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Advanced Biology

Ensaio para Morte Celular: Ensaio de Liberação de Cromo para Avaliar a Capacidade Citotóxica

Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

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Immunology

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Assay for Cell Death: Chromium Release Assay of Cytotoxic Ability

5.11: Adoptive Cell Transfer: Introducing Donor Mouse Splenocytes to a Host Mouse and Assessing Success via FACS

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11:48 min

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April 30, 2023

Overview

Fonte: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro de Imunologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Departamento de Urologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro de Câncer Maçônico, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Uma das principais funções das células do sistema imunológico é remover células-alvo que foram infectadas com vírus ou passaram por transformação em células tumorais. Ensaios in vitro para medir a capacidade citotóxica das células imunes têm sido um grampo em laboratórios por muitos anos. Esses ensaios têm sido usados para determinar a capacidade de células T, células NK ou qualquer outra célula imune para matar células-alvo de forma específica de antígeno ou -inespecífica. Ligantes de morte (por exemplo, ligante fas ou TRAIL), citocinas (por exemplo, IFNg ou TNF), ou grânulos citotóxicos (ou seja, perforina/granzyme B) expressos por células effectoras são algumas maneiras pelas quais a morte celular alvo pode ser induzida. Com a explosão na pesquisa de imunoterapia tumoral nos últimos anos, há um crescente interesse em encontrar agentes para aumentar a atividade citotóxica das células imunes para melhorar os resultados dos pacientes. Por outro lado, algumas doenças são marcadas pela atividade excessivamente exuberante da atividade citotóxica das células imunes, resultando em esforços para identificar agentes para temperar essas respostas. Assim, ter um ensaio no qual o usuário pode facilmente integrar qualquer número de células efeitos, células-alvo e/ou modificadores de resposta no design experimental pode servir como um meio valioso de avaliar rapidamente a capacidade citotóxica das células effectoras e/ou a capacidade de resposta da célula alvo.

Esses ensaios in vitro envolvem a mistura de diferentes populações celulares, bem como o uso de um número relativamente baixo de células-alvo e efeitos. Assim, uma necessidade do ensaio é rotular as células-alvo de uma maneira que possa ser facilmente detectada e quantitada, permitindo ao usuário determinar então a “por cento de lise específica” mediada pelas células effectoras. A radioatividade – especialmente, o cromo 51 (⁵¹Cr) na forma de Na₂⁵¹CrO₄– é uma maneira barata de rotular rapidamente e sem especificação proteínas celulares dentro das células-alvo (1). Os tempos de rotulagem curta e ensaio total reduzem o potencial de mudanças significativas no número e/ou fenótipo das células-alvo, o que poderia influenciar o resultado do ensaio. Após a perda da integridade da membrana das células-alvo como resultado da atividade citotóxica das células effectoras, as proteínas celulares rotuladas por Cr ^{de 51}Cr dentro das células-alvo são liberadas na cultura sobrenante, tornando-se disponíveis para quantitação. Como em qualquer ensaio que examine a função das células imunes in vitro,há uma série de considerações importantes para considerar melhorar o desempenho do experimento. Uma das características mais críticas é usar células de efeito saudável (para atividade citotóxica máxima) e alvo (para resposta máxima e morte espontânea mínima/ liberação de⁵¹Cr). É necessário contato com o efeito e a célula alvo (levando ao uso comum de placas de fundo redondo de 96 poços para incentivar o contato celular) (2). Por fim, a análise dos dados depende da inclusão de populações celulares alvo de controle positivo e negativo.

O protocolo a seguir delineará as etapas para a realização de um ensaio de liberação padrão ^{de 51}Cr para medir a capacidade citotóxica de uma população de células efeitos, embora uma versão nãoradioativa usando europium tenha sido recentemente desenvolvida. ⁵¹ Cr é um poderoso emissor de radiação γ. Consequentemente, o uso deste ensaio requer treinamento adequado de segurança de radiação, espaço de laboratório dedicado, um contador gama e descarte de amostras radioativas.

A sequência geral de eventos neste ensaio são: 1) preparar ⁵¹alvos rotulados por Cr; 2) preparar células de efeitos e adicionar à placa enquanto as células-alvo estiverem rotulando; 3) adicionar alvos rotulados à placa; 4) placa incubadora; 5) supernastas de colheita; e 6) analisar dados após a execução de amostras no balcão. As amostras são comumente preparadas em triplicado, e então mediadas para explicar quaisquer diferenças sutis de pipetação.

