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Advanced Biology

Transferência de células adotivas: introduzindo esplenócitos de camundongos doadores para um camundongo hospedeiro e avaliando o sucesso via FACS

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Immunology

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Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

5.10: Cell Cycle Analysis: Assessing CD4 and CD8 T Cell Proliferation After Stimulation Using CFSE Staining and Flow Cytometry

5.12: Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

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11:04 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
¹ Unidade de Linfopose, Departamento de Imunologia, Instituto Pasteur, Paris, França
² INSERM U1223, Paris, França
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, França
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, França

A transferência de células adotivas é um método para introduzir células em um paciente ou organismo de estudo, a fim de tratar uma doença ou estudar um processo biológico, como a hematose. Os objetivos da transferência adotiva são diversos; pode ser usado em biologia fundamental, bem como em ciências médicas (1, 2). Nos modelos de camundongos, a migração e distribuição de células transferidas pode ser estudada e seguida por um sistema de rastreamento (marcador de superfície celular, coloração por CFSE, etc.). Em estudos sobre câncer em modelos de camundongos, a transferência de populações celulares específicas pode ser usada como tratamento experimental contra tumores. Outro exemplo para esta técnica é a criação de camundongos quiméricos por transferência de células de medula óssea para camundongos irradiados ou camundongos com um fenótipo de imunodeficiência grave. Este modelo de mouse pode ser usado para avaliar o impacto da exclusão genética em uma população celular específica, por exemplo. A transferência de células emprestadas ósseas também é usada no tratamento médico humano. Quando os pacientes são irradiados em caso de terapia contra o câncer, a transferência adotiva da medula óssea permite a reconstituição do sistema imunológico.

O primeiro passo dessa técnica é obter a população celular de interesse. A técnica escolhida para isolar essa população depende do nível de especificidade da população-alvo. O maior nível de seleção é todo o órgão, no qual todas as populações celulares presentes no órgão são tomadas. Um método mais preciso é a seleção de uma população celular alvo, muitas vezes selecionada por um marcador de superfície celular. O método ideal para classificar as células neste caso é por classificação magnética. Finalmente, o nível mais rigoroso é a seleção de células por vários marcadores de superfície celular para classificar populações celulares muito específicas. A classificação da citometria de fluxo é o método mais popular para este nível de seleção. Uma vez que a população de interesse é obtida, ela pode ser transferida para o hospedeiro. Antes da transferência adotiva é essencial garantir a compatibilidade entre o hospedeiro e o doador. De fato, independentemente do objetivo de transferência, a compatibilidade é crucial para garantir a adoção de células pelo hospedeiro sem rejeição celular.

Neste exercício de laboratório, demonstramos a técnica de transferência celular adotiva transferindo esplenócitos de um rato CD45.2 para um rato RAGΓC CD45.1 (sem linfócitos) e quatro dias depois confirmamos a transferência de esplenócitos usando citometria de fluxo (ver Figura 1).

Figura 1: Representação esquemática da transferência adotiva. (1) Os esplenócitos são isolados de camundongos CD45.2 e (2) transferidos em mouse CD45.1 Ragγc, o mouse de controle é injetado apenas com PBS. (3) 4 dias após a transferência adotiva, os esplenócitos são recuperados de camundongos e (4) analisados por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Procedure

1. Preparação

Antes de começar, coloque luvas de laboratório e as roupas de proteção apropriadas.
Esterilize todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque bem.
Prepare 50 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).

2. Dissecção

Usando um sistema de entrega de dióxido de carbono, eutanize o rato por hipóxia. Fixar o rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina e realizar uma laparotomia longitudinal usando tesouras e fórceps.
O uso de fórceps move os intestinos e o estômago do lado direito do abdômen para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago.
Usando fórceps cuidadosamente desprender o baço do estômago e colocá-lo na placa de Petri contendo 5 mL de HBSS 2% FCS.

