Ensaio para Morte Celular: Ensaio de Liberação de Cromo para Avaliar a Capacidade Citotóxica

Visão geral do procedimento

O típico ensaio de liberação de ⁵¹CR para medir a morte celular envolve as seguintes etapas:

1. Primeiro, as células-alvo são rotuladas com Na₂[⁵¹Cr]O₄. Isso as distingue das células efeitos no ensaio.
2. Enquanto as células-alvo estão rotulando, as células effectoras são coletadas e, usando a técnica de diluição serial, uma titulação decrescente das células de efeito é gerada em uma placa de ensaio fundo redondo de 96 bem.
3. No final da rotulagem da célula alvo, as células são primeiro lavadas e, em seguida, um número fixo de células são adicionadas à placa de ensaio que já contém uma série de diluições de células de efeito.
4. Em seguida, a mistura celular com efeito-alvo é incubada por um período de tempo definido para permitir interação celular suficiente com as células-alvo, para mediar a lise celular.
5. Finalmente, os supernacantes da cultura são colhidos e coletados em tubos. A quantidade ^{de 51}Cr é quantitatada usando um contador gama.
6. Ao final, os dados são coletados e utilizados para calcular a "porcentagem específica de lise celular" das células-alvo.

1. Rotulagem de células-alvo com ⁵¹Cr

1. Para começar, prepare as células-alvo,(aqui- linha celular de melanoma humano WM793), em uma única suspensão celular.
2. Para fazer isso, primeiro remova a mídia do frasco de cultura tecidual.
3. Em seguida, lave as células com 5 mL de 1X PBS.
4. Trypsinize as células adicionando 1 mL de trippsina na placa por ~2 min.
5. Bata suavemente o frasco para soltar as células da superfície do frasco.
6. Adicione 5 mL de mídia RPMI ao frasco e enconha a mídia para cima e para baixo para desprender as células.
7. Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a suspensão celular por 5 min a 1200 rpm. Decantar o supernatante.
8. Adicione 10 mL de mídia à pelota e cano suavemente a mídia para cima e para baixo para colocar as células em suspensão.
9. Determine a concentração celular usando um hemócito.
10. Transfira 1x10⁶ células para um novo tubo cônico de 15 mL.
11. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 1200 rpm e decantar o supernante.
12. Brevemente o vórtice do tubo para resuspensar a pelota celular no pequeno volume de médio deixado para trás.
13. Adicione 100 μCi de ⁵¹Cr diretamente à suspensão da célula alvo WM793.
    Nota: Deve haver um espaço de laboratório dedicado para a radioatividade particular. Além disso, deve haver ampla proteção de chumbo para armazenamento seguro e uso do ⁵¹Cr durante todas as etapas, bem como sinalização adequada para indicar onde as amostras com ⁵¹Cr estão sendo mantidas. Um contador Geiger equipado com uma sonda de panqueca também é necessário, para levantamento do espaço para possível contaminação.
14. Adicione um pequeno pedaço de fita radioativa ao tubo para indicar que o tubo agora é radioativo.
15. Coloque o tubo em uma incubadora de 37°C com um escudo de chumbo e incubar por 1h. Flick o tubo a cada 15-20 minutos para aumentar a absorção celular alvo do cromo.
16. Após o período de incubação, lave as células-alvo com 5 mL de FBS para remover qualquer excesso ^{de 51}Cr.
17. Centrifugar as células a 1200 rpm por 5 min. Decanta radioativa FBS lavar em recipiente de resíduos apropriado.
18. Resuspenda a pelota e lave uma segunda vez com fbs. Verifique a pelota para obter radioatividade incorporada usando um contador Geiger.
19. Resuspenda a pelota em 10 mL meio completo, alcançando uma concentração celular de 10⁵ células/mL.
    Nota: A etapa de contagem de células após a rotulagem ^{de 51}Cr é omitida aqui em grande parte pelas razões de segurança. Pode-se supor que a concentração celular WM793 é a mesma anterior à rotulagem de ⁵¹Cr.

2. Preparando células do efeito

1. Uma variedade de células efeitos podem ser usadas, como células T humanas ou de camundongos e células NK. Neste exemplo, foram utilizados PBMCs, isolados do sangue inteiro por centrifugação gradiente de densidade padrão (para uma concentração de 5x10⁶), foram utilizados.
2. Para começar, adicione 100 μL de cultura tecidual a cada poço de uma das linhas (aqui linha A, Ver Tabela 1) de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Aqui, não são adicionadas células de efeitos, e servirão como "em branco" para determinar a "liberação mínima/espontânea de ⁵¹Cr" das células-alvo.

Tabela 1: ⁵¹Layout do ensaio de liberação de CR: Células alvo da linha A (10⁴ células/ 100 μL) incubadas apenas com mídia (gera 'branco' para determinar a "liberação mínima/espontânea ^{de 51}Cr"). Linhas B a C-poços contendo diferentes efeitos: razãos de células-alvo (E:T), variando de 50:1 a 1,5:1. Células-alvo da linha H (10⁴ células/100 μL) incubadas com 1% de NP-40 (NP-40 lyses as células-alvo, gerando "liberação máxima ou total ^{de 51}Cr"). Cada razão de E:T é testada em triplicado para cada condição experimental. Coluna 1-3- PBMCs não estimulados e PBMCs estimulados por CPG.