O EPI adequado é importante para este ensaio. Especificamente, o usuário deve usar um jaleco e luvas. Os óculos de segurança podem ser necessários com base no laboratório ou instituição. Deve haver ampla proteção de chumbo para armazenamento seguro e uso do ⁵¹Cr durante todas as etapas. Por fim, deve haver espaço de laboratório dedicado e equipamentos reservados para o uso de ⁵¹Cr, incluindo toda a sinalização adequada para indicar onde as amostras com ⁵¹Cr estão sendo mantidas e um contador Geiger equipado com sonda gama para examinar o espaço para possível contaminação.

Neste exercício de laboratório, determinaremos a capacidade das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs), (CpG estimuladas vs. não estimuladas) para matar células de melanoma, usando a linha celular de melanoma humano WM793 como modelo e o ensaio de liberação de cromo.

Procedure

Visão geral do procedimento

O típico ensaio de liberação de ⁵¹CR para medir a morte celular envolve as seguintes etapas:

Primeiro, as células-alvo são rotuladas com Na₂[⁵¹Cr]O₄. Isso as distingue das células efeitos no ensaio.
Enquanto as células-alvo estão rotulando, as células effectoras são coletadas e, usando a técnica de diluição serial, uma titulação decrescente das células de efeito é gerada em uma placa de ensaio fundo redondo de 96 bem.
No final da rotulagem da célula alvo, as células são primeiro lavadas e, em seguida, um número fixo de células são adicionadas à placa de ensaio que já contém uma série de diluições de células de efeito.
Em seguida, a mistura celular com efeito-alvo é incubada por um período de tempo definido para permitir interação celular suficiente com as células-alvo, para mediar a lise celular.
Finalmente, os supernacantes da cultura são colhidos e coletados em tubos. A quantidade ^{de 51}Cr é quantitatada usando um contador gama.
Ao final, os dados são coletados e utilizados para calcular a “porcentagem específica de lise celular” das células-alvo.

1. Rotulagem de células-alvo com ⁵¹Cr

Para começar, prepare as células-alvo,(aqui- linha celular de melanoma humano WM793), em uma única suspensão celular.
Para fazer isso, primeiro remova a mídia do frasco de cultura tecidual.
Em seguida, lave as células com 5 mL de 1X PBS.
Trypsinize as células adicionando 1 mL de trippsina na placa por ~2 min.
Bata suavemente o frasco para soltar as células da superfície do frasco.
Adicione 5 mL de mídia RPMI ao frasco e enconha a mídia para cima e para baixo para desprender as células.
Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a suspensão celular por 5 min a 1200 rpm. Decantar o supernatante.
Adicione 10 mL de mídia à pelota e cano suavemente a mídia para cima e para baixo para colocar as células em suspensão.
Determine a concentração celular usando um hemócito.
Transfira 1×10⁶ células para um novo tubo cônico de 15 mL.
Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 1200 rpm e decantar o supernante.
Brevemente o vórtice do tubo para resuspensar a pelota celular no pequeno volume de médio deixado para trás.
Adicione 100 μCi de ⁵¹Cr diretamente à suspensão da célula alvo WM793.
Nota: Deve haver um espaço de laboratório dedicado para a radioatividade particular. Além disso, deve haver ampla proteção de chumbo para armazenamento seguro e uso do ⁵¹Cr durante todas as etapas, bem como sinalização adequada para indicar onde as amostras com ⁵¹Cr estão sendo mantidas. Um contador Geiger equipado com uma sonda de panqueca também é necessário, para levantamento do espaço para possível contaminação.
Adicione um pequeno pedaço de fita radioativa ao tubo para indicar que o tubo agora é radioativo.
Coloque o tubo em uma incubadora de 37°C com um escudo de chumbo e incubar por 1h. Flick o tubo a cada 15-20 minutos para aumentar a absorção celular alvo do cromo.
Após o período de incubação, lave as células-alvo com 5 mL de FBS para remover qualquer excesso ^{de 51}Cr.
Centrifugar as células a 1200 rpm por 5 min. Decanta radioativa FBS lavar em recipiente de resíduos apropriado.
Resuspenda a pelota e lave uma segunda vez com fbs. Verifique a pelota para obter radioatividade incorporada usando um contador Geiger.
Resuspenda a pelota em 10 mL meio completo, alcançando uma concentração celular de 10⁵ células/mL.
Nota: A etapa de contagem de células após a rotulagem ^{de 51}Cr é omitida aqui em grande parte pelas razões de segurança. Pode-se supor que a concentração celular WM793 é a mesma anterior à rotulagem de ⁵¹Cr.