3. Isolamento de células imunes

Coloque o baço em um coador de célula de 40 μm sobre a placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo.
Recupere as células aderidas enxaguando o êmbolo e o coador com 1 mL de HBSS 2% FCS.
Transfira o baço dissociado e o fluido em um tubo centrífuga de 15 mL.
Lave a placa de Petri com 5 mililitros de HBSS 2% FCS e transfira o fluido para o tubo de 15 mL.
Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
Resuspenque a pelota em 2 mL de cloreto de amônio de potássio para cima e para baixo para resuspensar a pelota e lise os eritrócitos.
Aguarde 2 min e adicione HBSS 2% FCS à pelota resuspended para obter o volume de até 14 mL.
Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS por pipetar para cima e para baixo.
Conte as células usando o ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração final da célula para 10⁷ células/mL usando o volume apropriado de HBSS 2% FCS.

4. Transferência Adotiva

Transfira 2 mL de suspensão celular obtida em um tubo de coleta de 5 mL.
Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e, em seguida, descartar o supernasal.
Resuspenda a pelota em 2 mL de PBS e centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C.
Descarte a supernasce e a pelota resuspend em 200 μL de PBS.
Usando uma seringa de 0,5 mL com uma agulha de 29G injete 200 μL de suspensão celular no camundongo experimental intravenosamente no seio sanguíneo retro-orbital.
Como controle, injete um segundo rato no mesmo seio sanguíneo com 200 μL de soro fisco tamponado.

5. Colheita e Coloração de Células

Quatro dias após a transferência adotiva, eutanásia ratos e remover o baço.
Colher os esplenócitos como descrito na seção 3.
Transfira 100 μL de suspensões celulares de cada mouse para dois tubos FACS, rotulados como “controle” e “transferidos”.
Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e, em seguida, descartar os sobrenantes.
Prepare uma mistura contendo os quatro anticorpos nas diluições listadas na Tabela 1.

Anticorpos	Fluorochrome	Diluição
CD45.1	BV711	1/200
CD45.2	APCCy7	1/400
CD4	BV786	1/1600
CD3	BV421	1/200

Tabela 1: Mistura de anticorpos. Preparação de quatro coquetéis anticorpos utilizando conjugados concentrados de anticorpos fluorescentes e HBSS.

Adicione 100 μL da mistura a cada tubo e, em seguida, incubar por 20 minutos no gelo no escuro.
Adicione 1 mL de HBSS 2%FCS e, em seguida, centrifugar os tubos a 370 x g por 3 min a 10°C.
Descarte os supernantes e resuspenque as pelotas em 200 μL de HBSS 2% FCS.
Transfira as células resuspendadas para tubos FACS novos e rotulados.
Utilizando citometria de fluxo, como mostrado no protocolo FACS, avaliar a presença de linfócitos positivos CD45.2.

6. Análise de dados

Abra o software “FlowJo” e arraste os arquivos para cada tubo na janela “All sample“.
Clique duas vezes no arquivo “transferido” para exibir as células gravadas a partir dessa amostra em um gráfico de ponto que exibe a dispersão para a frente “SSC-A” no eixo Y e dispersão lateral “FSC-A” no eixo X.
Clique em “polígono” e crie uma estratégia de gating para selecionar linfócitos, em seguida, distinguir células doadoras e hospedeiras usando marcadores de superfície celular (CD45.1, CD45.2), e então caracterizar CD45.2⁺ população celular (CD3, CD4).
Repita as etapas de análise com o arquivo “mouse de controle“.
Para visualizar uma população celular, clique em “Editor de layout“.
Arraste as “células transferidas” e as “células CD4” transferidas ” população de “transferido” e “controle” arquivos para a “guia Layout Editor“.
Um gráfico de pontos representando células CD45.2⁺ e linfócitos CD4 aparecerá.
As células transferidas CD45.2 só devem aparecer no gráfico de pontos “mouse transferido“.

Transferência de células adotivas é um método para introduzir células de interesse em um organismo. É uma técnica poderosa para estudar vários mecanismos biológicos, incluindo a ação de classes específicas de células imunes. Além disso, a transferência adotiva é um tratamento promissor para inúmeras condições, como aquelas que necessitam de transplantes de medula óssea ou tratamentos de câncer onde as próprias células T de um paciente podem ser extraídas, alteradas para reconhecer e destruir as células cancerosas, e depois devolvidas ao corpo para combater tumores.

