Microscopia e Coloração: Coloração de Gram, Cápsula e Endósporo

As bactérias são organismos vivos microscópicos que possuem muitas características distintivas, como forma, disposição das células, se produzem ou não cápsulas e se formam esporos. Todas essas características podem ser visualizadas por coloração e auxiliam na identificação e classificação de diferentes espécies bacterianas.

Para examinar as duas primeiras características da forma e arranjo celular, podemos usar uma técnica simples chamada coloração de Gram. Aqui, o cristal violeta é aplicado a bactérias, que foram fixadas por calor em uma lâmina. Em seguida, a solução de iodo de Gram é adicionada à lâmina, resultando na formação de um complexo insolúvel entre o cristal violeta e a solução de iodo de Gram. Um descolorante é então aplicado e qualquer bactéria com uma camada espessa de peptidoglicano ficará roxa, pois essa camada não é facilmente penetrada pelo descolorante. Essas bactérias são chamadas de Gram-positivas.

As bactérias Gram-negativas têm uma camada mais fina de peptidoglicano e descolorem o descolorante, perdendo a cor roxa. No entanto, eles ficarão rosa-avermelhados quando uma contracoloração de safranina for adicionada, que se liga a uma camada de lipopolissacarídeo na parte externa. Uma vez coradas, as células podem ser observadas quanto à morfologia, tamanho e arranjo, como em cadeias ou aglomerados, o que auxilia ainda mais na classificação e identificação.

Outra técnica útil no kit de ferramentas do microbiologista é a coloração da cápsula, usada para visualizar cápsulas externas que circundam alguns tipos de células bacterianas. Devido à composição não iônica da cápsula e à tendência de repelir manchas, métodos simples de coloração não funcionam. Em vez disso, é usada uma técnica de coloração negativa, que primeiro mancha o fundo com um corante ácido, como o vermelho Congo, antes que as células bacterianas sejam coradas com violeta cristal. Isso deixa qualquer cápsula presente como um halo claro ao redor das células.

A técnica final de coloração principal abordada aqui pode ajudar a determinar se a bactéria que está sendo estudada forma esporos. Em condições adversas, algumas bactérias produzem endósporos, estruturas dormentes, resistentes e não reprodutivas, cuja função principal é garantir a sobrevivência das bactérias durante períodos de estresse ambiental, como temperaturas extremas ou desidratação. No entanto, nem todas as espécies bacterianas produzem endósporos e são difíceis de corar com técnicas padrão porque são impermeáveis a muitos corantes. O método Schaeffer-Fulton usa corante verde malaquita, que é aplicado às bactérias fixadas em uma lâmina. A lâmina é então lavada com água antes de ser contra-corada com Safranin. As células vegetativas parecerão vermelho-rosadas, enquanto quaisquer endósporos presentes parecerão verdes. Neste vídeo, você aprenderá como executar essas técnicas comuns de coloração bacteriana e, em seguida, examinar as amostras de coloração usando microscopia de luz.

Para iniciar o procedimento, prenda o cabelo comprido e coloque o equipamento de proteção individual adequado, incluindo jaleco e luvas.

Em seguida, limpe uma nova lâmina de microscópio com um lenço de laboratório. Em seguida, pipete 10 microlitros de solução salina tamponada com fosfato 1X na primeira lâmina. Em seguida, use uma ponta de pipeta estéril para selecionar uma única colônia bacteriana da placa de ágar LB. Espalhe a colônia bacteriana no líquido para produzir uma camada fina e uniforme. Coloque o slide na bancada e deixe-o secar totalmente ao ar.

Depois de seco, acenda um bico de Bunsen para fixar as bactérias com calor. Com uma pinça, passe a lâmina pela chama do queimador várias vezes, com as bactérias voltadas para cima, tomando cuidado para não segurar a lâmina na chama por muito tempo, o que pode distorcer as células.

Agora, trabalhando sobre a pia, mantenha o slide nivelado e aplique várias gotas de cristal violeta de Gram para cobrir completamente o esfregaço bacteriano e, em seguida, coloque o slide na bancada para ficar em repouso por 45 segundos. Em seguida, segure a lâmina em ângulo e esguiche suavemente um jato de água na parte superior da lâmina, tomando cuidado para não esguichar a mancha bacteriana diretamente. Agora, mantendo o slide nivelado novamente, aplique a solução de iodo de Gram para cobrir completamente as bactérias coradas e deixe-a repousar por mais 45 segundos. Em seguida, enxágue cuidadosamente o iodo da lâmina, conforme mostrado anteriormente. Enquanto segura a lâmina em ângulo, adicione algumas gotas do descolorante Gram à lâmina, permitindo que ela escorra sobre as bactérias manchadas, apenas até que o escoamento esteja limpo, por aproximadamente 5 segundos. Imediatamente, enxágue com água conforme mostrado anteriormente. Isso limitará a descoloração excessiva do esfregaço. Em seguida, mantendo o slide nivelado novamente, aplique a contracoloração de safranina de Gram para cobrir completamente as bactérias coradas. Após 45 segundos, enxágue suavemente a Safranin da lâmina com água, conforme mostrado anteriormente, e seque com papel toalha.