2. Preparando células do efeito

Uma variedade de células efeitos podem ser usadas, como células T humanas ou de camundongos e células NK. Neste exemplo, foram utilizados PBMCs, isolados do sangue inteiro por centrifugação gradiente de densidade padrão (para uma concentração de 5×10⁶), foram utilizados.
Para começar, adicione 100 μL de cultura tecidual a cada poço de uma das linhas (aqui linha A, Ver Tabela 1) de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Aqui, não são adicionadas células de efeitos, e servirão como “em branco” para determinar a “liberação mínima/espontânea de ⁵¹Cr” das células-alvo.

Tabela 1: ⁵¹Layout do ensaio de liberação de CR: Células alvo da linha A (10⁴ células/ 100 μL) incubadas apenas com mídia (gera ‘branco’ para determinar a “liberação mínima/espontânea ^{de 51}Cr”). Linhas B a C-poços contendo diferentes efeitos: razãos de células-alvo (E:T), variando de 50:1 a 1,5:1. Células-alvo da linha H (10⁴ células/100 μL) incubadas com 1% de NP-40 (NP-40 lyses as células-alvo, gerando “liberação máxima ou total ^{de 51}Cr”). Cada razão de E:T é testada em triplicado para cada condição experimental. Coluna 1-3- PBMCs não estimulados e PBMCs estimulados por CPG.

Em seguida, gerar uma diluição de células seriais 2X dos PBMCs (em triplicado para cada condição experimental), para obter uma concentração celular effectora variando de 5×10⁵ a 15.625 células/100 μL de mídia (aqui linhas B a G).
Nota: Neste exemplo, a razão do efeito inicial: célula alvo (E: T) é de 50:1. No entanto, essa razão pode ser ajustada dependendo das especificidades experimentais.
Deixe a última linha vazia (aqui linha H) não adicionando nenhuma célula de efeito a esses poços. (Esta linha será usada para gerar as “contagens totais/min, ou (c. p.m)” ou a “liberação máxima ^{de 51}Cr”).
Coloque a placa na incubadora de 37°C até que as células-alvo estejam prontas para serem adicionadas.

3. Adicionando ⁵¹cr rotulados WM793 células-alvo ao ensaio

Após o período de incubação, remova as células-alvo da incubadora e lave com 5 mL de FBS para remover qualquer excesso ^{de 51}Cr.
Centrifugar as células a 1200 rpm por 5 min, usando uma centrífuga designada.
Remova a lavagem FBS (supernanato radioativo) em um recipiente de resíduos apropriado.
Repita o passo de lavagem resutilização da pelota em um fresco 5 mL de FBS.
Centrifugar as células novamente a 1200 rpm por 5 min.
Por fim, resuspense a pelota em 10 mL de meio completo.
Despeje a suspensão celular WM793 com rótulo ^{de CR (10}⁵ células/mL) em um reservatório de reagente descartável.
Em seguida, adicione 100 μL dessas células-alvo rotuladas, a cada poço da placa celular de efeito de 96 poços, usando uma pipeta multicanal.
Em seguida, adicione 100 μL de 1% NP-40 (na água) à linha de poços que são desprovidos de qualquer célula de efeito (aqui linha H). 1% NP-40 irá lise as células-alvo, e assim esses poços servirão como controles para determinar as “contagens totais/min, ou (c. p.m)” ou a liberação máxima de ⁵¹Cr.
Fixar a tampa na placa adicionando um pequeno pedaço de fita permeável a gás em cada lado da placa e coloque um pedaço de fita radioativa na tampa para indicar que contém ⁵¹Cr.
Resumidamente, centrifugar a placa a 1200 rpm. Se apenas uma placa experimental estiver sendo usada, adicione uma placa de equilíbrio à centrífuga.
Nota: É importante usar uma centrífuga marcada para manusear amostras radioativas.
Retire a placa da centrífuga.
Coloque a placa em uma incubadora de 37°C com um pequeno pedaço de chumbo protegendo sobre a placa para maior segurança. Incubar por 16 horas para permitir a lise celular alvo.
Nota: O período de incubação pode variar de 4 a 18 h, dependendo das células efetivas utilizadas e do mecanismo potencial de morte empregado.