No laboratório, modelos animais são frequentemente usados para estudar transferência adotiva. Por exemplo, os camundongos de nocaute de origem gamma-c de rag não possuem receptores fundamentais para muitas citocinas, que são essenciais para a diferenciação normal de células-tronco hematopoiéticas em linfócitos. Como resultado, os camundongos eliminatórios têm um desenvolvimento de linfócitos comprometidos e não têm assassino natural, ou NK, células, células T ou células B.

A transferência adotiva pode ser usada para introduzir as células imunes desaparecidas nesses camundongos comprometidos, colhendo primeiro tecido de rato doador contendo altas concentrações de células imunes, como o baço. O tecido é então dissociado e uma variedade de células de baço, incluindo as células imunes, são isoladas. Em seguida, os eritrócitos indesejados, ou glóbulos vermelhos, podem ser liociados através da adição de tampão de potássio de cloreto de amônio e os glóbulos brancos restantes, ou esplenócitos, são então separados dos detritos celulares usando centrifugação.

Finalmente, os esplenócitos purificados são injetados nos camundongos imunocomprometidos, facilitando estudos detalhados das funções dessas células. Vários dias depois, o sucesso da transferência de células imunes adotivas pode ser confirmado primeiro isolando e preparando os espógenos hospedeiros da mesma forma que o tecido doador. Em seguida, essas células são manchadas usando anticorpos rotulados contra os marcadores de células imunes doadora para que possam ser verificadas e classificadas usando FACS.

Para começar, coloque luvas de laboratório e os equipamentos de proteção adequados. Em seguida, lave um par de fórceps e dissecando uma tesoura primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois seque-os com uma toalha de papel limpa. Prepare 50 mililitros da Solução de Sal Balanceado da Hank, ou HBSS, com soro de bezerro fetal de 2%, ou FCS, combinando um mililitro de FCS com 49 mililitros de HBSS em um tubo de 50 mililitros. Misture suavemente a solução para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes.

Dissecar o mouse eutanizado e remover seu baço como demonstrado no protocolo de vídeo JoVE TECNOLOGIA FACS para separação de linfócitos B esplênicos. Para isolar as células imunes, primeiro coloque o baço em um coador de células de 40 micrômetros em uma placa de petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo no prato. Recupere as células aderidas enxaguando o êmbolo e o coador com 1 mililitro de HBSS 2% FCS. Em seguida, pipeta o baço dissociado e fluido da placa de petri em um tubo centrífuga de 50 mililitros. Lave a placa de petri com 5 mililitros de HBSS 2% FCS e transfira o fluido para o tubo de 15 mililitros.

Centrifugar o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius e, em seguida, recuperar o tubo cuidadosamente para não perturbar a pelota. Agora, remova o sobrenante sem perturbar a pelota e descarte o líquido em um recipiente de resíduos apropriado. Em seguida, adicione dois mililitros de tampão de potássio de cloreto de amônio ao tubo de centrífuga e pipeta para cima e para baixo para resuspengar a pelota e lise os eritrócitos. Aguarde dois minutos e adicione HBSS 2% de FCS à pelota resuspended para obter um valor total de 14 mililitros. Repita a centrifugação. Recupere o tubo cuidadosamente e descarte o supernatante. Em seguida, resuspenda a pelota em 5 mililitros HBSS 2% FCS por pipetting para cima e para baixo. Em seguida, conte as células em suspensão. Adicione cinco microliters de azul trypan a cinco microliters de suspensão celular e misture bem por pipetação. Em seguida, deposite suavemente uma gota de cinco microlitera de suspensão celular diluída entre o vidro de cobertura e o slide Malassez. Com o microscópio definido para ampliação de 40X, conte o número de células. Ajuste a concentração celular para 10 às sete células por mililitro adicionando o volume apropriado de HBSS 2% FCS.

Para iniciar a transferência adotiva, transfira dois mililitros da suspensão celular para um tubo de coleta de cinco mililitros. Centrifugar o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius e, em seguida, descartar o supernasal. Em seguida, resuspende a pelota em dois mililitros de salina tamponada de fosfato e centrifugar o tubo a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius. Descarte o supernatante. Em seguida, resuspenja a pelota em 200 microliters de salina tamponada de fosfato. Usando uma seringa de 0,5 mililitro com uma agulha de calibre 29, injete 200 microliters de suspensão celular no camundongo experimental intravenosamente no seio sanguíneo retro-orbital.

