Ensaio para Morte Celular: Ensaio de Liberação de Cromo para Avaliar a Capacidade Citotóxica

Neste vídeo, você observará como realizar o ensaio de liberação de cromo e determinar o potencial citotóxico das células efetoras.

As células imunológicas são responsáveis por identificar e remover células potencialmente nocivas, como câncer ou células infectadas por vírus, do corpo, que é parte integrante da resposta imunológica. Várias células imunes, como células T e células NK, possuem uma propriedade conhecida como potencial citotóxico, que é a capacidade de identificar células-alvo e secretar proteínas que induzem a degradação de proteínas, lise e morte dessas células-alvo. A quantificação do potencial citotóxico é fundamental para medir a ativação e a potência das células imunes, e o ensaio de liberação de cromo é comumente usado para esse fim.

Este método permite que os usuários comparem a citoxicidade induzida por tipos específicos de células imunes sob diferentes condições, o que é valioso para estudar a imunoterapia contra o câncer e doenças relacionadas à imunidade. Para começar, as células-alvo, como as células cancerígenas, são incubadas com um isótopo radioativo, o cromo 51, que é absorvido pelas células. Em seguida, essas células marcadas com rádio são co-cultivadas com as células imunes isoladas de interesse, também chamadas de células efetoras, em uma placa de fundo redondo de 96 poços para facilitar a interação entre os dois tipos de células.

A configuração geral do ensaio envolve a incubação de um número específico de células-alvo com diferentes concentrações de células imunes, juntamente com controles apropriados. A co-cultura permite que as células efetoras induzam apoptose e lise nas células-alvo, resultando na liberação do cromo 51 intracelular no sobrenadante. Em seguida, em um ponto de tempo pré-otimizado, o sobrenadante contendo o cromo liberado é colhido de todos os poços. O cromo 51, sendo radioativo, sofre espontaneamente decaimento radioativo para emitir radiação gama. Os níveis de radiação gama nos sobrenadantes de todos os poços na placa de ensaio representam uma saída quantificável da lise das células-alvo. Isso é medido usando um contador gama, que é então usado para determinar o potencial citotóxico das células imunes.

Para começar, as células-alvo, a linha celular de melanoma humano WM793 neste exemplo, são preparadas em uma única suspensão celular. Para fazer isso, primeiro remova o meio do frasco de cultura de tecidos e lave as células com cinco mililitros de 1X PBS. Transvase o PBS e adicione um mililitro de tripsina à placa por aproximadamente dois minutos. Bata suavemente no frasco para soltar as células da superfície do frasco e, em seguida, adicione cinco mililitros de mídia RPMI ao frasco. Pipetar o meio para cima e para baixo para recolher as células e adicionar esta suspensão a um tubo cónico de 15 mililitros.

Coloque o tubo na centrífuga por cinco minutos a 1200 RPM. Em seguida, remova a mídia do tubo, certificando-se de não interromper o pellet da célula. Agite suavemente o fundo do tubo para interromper o pellet celular e adicione 10 mililitros de mídia ao tubo. Em seguida, pipete suavemente o meio para cima e para baixo para colocar as células em suspensão. Em seguida, determine a concentração celular usando um hemocitômetro e transfira dois mililitros da suspensão celular original para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Coloque o tubo em uma centrífuga e peletize as células a 12 centenas de RPM por cinco minutos. Após a centrifugação, despeje o excesso de mídia do tubo em um recipiente de resíduos. Um breve vórtice do tubo para ressuspender o pellet celular no pequeno volume de meio deixado para trás.

Em seguida, prepare-se para usar o Chromium 51 movendo-se para um espaço de laboratório dedicado a essa radioatividade específica. Deve haver ampla blindagem de chumbo para armazenamento e uso seguro do Chromium 51 durante todas as etapas, bem como sinalização adequada para indicar onde as amostras com Chromium 51 estão sendo mantidas. Um contador Geiger equipado com uma sonda de panqueca também é necessário para servir no espaço para possível contaminação.

Uma vez configurado para o uso adequado da radioatividade, adicione 100 microcuries de cromo 51 diretamente à suspensão da célula-alvo. Em seguida, adicione um pequeno pedaço de fita radioativa ao tubo para indicar que a amostra e o tubo agora estão radioativos. Coloque o tubo em uma incubadora de 37 graus Celsius com uma proteção de chumbo e incube por uma hora, sacudindo o tubo a cada 15 a 20 minutos.

Enquanto as células-alvo estão marcando, prepare uma suspensão de célula única das células efetoras. Neste exemplo, as células mononucleares do sangue periférico humano, ou PDMCs, foram isoladas do sangue total por centrifugação com gradiente de densidade padrão a uma concentração de 5 vezes 10 elevado a 6. Transfira esta suspensão de células efetoras para um reservatório de reagente descartável e, em seguida, adicione 200 microlitros desta suspensão em cada poço da linha B em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microlitros de RPMI a cada poço na linha C a G da placa.