4. Colhendo os Supernantes

No final do período de incubação, remova cuidadosamente a fita ao redor da borda da placa e remova a tampa.
Em seguida, coloque o quadro de colheita na placa, certificando-se de confirmar que os pequenos discos de filtro estão no lugar para cada um dos plugues de algodão. Isso garantirá a coleta de um supernatante livre de células.
Agora, devagar e gentilmente pressione os plugues de algodão nos poços.
Após aproximadamente 10 segundos, solte a pressão sobre os plugues de algodão e, em seguida, transfira os plugues de algodão para as tiras do tubo.
Coloque cada um desses tubos em um tubo FACS secundário.
Finalmente, carregue os tubos FACS no balcão gama e execute as amostras para quantificar a quantidade de ⁵¹Cr liberada em cada condição. As amostras são tipicamente medidas por 1 minuto, permitindo uma fácil determinação das “contagens/minutos”.
Com cuidado, regise a ordem em que os tubos foram carregados no balcão.

5. Análise de dados

Aqui, pbmcs não estimulados foram adicionados às três primeiras colunas, e PBMCs estimulados pelo CpG (CpG ODN, (1 μg/mL) por 24 h) foram adicionados às colunas 4-6. Veja a Tabela 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
Um	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
Eu	Média de A1,A2,A3 ->		1164.67	C.P.m		1058.33
J	Média de B1,B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	Média de C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	Média de D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	Média de E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	Média de F1, F2, F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	Média de G1,G2,G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	Média de H1,H2,H3 ->		8884.67	C.P.m máximo		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-stim PBMC	Razão E:T

Tabela 2: ⁵¹Dados de ensaio de liberação de cr: Valores de dados ‘Contagens por minuto’ / ‘c. p.m’, valores médios de c. p.m e valores de lise por cento.

Os dados coletados (contagens por minuto, ou seja.c.p.m) foram inseridos nas células de uma planilha da mesma forma que as amostras foram dispostas na placa original.
Primeiro, foram calculadas as médias dos triplicados. Tabela 2 – células I3 a P3, para PBMCs não estimulados e células I6 a P6, para PBMCs estimulados pelo CpG.
Uma vez determinadas as médias, o percentual de lise específica para cada condição foi calculado utilizando-se a seguinte fórmula.
A porcentagem de lise específica foi calculada para cada condição (Tabela 2 – células J4 a O4, para PBMCs não estimulados e J7 a O7, para PBMCs não estimulados).

Neste vídeo você observará como realizar o ensaio de liberação de cromo e determinará o potencial citotóxico das células de efeito.

As células imunes são responsáveis por identificar e remover células potencialmente prejudiciais, como câncer ou células infectadas por vírus, do corpo, que é parte integrante da resposta imune. Várias células imunes, como células T e células NK, possuem uma propriedade conhecida como potencial citotóxico, que é a capacidade de identificar células-alvo e segregar proteínas que induzem a degradação da proteína, a lise e a morte dessas células-alvo. Quantificar o potencial citotóxico é fundamental para medir a ativação e potência das células imunes, e o ensaio de liberação de cromo é comumente usado para este fim.

Este método permite que os usuários comparem a citoxicidade induzida por tipos específicos de células imunes em diferentes condições, o que é valioso para estudar doenças relacionadas ao câncer e imunidade. Para começar, as células-alvo, como as células cancerosas, são incubadas com um isótopo radioativo, o cromo 51, que é tomado pelas células. Em seguida, essas células rotuladas por rádio são co-cultivadas com as células imunes isoladas de interesse, também chamadas de células efeitos, em um fundo redondo, placa de 96- bem para facilitar a interação entre os dois tipos de células.

A configuração geral do ensaio envolve a incubação de um número específico de células-alvo com diferentes concentrações das células imunes, juntamente com controles apropriados. A cocultura permite que as células efeitosoras induem apoptose e lise nas células-alvo, resultando na liberação do cromo intracelular 51 no sobrenante. Em seguida, em um ponto de tempo pré-otimizado, o supernatante contendo o cromo liberado é colhido de todos os poços. O cromo 51, sendo radioativo, passa espontaneamente por decadência radioativa para emitir radiação gama. Os níveis de radiação gama nos supernantes de todos os poços da placa de ensaio representam uma saída quantificável da lise das células-alvo. Isso é medido usando um contador gama, que é então usado para determinar o potencial citotóxico das células imunes.