Quatro dias após a transferência adotiva, eutanásia os ratos e remova os baços. Em seguida, colher as células imunes como descrito na seção três. Em seguida, transfira 100 microliters de suspensão celular de cada rato para dois tubos FACS rotulados controle e transferidos. Centrifugar os tubos a 370 vezes g por sete minutos a 10 graus Celsius e depois descartar os supernacantes. Agora, prepare uma mistura contendo os quatro anticorpos na diluição listada na tabela um. Adicione 100 microliters da mistura a cada tubo e, em seguida, incubar por 20 minutos no gelo no escuro. Em seguida, adicione um mililitro de HBSS 2% DE FCS a cada tubo e, em seguida, centrifugar os tubos a 370 vezes g por três minutos a 10 graus Celsius. Descarte os supernantes e, em seguida, ressuspenja as pelotas em 200 microliters de HBSS 2% FCS. Transfira as células resuspended para novos tubos FACS rotulados. Agora, use a citometria de fluxo, como mostrado no protocolo FACS para avaliar a presença de CD45. 2 linfócitos positivos.

Agora, determinaremos a presença de linfócitos CD45.2 que foram isolados do CD45. 1 baço de anfitrião. Para iniciar, clique duas vezes no ícone FlowJo e arraste os arquivos para cada tubo na janela de todas as amostras. Em seguida, clique duas vezes no arquivo transferido para exibir as células registradas a partir dessa amostra em um gráfico de ponto que exibe a dispersão para a frente FSCA no eixo x e dispersar lateralmente SSCA no eixo y. Clique no polígono para circular as populações de linfócitos. Uma nova janela de identificação de subpopulação aparece. Clique em OK. Agora, defina o eixo y para FSC-W e o eixo x para FSC-A. Selecione a população de célula única com a ferramenta polígono como demonstrado anteriormente.

Em seguida, clique duas vezes na população circulada para criar uma nova janela para as células selecionadas. Na nova janela, selecione CD45.2 no Y e CD45.1 no X. Clique no ícone T e personalize o eixo para ampliar o plot. Em seguida, clique no polígono para circular as células positivas CD45.2. Na janela de identificação de subpopulação, nomeie sua população celular transferida células e clique em OK. Na mesma janela, clique em retângulo para selecionar as células negativas cd45.2. Na janela de identificação de subpopulação, nomeie as células de hospedagem da população celular e clique em OK. Em seguida, clique duas vezes na população circulada cd45.2, população transferida, para criar uma nova janela para as células selecionadas. Na nova janela, selecione CD3 no Y e CD4 no X.

Em seguida, clique no polígono para circular as células positivas CD4 CD3. Nesta janela de identificação de subpopulação, nomeie sua população celular transferida células CD4. Em seguida, repita as etapas de análise anteriores com o arquivo do mouse de controle. Finalmente, para visualizar suas populações celulares, clique em Layout Editor. Arraste as células transferidas e a população de células CD4 transferidas de arquivos transferidos e de controle para a guia Layout Editor. Um gráfico de pontos representando células positivas CD45.2 e linfócitos CD4 aparecerá. CD45. 2 células transferidas só devem aparecer no gráfico de pontos do mouse transferido.

Results

Os camundongos ragγc têm uma composição alterada do sistema imunológico, principalmente sem linfócitos. A transferência adotiva de esplenócitos permite a introdução de populações carentes, como células T e B. Nossa coloração incluiu marcadores de superfície celular CD45.1 e CD45.2 para distinguir células hospedeiras edoadoras, respectivamente( Figura 2A). Também incluiu outros marcadores de superfície celular para destacar populações de células ausentes em camundongos Ragγc, como células CD4 T(Figura 2B). Como esperado, o mouse de controle não tinha células CD45.2 positivas(Figura 2B, painéis superiores) e o mouse transferido(Figura 2B, painéis inferiores, 71,2% do total de células). Também podemos detectar especificamente células CD4 T dentro de células transferidas (22,1% das células CD45.2).