Agora, comece a realizar diluições seriais dos PBMCs para ter uma faixa de números de células efetoras, removendo primeiro 100 microlitros das células nos poços na linha B e adicionando-as à linha C. Em seguida, dilua ainda mais as células efetoras transferindo 100 microlitros de células da linha C para a linha D. Continue a diluição serial. Quando a linha G for alcançada, mova 100 microlitros dos poços para deixar um volume final de 100 microlitros em cada poço dessa linha. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura de tecidos aos poços da linha A para servir como controle para a liberação espontânea de cromo 51 das células-alvo, pois nenhuma célula efetora deve ser adicionada a esta linha. Em seguida, coloque uma placa em uma incubadora de 37 graus Celsius até que as células-alvo estejam prontas para serem adicionadas.

Após o período de incubação, remova as células-alvo da incubadora e lave com 5 mililitros de FBS para remover qualquer excesso de cromo 51. Em seguida, coloque o tubo em uma centrífuga designada e gire a 1200 rpm por 5 minutos. Remova a lavagem radioativa do FBS em um recipiente de lixo apropriado e repita a etapa de lavagem ressuspendendo o pellet em 5 mililitros novos de FBS. Coloque o tubo em uma centrífuga designada e gire as células novamente a 1200 rpm por 5 minutos. Remover a segunda lavagem e verificar se o sedimento está incorporado Finalmente, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio completo e despeje a suspensão de célula-alvo marcada com cromo 51 em um reservatório de reagente descartável. Em seguida, adicione 100 microlitros dessas células-alvo marcadas a cada poço da placa de células efetoras de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microlitros de NP-40 a 1% em água aos poços da linha H para lisar todas as células-alvo em cada linha. Esses poços serão usados como controle para determinar as contagens totais por minuto, ou cpm.

Agora que a placa está preparada, prenda a tampa adicionando um pequeno pedaço de fita adesiva em cada lado da placa e coloque um pedaço de fita radioativa na tampa para indicar que contém cromo 51. Em seguida, coloque a placa em uma centrífuga marcada para lidar com amostras radioativas. Se apenas uma placa experimental estiver sendo usada, adicione uma placa de equilíbrio à centrífuga. Ajuste a centrífuga para 1200 rpm e aumente a velocidade da placa. Uma vez na velocidade, pare a máquina. Remova a placa da centrífuga. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius com um pequeno pedaço de chumbo protegendo a placa para segurança adicional. Incubar por 16 horas para permitir que as células-alvo se lisem.

No final do período de incubação, remova cuidadosamente a fita ao redor da borda da placa e remova a tampa. Em seguida, coloque a estrutura de colheita na placa, certificando-se de confirmar se os pequenos discos de filtro estão no lugar para cada um dos plugues de algodão. Agora, lenta e suavemente, pressione os plugues de algodão nos poços. Após aproximadamente dez segundos, libere a pressão nos plugues de algodão e, em seguida, transfira os plugues de algodão para tiras de tubo. Coloque cada um desses tubos em um tubo FACS secundário. Finalmente, carregue os tubos FACS em um contador gama e execute as amostras para quantificar a quantidade de cromo 51 liberada em cada condição. Registre cuidadosamente a ordem em que os tubos foram carregados no balcão.

Aqui, PBMCs não estimulados foram adicionados às 3 primeiras pistas e PMBCs estimulados por CPG foram adicionados às pistas 4 a 6. Neste exemplo, as contagens por minuto foram inseridas nas células de uma planilha da mesma maneira que as amostras foram dispostas na placa original e as médias dos triplicados foram calculadas. Por exemplo, para a primeira condição, as células A1, A2 e A3 foram calculadas na célula I3. Uma vez que as médias são determinadas, a porcentagem de lise específica para cada condição pode ser calculada usando esta fórmula. Por exemplo, para calcular a porcentagem de lise específica para as células não estimuladas que tinham uma proporção de 50 para 1 células efetoras para as células-alvo, o CPM espontâneo, que neste exemplo, é 1164,67, foi subtraído do CPM experimental, 1129. 67. Esse número pode então ser dividido pela diferença entre o CPM máximo e o CPM espontâneo e, em seguida, multiplicado por 100 para obter a lise específica percentual. Isso é então calculado para cada condição. Esses dados podem então ser representados graficamente para mostrar a comparação da razão E para T com a lise específica percentual para os PBMCs não estimulados e os PBMCs estimulados por CPG. Neste exemplo, as células efetoras estimuladas com CPG mataram as células-alvo de forma mais eficaz à medida que a proporção de células efetoras para células-alvo aumentava. Esse aumento não foi observado nos PBMCs não estimulados, indicando que a estimulação CPG é necessária para o aumento observado na lise das células-alvo.