Para começar, as células-alvo, a linha celular de melanoma humano WM793 neste exemplo, são preparadas em uma única suspensão celular. Para isso, primeiro remova a mídia do frasco de cultura tecidual e lave as células com cinco mililitros de 1X PBS. Decante o PBS e, em seguida, adicione um mililitro de trippsina à placa por aproximadamente dois minutos. Bata suavemente no frasco para soltar as células da superfície do frasco e, em seguida, adicione cinco mililitros de mídia RPMI ao frasco. Pipeta a mídia para cima e para baixo para coletar as células e adicionar esta suspensão a um tubo cônico de 15 mililitros.

Coloque o tubo na centrífuga por cinco minutos a 1200 RPM. Em seguida, remova a mídia do tubo certificando-se de não interromper a pelota celular. Gire suavemente a parte inferior do tubo para interromper a pelota celular e adicione 10 mililitros de mídia ao tubo. Em seguida, pipeta suavemente a mídia para cima e para baixo para trazer as células em suspensão. Em seguida, determine a concentração celular usando um hemócito e transfira dois mililitros da suspensão celular original para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Coloque o tubo em uma centrífuga e pelota as células a 1200 RPM por cinco minutos. Após a centrifugação, despeje o excesso de mídia do tubo em um recipiente de resíduos. Brevemente o vórtice do tubo para resuspensar a pelota celular no pequeno volume de médio deixado para trás.

Em seguida, prepare-se para usar o Chromium 51 movendo-se para um espaço de laboratório dedicado a esta radioatividade particular. Deve haver ampla proteção de chumbo para armazenamento seguro e uso do Chromium 51 durante todas as etapas, bem como sinalização adequada para indicar onde as amostras com Chromium 51 estão sendo mantidas. Um contador Geiger equipado com uma sonda de panqueca também é necessário para servir no espaço para uma possível contaminação.

Uma vez configurado para o uso adequado da radioatividade, adicione 100 microcuries de Chromium 51 diretamente à suspensão da célula alvo. Em seguida, adicione um pequeno pedaço de fita radioativa ao tubo para indicar que a amostra e o tubo são agora radioativos. Coloque o tubo em uma incubadora de 37 graus celsius com um escudo de chumbo e incubar por uma hora, piscando o tubo a cada 15 a 20 minutos.

Enquanto as células alvo estão rotulando, prepare uma única suspensão celular de células de efeito. Neste exemplo, as células mononucleares de sangue periféricos humanos, ou PDMCs, foram isoladas do sangue inteiro por centrifugação gradiente de densidade padrão para uma concentração de 5 vezes 10 a 6. Transfira esta suspensão celular efeitoora para um reservatório de reagente descartável e, em seguida, adicione 200 microlitros desta suspensão em cada poço da linha B em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microliters de RPMI a cada poço na linha C através de G da placa.

Agora, comece a realizar diluições seriais dos PBMCs para ter uma gama de números de células de efeito, removendo primeiro 100 microlitros das células nos poços da linha B e adicionando isso à linha C. Em seguida, diluir ainda mais as células de efeito, transferindo 100 microlitros de células da linha C para a linha D. Continue a diluição seriada. Uma vez que a linha G é alcançada, mova 100 microliters dos poços para deixar um volume final de 100 microliters em cada poço nessa linha. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de cultura tecidual aos poços da linha A para servir como controle para a liberação espontânea do Cromo 51 das células-alvo, já que nenhuma célula de efeito deve ser adicionada a esta linha. Em seguida, coloque uma placa em uma incubadora de 37 graus celsius até que as células-alvo estejam prontas para serem adicionadas.