Figura 2: Resultados representativos da transferência adotiva. (A) Histogramas de células CD45.2 de camundongos injetados com PBS (grupo controle) (tracejado) e camundongos injetados com esplenócitos CD45.2 (grupo de teste) (linha sólida). (B) Estratégia de gating de células CD45.2 positivas em camundongos de controle injetados com PBS (painéis superiores) e camundongos injetados com esplenócitos CD45.2 (painéis inferiores). As células doadoras e hospedeiras são distinguidas usando marcadores de superfície celular (CD45.1, CD45.2), então a população celular CD45.2 positiva é caracterizada (CD3, CD4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Applications and Summary

Transferência adotiva é uma técnica translacional em diferentes campos da ciência, com aplicações na medicina. Essa técnica pode ser usada para estudar migração celular e tropismo ou incidência de deficiência de proteínas em populações celulares específicas. No último caso, diferentes tecnologias podem ser usadas, especialmente camundongos transgênicos, onde populações de células específicas são intrinsecamente deficientes. No entanto, a construção genética para obter camundongos transgênicos pode ser um processo muito complexo e longo. Neste caso, a transferência adotiva da população celular deficiente é mais fácil e rápida.

As transferências adotivas têm aplicações diretas na medicina. Por exemplo, enxertos de medula óssea em pacientes irradiados durante a terapia do câncer são usados para reconstituir o sistema imunológico. Recentemente, outras aplicações de transferência adotiva têm sido utilizadas na área médica. As células T artificiais (chamadas célula CAR T) são projetadas para reconhecer e eliminar alguns cânceres. Além disso, essas células projetadas são construídas para amortecer o risco de rejeição pelo hospedeiro. A transferência de células CAR T é atualmente testada em ensaios clínicos.

References

Restifo, N. P., Dudley, M. E. and Rosenberg., S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nature reviews. Immunology, 12 (4): 269-281, (2012).
Bonini, C., and Mondino, A. Adoptive T-cell therapy for cancer: The era of engineered T cells. European journal of immunology, 45 (9): 2457-69, (2015).

Transcript

Adoptive cell transfer is a method for introducing cells of interest into an organism. It is a powerful technique to study various biological mechanisms, including the action of specific classes of immune cells. In addition, adoptive transfer is a promising novel treatment for numerous conditions, such as those requiring bone marrow transplants or cancer treatments where a patient’s own T-cells can be extracted, altered to recognize and destroy the cancerous cells, and then returned to the body to fight tumors.

In the laboratory, animal models are often used to study adoptive transfer. For example, CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental receptors for many cytokines, which are essential for normal differentiation of hematopoietic stem cells into lymphocytes. As a result, the knockout mice have a compromised lymphocyte development and do not have natural killer, or NK, cells, T-cells, or B-cells.

Adoptive transfer can be used to introduce the missing immune cells into these compromised mice, by first harvesting donor mouse tissue containing high concentrations of immune cells, such as the spleen. The tissue is then dissociated and a variety of spleen cells, including the immune cells, are isolated. Next, unwanted erythrocytes, or red blood cells, can be lysed via the addition of ammonium chloride potassium lysing buffer and the remaining white blood cells, or splenocytes, are then separated from the cell debris using centrifugation.

Finally, the purified splenocytes are injected into the immunocompromised mice, facilitating detailed studies of these cells’ functions. Several days later, the success of the adoptive immune cell transfer can be confirmed by first isolating and preparing the host splenoncytes in the same manner as the donor tissue. Then, these cells are stained using labeled antibodies against the donor immune cell markers so that they can be verified and sorted using FACS.

To begin, put on laboratory gloves and the appropriate protective equipment. Next, wash a pair of forceps and dissecting scissors first with a detergent and then with 70% ethanol and then dry them with a clean paper towel. Prepare 50 milliliters of Hank’s Balanced Salt Solution, or HBSS, with 2% Fetal Calf Serum, or FCS, by combining one milliliter of FCS with 49 milliliters of HBSS in a 50 milliliter tube. Mix by gently pipetting the solution up and down approximately 10 times.

