avaliar a presença de linfócitos positivos CD45.2.

6. Análise de dados

1. Abra o software "FlowJo" e arraste os arquivos para cada tubo na janela "All sample".
2. Clique duas vezes no arquivo "transferido" para exibir as células gravadas a partir dessa amostra em um gráfico de ponto que exibe a dispersão para a frente "SSC-A" no eixo Y e dispersão lateral "FSC-A" no eixo X.
3. Clique em "polígono" e crie uma estratégia de gating para selecionar linfócitos, em seguida, distinguir células doadoras e hospedeiras usando marcadores de superfície celular (CD45.1, CD45.2), e então caracterizar CD45.2⁺ população celular (CD3, CD4).
4. Repita as etapas de análise com o arquivo "mouse de controle".
5. Para visualizar uma população celular, clique em "Editor de layout".
6. Arraste as "células transferidas" e as "células CD4" transferidas " população de "transferido" e "controle" arquivos para a "guia Layout Editor".
7. Um gráfico de pontos representando células CD45.2⁺ e linfócitos CD4 aparecerá.
8. As células transferidas CD45.2 só devem aparecer no gráfico de pontos "mouse transferido".