Após o período de incubação, remova as células-alvo da incubadora e lave com 5 mililitros de FBS para remover qualquer excesso de Cromo 51. Em seguida, coloque o tubo em uma centrífuga designada e gire a 1200 rpm por 5 minutos. Remova a lavagem radioativa FBS em um recipiente de resíduos apropriado e repita o passo de lavagem, reutilizando a pelota em um fresco 5 mililitros de FBS. Coloque o tubo em uma centrífuga designada e gire as células novamente a 1200 rpm por 5 minutos. Remova a segunda lavagem e verifique se há radioatividade incorporada usando um contador Geiger. Finalmente, resuspense a pelota em 10 mililitros de meio completo e despeje o Chromium 51 rotulado, suspensão de célula alvo em um reservatório de reagente descartável. Em seguida, adicione 100 microlitros dessas células-alvo rotuladas a cada poço da placa celular de efeito de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microliters de 1% NP-40 em água aos poços da linha H para lise todas as células-alvo de cada linha. Esses poços serão usados como controle para determinar a contagem total por minuto, ou cpm.

Agora que a placa está preparada, fixe a tampa adicionando um pequeno pedaço de fita em cada lado da placa e coloque um pedaço de fita radioativa na tampa para indicar que contém cromo 51. Em seguida, coloque a placa em uma centrífuga marcada para manusear amostras radioativas. Se apenas uma placa experimental estiver sendo usada, adicione uma placa de equilíbrio à centrífuga. Coloque a centrífuga a 1200 rpm e coloque a placa em dia. Uma vez na velocidade, pare a máquina. Retire a placa da centrífuga. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus celsius com um pequeno pedaço de proteção de chumbo sobre a placa para maior segurança. Incubar por 16 horas para permitir que as células-alvo lisem.

No final do período de incubação, remova cuidadosamente a fita ao redor da borda da placa e remova a tampa. Em seguida, coloque a estrutura de colheita na placa certificando-se de confirmar que os pequenos discos de filtro estão no lugar para cada um dos plugues de algodão. Agora, devagar e gentilmente pressione os plugues de algodão nos poços. Após aproximadamente dez segundos, solte a pressão sobre os plugues de algodão e, em seguida, transfira os plugues de algodão para as tiras do tubo. Coloque cada um desses tubos em um tubo FACS secundário. Finalmente, carregue os tubos FACS em um balcão gama e execute as amostras para quantificar a quantidade de cromo 51 liberada em cada condição. Regissão cuidadosamente a ordem em que os tubos foram carregados no balcão.

Aqui, os PBMCs não estimulados foram adicionados às primeiras 3 pistas e os PMBCs estimulados pelo CPG foram adicionados às faixas 4 a 6. Neste exemplo, as contagens por minuto foram inseridas nas células de uma planilha da mesma forma que as amostras foram dispostas na placa original e as médias dos triplicados foram calculadas. Por exemplo, para a primeira condição, as células A1, A2 e A3 foram mediadas na célula I3. Uma vez determinadas as médias, o percentual de lise específica para cada condição pode ser calculado usando esta fórmula. Por exemplo, para calcular a porcentagem de lise específica para as células não estimuladas que tinham uma razão de 50 a 1 células effectoras para células-alvo o CPM espontâneo, que neste exemplo, é de 1164,67, foi subtraído do CPM experimental, 1129. 67. Esse número pode então ser dividido pela diferença entre o CPM máximo e o CPM espontâneo, e depois multiplicado por 100 para dar a por cento de lise específica. Isso é então calculado para cada condição. Esses dados podem então ser gráficos para mostrar comparação da razão E para T com a lise por cento específica tanto para os PBMCs não estimulados, quanto para os PBMCs estimulados pelo CPG. Neste exemplo, células efeitosas estimuladas com CPG mataram mais efetivamente células-alvo à medida que a proporção de células efeitosoras para células-alvo aumentava. Esse aumento não foi observado nos PBMCs não estimulados, indicando que a estimulação do CPG é necessária para o aumento observado da lise celular alvo.

Results

Neste exemplo, células efeitosas estimuladas com CpG (Figura 1, círculos negros) mataram as células-alvo de forma mais eficaz, à medida que a proporção de células efeitos ou células-alvo aumentava. Esse aumento não foi observado nos PBMCs não estimulados (círculos brancos),indicando que a estimulação do CPG é necessária para o aumento observado da lise celular-alvo.

Figura 1: ⁵¹Plano de dispersão de ensaios de cr: Atividade tumoricida por PBMCs humanos, não estimulada(círculos brancos) e após estimulação com CpG(círculos negros),testada em diferentes efeitos: razões celulares alvo (E: T) (variando de 50:1 a 1,5:1).