Por fim, adicione uma gota de óleo de imersão diretamente na lâmina e, em seguida, examine a lâmina usando um microscópio óptico com uma lente objetiva de óleo 100X.

Para iniciar este protocolo de coloração, primeiro coloque o equipamento de proteção individual correto e, em seguida, certifique-se de que as lâminas de vidro que serão usadas estejam limpas.

Em seguida, prepare as soluções. Para fazer uma solução de violeta de cristal a 1%, misture 0,25 gramas de pó de violeta de cristal com 25 mililitros de água destilada e vórtice até dissolver. Em seguida, prepare a solução de vermelho Congo a 1% misturando 0,25 gramas de pó vermelho Congo com 25 mililitros de água destilada e vórtice até dissolver. Agora, pipete 10 microlitros da solução de vermelho Congo na lâmina. Usando uma ponta de pipeta limpa e estéril, selecione uma única colônia bacteriana da placa de ágar LB. Em seguida, espalhe a colônia bacteriana no corante para produzir uma camada fina e uniforme. Seque completamente a lâmina bacteriana ao ar livre por 5-7 minutos. Quando a lâmina estiver seca, inunde a mancha com 1% de cristal violeta suficiente para cobrir a mancha e deixe descansar por 1 minuto. Agora, segure a lâmina em um ângulo e esguiche suavemente um jato de água na parte superior da lâmina, tomando cuidado para não esguichar as bactérias diretamente. Continue segurando o slide em um ângulo de 45 graus até secar completamente ao ar. Por fim, adicione uma gota de óleo de imersão diretamente na lâmina e, em seguida, examine a lâmina usando um microscópio de luz com uma objetiva de óleo 100X.

Para realizar a coloração do endósporo, primeiro prepare uma solução verde de malaquita a 0,5% misturando 0. 125 gramas de pó verde malaquita com 25 mililitros de água destilada e, em seguida, vórtice a solução até dissolver. Em seguida, pipete 10 microlitros de 1X PBS no centro da lâmina. Em seguida, use uma ponta de pipeta estéril para selecionar uma única colônia bacteriana da placa de ágar LB. Espalhe as bactérias no líquido para produzir uma camada fina e uniforme. Agora, coloque o slide na bancada e deixe-o secar totalmente ao ar. Depois de seco, acenda um bico de Bunsen para fixar as bactérias com calor. Passe a lâmina pela chama azul do queimador várias vezes, com o lado da bactéria voltado para cima. Em seguida, depois que a lâmina esfriar, coloque um pedaço de papel pré-cortado para lentes sobre a mancha fixada por calor. Em seguida, ligue uma placa de aquecimento na configuração mais alta e leve um copo de água para ferver.

Sature o papel da lente com a solução verde de malaquita e, usando uma pinça, coloque a lâmina em cima do copo de água fervente para cozinhar por 5 minutos. Mantenha o papel da lente úmido adicionando mais corante, uma gota de cada vez, conforme necessário. Em seguida, novamente usando uma pinça, pegue a lâmina do béquer e remova e descarte o papel da lente. Deixe o slide esfriar por 2 minutos. Trabalhando sobre a pia, segure o escorregador em um ângulo e esguiche suavemente um jato de água na parte superior do escorregador. Agora, mantenha o slide nivelado e aplique Safranin para cobrir completamente o slide. Em seguida, deixe repousar por 1 minuto. Em seguida, segure a lâmina em um ângulo e enxágue conforme mostrado anteriormente. Deixe o slide secar ao ar na bancada. Por fim, adicione uma gota de óleo de imersão diretamente na lâmina e, em seguida, examine a lâmina com um microscópio de luz, com uma objetiva de óleo 100X.

No protocolo de coloração de Gram, podem resultar em duas colorações de cores diferentes. A coloração roxa escura indica que as bactérias são Gram-positivas e que mantiveram a coloração violeta cristalina. Em contraste, a coloração rosa-avermelhada é uma característica das bactérias Gram-negativas, que serão coloridas pela contracoloração Safranina. Além disso, diferentes formas e arranjos de bactérias podem ser visualizados após a coloração de Gram. Por exemplo, é possível diferenciar cocos, ou bactérias redondas, de bacilos em forma de bastonete, ou identificar bactérias, que formam fios, em comparação com aquelas que normalmente se agregam como aglomerados ou ocorrem isoladamente.

Em uma imagem de microscópio corada por cápsula, as células bacterianas normalmente serão coradas de roxo e o fundo da lâmina deve ser corado de forma escura. Contra esse fundo escuro, as cápsulas das bactérias, se presentes, aparecerão como um halo claro ao redor das células.

Por fim, na coloração de endósporos, as células vegetativas serão coradas de vermelho pela contracoloração de Safranina. Se os endósporos estiverem presentes na amostra, eles manterão a mancha verde malaquita e parecerão verde-azulados.