Dissect the euthanized mouse and remove its spleen as demonstrated in the JoVE video protocol FACS technology for splenic B lymphocytes separation. To isolate immune cells, first place the spleen on a 40 micrometer cell strainer in a petri dish. Crush the spleen with a plunger to dissociate it into the dish. Recover the adhered cells by rinsing the plunger and the strainer with 1 milliliter of HBSS 2% FCS. Then, pipette the dissociated spleen and fluid from the petri dish into a 50 milliliter centrifuge tube. Wash the petri dish with 5 milliliters of HBSS 2% FCS and transfer the fluid to the 15 milliliter tube.

Centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then retrieve the tube carefully so as not to disturb the pellet. Now, remove the supernatant without disturbing the pellet and discard the liquid in an appropriate waste container. Then, add two milliliters of ammonium chloride potassium lysing buffer to the centrifuge tube and pipette up and down to resuspend the pellet and lyse the erythrocytes. Wait for two minutes and then add HBSS 2% FCS to the resuspended pellet to obtain a total value of 14 milliliters. Repeat the centrifugation. Retrieve the tube carefully and discard the supernatant. Then, resuspend the pellet in 5 milliliters HBSS 2% FCS by pipetting up and down. Next, count the cells in suspension. Add five microliters of trypan blue to five microliters of cell suspension and mix well by pipetting. Then, gently deposit a five microliter drop of diluted cell suspension between the cover glass and the Malassez slide. With the microscope set to 40X magnification, count the number of cells. Adjust the cell concentration to 10 to the seven cells per milliliter by adding the appropriate volume of HBSS 2% FCS.

To begin the adoptive transfer, transfer two milliliters of the cell suspension to a five milliliter collection tube. Centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then discard the supernatant. Next, resuspend the pellet in two milliliters of phosphate buffered saline and centrifuge the tube at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatant. Then, resuspend the pellet in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, inject 200 microliters of cell suspension into the experimental mouse intravenously into the retro-orbital blood sinus.

Four days after the adoptive transfer, euthanize the mice and remove the spleens. Then, harvest the immune cells as described in section three. Next, transfer 100 microliters of cell suspension from each mouse into two FACS tubes labeled control and transferred. Centrifuge the tubes at 370 times g for seven minutes at 10 degrees Celsius and then discard the supernatants. Now, prepare a mix containing the four antibodies at the dilution listed in table one. Add 100 microliters of the mix to each tube and then incubate for 20 minutes on ice in the dark. Next, add one milliliter of HBSS 2% FCS to each tube and then centrifuge the tubes at 370 times g for three minutes at 10 degrees Celsius. Discard the supernatants and then resuspend the pellets in 200 microliters of HBSS 2% FCS. Transfer the resuspended cells to new labeled FACS tubes. Now, use flow cytometry as shown in the FACS protocol to evaluate the presence of CD45. 2 positive lymphocytes.

Now, we will determine the presence CD45.2 lymphocytes that were isolated from the CD45. 1 host spleen. To start, double click on the FlowJo icon and drag the files for each tube in the all sample window. Then, double click on the transferred file to display the cells recorded from that sample on a dot plot that displays forward scatter FSCA on the x-axis and side scatter SSCA on the y-axis. Click on polygon to circle the lymphocyte populations. A new subpopulation identification window appears. Click on OK. Now, set the y-axis to FSC-W and the x-axis to FSC-A. Select the single cell population with the polygon tool as previously demonstrated.

Next, double click on the circled population to create a new window for the selected cells. In the new window, select CD45.2 on the Y and CD45.1 on the X. Click on the T icon and customize the axis to enlarge the plot. Next, click on polygon to circle the CD45.2 positive cells. In the subpopulation identification window, name your cell population transferred cells and click OK. In the same window, click on rectangle to select the CD45.2 negative cells. In the subpopulation identification window, name your cell population host cells and click OK. Next, double click on the CD45.2 circled population, transferred population, to create a new window for the selected cells. In the new window, select CD3 on the Y and CD4 on the X.

Next, click on polygon to circle the CD4 CD3 positive cells. In this subpopulation identification window, name your cell population transferred CD4 cells. Then, repeat the previous analysis steps with the control mouse file. Finally, to visualize your cell populations, click on Layout Editor. Drag the transferred cells and the transferred CD4 cells population from transferred and control files into the Layout Editor tab. A dot plot representing CD45.2 positive cells and CD4 lymphocytes will appear. CD45. 2 transferred cells should only appear in the transferred mouse dot plot.

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