Applications and Summary

O ensaio descrito aqui tem uma flexibilidade considerável, pois uma variedade de células-alvo e efeitos podem ser usadas dependendo da pergunta que está sendo feita. Por exemplo, a especificidade celular efeito ou celular pode ser determinada usando diferentes células-alvo ou o mecanismo de matança celular efeitoor pode ser determinado usando células deficientes em proteínas específicas ou usando inibidores específicos de proteínas. Um grande problema com o ensaio de liberação de ⁵¹Cr é o potencial para altas taxas de liberação espontânea pelas células-alvo. Quando cultivada sozinha (sem células efetivas), a liberação espontânea de ⁵¹Cr pelas células-alvo deve, idealmente, não mais do que 30% do total (“máximo”) liberado pelas células-alvo imediatamente lise. Taxas mais altas de liberação espontânea podem ser devido ao uso de células-alvo insalubres, seja devido à saúde ruim (por exemplo, cultura estendida de uma linha celular) ou a um período de rotulagem excessivamente longo.

References

Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on ⁵¹Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).

Transcript

In this video you will observe how to perform the chromium release assay and determine the cytotoxic potential of the effector cells.

Immune cells are responsible for identifying and removing potentially harmful cells, like cancer or virus-infected cells, from the body, which is an integral part of the immune response. Several immune cells, like T-cells and NK cells, possess a property known as cytotoxic potential, which is the ability to identify target cells and secrete proteins that induce protein degradation, lysis, and death of those target cells. Quantifying cytotoxic potential is critical for measuring immune cell activation and potency, and the chromium release assay is commonly used for this purpose.

This method enables users to compare cytoxicity induced by specific types of immune cells under different conditions, which is valuable for studying cancer immunotherapy and immunity related diseases. To begin, the target cells, like cancer cells, are incubated with a radioactive isotope, chromium 51, which is taken up by the cells. Next, these radio labeled cells are co-cultured with the isolated immune cells of interest, also called the effector cells, in a round bottom, 96- well plate to facilitate interaction between the two cell types.

The overall setup of the assay involves incubating a specific number of target cells with different concentrations of the immune cells, along with appropriate controls. The co-culture allows the effector cells to induce apoptosis and lysis in the target cells, resulting in the release of the intracellular chromium 51 into the supernatant. Then, at a preoptimized time point, the supernatant containing the released chromium is harvested from all the wells. The chromium 51, being radioactive, spontaneously undergoes radioactive decay to emit gamma radiation. The gamma radiation levels in the supernatants from all the wells in the assay plate represent a quantifiable output of the lysis of the target cells. This is measured using a gamma counter, which is then used to determine the cytotoxic potential of the immune cells.

To begin, the target cells, human melanoma cell line WM793 in this example, are prepared into a single cell suspension. To do this, first remove the media from the tissue culture flask and wash the cells with five milliliters of 1X PBS. Decant the PBS and then add one milliliter of trypsin to the plate for approximately two minutes. Gently tap the flask to loosen the cells from the flask surface and then add five milliliters of RPMI media to the flask. Pipette the media up and down to collect the cells and add this suspension to a 15 milliliter conical tube.

Place the tube in the centrifuge for five minutes at 1200 RPM. Next, remove the media from the tube making sure not to disrupt the cell pellet. Gently flick the bottom of the tube to disrupt the cell pellet and add 10 milliliters of media to the tube. Then, gently pipette the media up and down to bring the cells into suspension. Next, determine the cell concentration using a hemocytometer and transfer two milliliters of the original cell suspension to a new 15 milliliter conical tube. Place the tube into a centrifuge and pellet the cells at 12 hundred RPM for five minutes. After centrifugation, pour the excess media out of the tube into a waste container. Briefly vortex the tube to resuspend the cell pellet in the small volume of medium left behind.

Next, prepare to use Chromium 51 by moving to a lab space dedicated for this particular radioactivity. There should be ample lead shielding for safe storage and use of the Chromium 51 during all steps, as well as proper signage to indicate where samples with Chromium 51 are being kept. A Geiger counter equipped with a pancake probe is also necessary to serve in the space for possible contamination.

Once set up for the proper use of radioactivity, add 100 microcuries of Chromium 51 directly to the target cell suspension. Then, add a small piece of radioactive tape to the tube to indicate that the sample and tube are now radioactive. Place the tube in a 37 degree celsius incubator with a lead shield and incubate for an hour, flicking the tube every 15 to 20 minutes.