3. Em seguida, gerar uma diluição de células seriais 2X dos PBMCs (em triplicado para cada condição experimental), para obter uma concentração celular effectora variando de 5x10⁵ a 15.625 células/100 μL de mídia (aqui linhas B a G).
   Nota: Neste exemplo, a razão do efeito inicial: célula alvo (E: T) é de 50:1. No entanto, essa razão pode ser ajustada dependendo das especificidades experimentais.
4. Deixe a última linha vazia (aqui linha H) não adicionando nenhuma célula de efeito a esses poços. (Esta linha será usada para gerar as "contagens totais/min, ou (c. p.m)" ou a "liberação máxima ^{de 51}Cr").
5. Coloque a placa na incubadora de 37°C até que as células-alvo estejam prontas para serem adicionadas.

3. Adicionando ⁵¹cr rotulados WM793 células-alvo ao ensaio

1. Após o período de incubação, remova as células-alvo da incubadora e lave com 5 mL de FBS para remover qualquer excesso ^{de 51}Cr.
2. Centrifugar as células a 1200 rpm por 5 min, usando uma centrífuga designada.
3. Remova a lavagem FBS (supernanato radioativo) em um recipiente de resíduos apropriado.
4. Repita o passo de lavagem resutilização da pelota em um fresco 5 mL de FBS.
5. Centrifugar as células novamente a 1200 rpm por 5 min.
6. Por fim, resuspense a pelota em 10 mL de meio completo.
7. Despeje a suspensão celular WM793 com rótulo ^{de CR (105} células/mL) em um reservatório de reagente descartável.
8. Em seguida, adicione 100 μL dessas células-alvo rotuladas, a cada poço da placa celular de efeito de 96 poços, usando uma pipeta multicanal.
9. Em seguida, adicione 100 μL de 1% NP-40 (na água) à linha de poços que são desprovidos de qualquer célula de efeito (aqui linha H). 1% NP-40 irá lise as células-alvo, e assim esses poços servirão como controles para determinar as "contagens totais/min, ou (c. p.m)" ou a liberação máxima de ⁵¹Cr.
10. Fixar a tampa na placa adicionando um pequeno pedaço de fita permeável a gás em cada lado da placa e coloque um pedaço de fita radioativa na tampa para indicar que contém ⁵¹Cr.
11. Resumidamente, centrifugar a placa a 1200 rpm. Se apenas uma placa experimental estiver sendo usada, adicione uma placa de equilíbrio à centrífuga.
    Nota: É importante usar uma centrífuga marcada para manusear amostras radioativas.
12. Retire a placa da centrífuga.
13. Coloque a placa em uma incubadora de 37°C com um pequeno pedaço de chumbo protegendo sobre a placa para maior segurança. Incubar por 16 horas para permitir a lise celular alvo.
    Nota: O período de incubação pode variar de 4 a 18 h, dependendo das células efetivas utilizadas e do mecanismo potencial de morte empregado.

4. Colhendo os Supernantes

1. No final do período de incubação, remova cuidadosamente a fita ao redor da borda da placa e remova a tampa.
2. Em seguida, coloque o quadro de colheita na placa, certificando-se de confirmar que os pequenos discos de filtro estão no lugar para cada um dos plugues de algodão. Isso garantirá a coleta de um supernatante livre de células.
3. Agora, devagar e gentilmente pressione os plugues de algodão nos poços.
4. Após aproximadamente 10 segundos, solte a pressão sobre os plugues de algodão e, em seguida, transfira os plugues de algodão para as tiras do tubo.
5. Coloque cada um desses tubos em um tubo FACS secundário.
6. Finalmente, carregue os tubos FACS no balcão gama e execute as amostras para quantificar a quantidade de ⁵¹Cr liberada em cada condição. As amostras são tipicamente medidas por 1 minuto, permitindo uma fácil determinação das "contagens/minutos".
7. Com cuidado, regise a ordem em que os tubos foram carregados no balcão.

5. Análise de dados

1. Aqui, pbmcs não estimulados foram adicionados às três primeiras colunas, e PBMCs estimulados pelo CpG (CpG ODN, (1 μg/mL) por 24 h) foram adicionados às colunas 4-6. Veja a Tabela 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
Um	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
Eu	Média de A1,A2,A3 ->		1164.67	C.P.m		1058.33
J	Média de B1,B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	Média de C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	Média de D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	Média de E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	Média de F1, F2, F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	Média de G1,G2,G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	Média de H1,H2,H3 ->		8884.67	C.P.m máximo		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-stim PBMC	Razão E:T

Tabela 2: ⁵¹Dados de ensaio de liberação de cr: Valores de dados 'Contagens por minuto' / 'c. p.m', valores médios de c. p.m e valores de lise por cento.

2. Os dados coletados (contagens por minuto, ou seja.c.p.m) foram inseridos nas células de uma planilha da mesma forma que as amostras foram dispostas na placa original.
3. Primeiro, foram calculadas as médias dos triplicados. Tabela 2 - células I3 a P3, para PBMCs não estimulados e células I6 a P6, para PBMCs estimulados pelo CpG.
4. Uma vez determinadas as médias, o percentual de lise específica para cada condição foi calculado utilizando-se a seguinte fórmula.
   
   
5. A porcentagem de lise específica foi calculada para cada condição (Tabela 2 - células J4 a O4, para PBMCs não estimulados e J7 a O7, para PBMCs não estimulados).