While the target cells are labeling, prepare a single cell suspension of effector cells. In this example, human peripheral blood mono nuclear cells, or PDMCs, were isolated from whole blood by standard density gradient centrifugation to a concentration of 5 times 10 to the 6th. Transfer this effector cell suspension into a disposable reagent reservoir and then add 200 microliters of this suspension into each well of row B in a 96-well round-bottom plate. Next, add 100 microliters of RPMI to each well in row C through G of the plate.

Now, begin performing serial dilutions of the PBMCs to have a range of effector cell numbers by first removing 100 microliters of the cells in the wells in row B and adding this to row C. Then, further dilute the effector cells by transferring 100 microliters of cells from row C to row D. Continue the serial dilution. Once row G is reached, move 100 microliters from the wells to leave a final volume of 100 microliters in each well in that row. Next, add 100 microliters of tissue culture medium to the wells in row A to serve as a control for the spontaneous release of Chromium 51 from the target cells, as no effector cells should be added to this row. Then, place a plate into a 37 degree celsius incubator until the target cells are ready to be added.

After the incubation period, remove the target cells from the incubator and wash with 5 milliliters of FBS to remove any excess Chromium 51. Then, place the tube in a designated centrifuge and spin at 1200 rpm for 5 minutes. Remove the radioactive FBS wash into an appropriate waste container and repeat the wash step by resuspending the pellet in a fresh 5 milliliters of FBS. Place the tube in a designated centrifuge and spin the cells again at 1200 rpm for 5 minutes. Remove the second wash and check the pellet for incorporated radioactivity using a Geiger counter. Finally, Resuspend the pellet in 10 milliliters of complete medium and pour the Chromium 51 labeled, target cell suspension into a disposable reagent reservoir. Then, add 100 microliters of these labeled target cells to every well of the 96-well effector cell plate. Next, add 100 microliters of 1% NP-40 in water to the wells in row H to lyse all the target cells this each row. These wells will be used as a control to determine the total counts per minute, or cpm.

Now that the plate is prepared, secure the lid by adding a small piece of tape to the each side of the plate and place a piece of radioactive tape on the lid to indicate it contains chromium 51. Then, place the plate in a centrifuge marked to handle radioactive samples. If only one experimental plate is being used, add a balance plate to the centrifuge. Set the centrifuge to 1200 rpm, and bring the plate up to speed. Once at the speed, stop the machine. Remove the plate from the centrifuge. Then, place the plate in a 37 degree celsius incubator with a small piece of lead shielding over the plate for additional safety. Incubate for 16 hours to allow the target cells to lyse.

At the end of the incubation period, carefully remove the tape around the edge of the plate, and remove the lid. Next, place the harvesting frame on the plate making sure to confirm the small filter discs are in place for each of the cotton plugs. Now, slowly and gently press the cotton plugs into the wells. After approximately ten seconds, release the pressure on the cotton plugs, and then transfer the cotton plugs to tube strips. Place each of these tubes into a secondary FACS tube. Finally, load the FACS tubes onto a gamma counter and run the samples to quantitate the amount of chromium 51 released in each condition. Carefully record the order in which the tubes were loaded into the counter.

Here, unstimulated PBMCs were added to the first 3 lanes and CPG stimulated PMBCs were added to lanes 4 through 6. In this example, the counts per minute were entered into the cells of a spreadsheet in the same manner as the samples were laid out in the original plate and the averages of the triplicates were calculated. For example, for the first condition, cells A1, A2, and A3 were averaged in cell I3. Once the averages are determined, the percent of specific lysis for each condition can be calculated using this formula. For example, to calculate the percent specific lysis for the unstimulated cells that had a ratio of 50 to 1 effector cells to target cells the spontaneous CPM, which in this example, is 1164.67, was subtracted from the experimental CPM, 1129. 67. This number can then be divided by the difference between the maximum CPM and the spontaneous CPM, and then multiplied by 100 to give the percent specific lysis. This is then calculated for each condition. These data can then be graphed to show comparison of the E to T ratio with the percent specific lysis for both the unstimulated PBMCs, and the CPG stimulated PBMCs. In this example, effector cells stimulated with CPG more effectively killed target cells as the ratio of effector cells to target cells increased. This increase was not observed in the unstimulated PBMCs, indicating that CPG stimulation is necessary for the observed increase in target cell lysis.

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