Microscopia e Coloração: Coloração de Gram, Cápsula e Endósporo

1. Gram Staining

1. Configuração
   1. Use luvas e um jaleco não inflamável, pois os corantes mancharão as mãos e as roupas.
   2. Um queimador Bunsen é usado para aquecer a bactéria. Use os cuidados ao trabalhar com chama; amarrar cabelo comprido.
   3. Serão utilizados reagentes de manchas Gram disponíveis comercialmente.
   4. Limpe slides de microscópio com lenços de laboratório.
2. Protocolo
   1. Pipet 10 μL fosfato tamponado soro fisiológico ou caldo de cultura no slide.
   2. Esfregue uma colônia bacteriana no líquido para produzir uma fina camada uniforme.
      Nota: Não use culturas com mais de 24 horas, pois bactérias muito velhas podem ter alterações na parede celular que afetarão os resultados da mancha gram (1, 4).
   3. Deslizamento completamente seco.
   4. Uma vez secas, as bactérias de fixação de calor passam pela chama (lado da bactéria) 4-5 vezes.
      Nota: Não segure o slide na chama por muito tempo ou você pode distorcer as células bacterianas (1).
   5. Trabalhando sobre a pia, segure o nível de slides e aplique o Crystal Violet do Gram para cobrir completamente as bactérias fixas pelo calor, deixe ficar em pé 45 segundos.
   6. Enxágüe o excesso de Crystal Violet segurando o slide em um ângulo e esguichando um fluxo de água gentil e indireto no escorregador e deixando-o escorrer sobre as bactérias manchadas. Não esguiche água diretamente nas bactérias.
   7. Segurando novamente o nível de slides, aplique a solução de iodo do Gram para cobrir completamente as bactérias manchadas, deixe ficar em pé 45 segundos.
   8. Enxágüe o excesso de Iodo como na etapa 1.2.6 acima.
   9. Enquanto segura o slide em um ângulo, adicione algumas gotas de Decolorizer no slide, deixando-o escorrer sobre as bactérias manchadas apenas até que o escoamento esteja limpo; tipicamente, cerca de 5 segundos. Enxágue imediatamente com água como na etapa 1.2.6 acima.
      Nota: Este é um passo crítico no protocolo. Permitir que o Decolorizer escorra por muito tempo ou não o suficiente resultará em falsa mancha de Gram (4).
   10. Segurando novamente o nível de slides, aplique o Safranin do Gram para cobrir completamente as bactérias, deixe ficar em pé 45 segundos.
   11. Enxágüe o excesso de Safranin como na etapa 1.2.6 acima.
   12. Borrida, não esfregue, excesso de água do escorregador usando toalhas de papel.
   13. Examine o slide no microscópio usando a imersão em óleo com um objetivo de 100X.
3. Resultados e Análise de Dados
   1. Bactérias gram-positivas mancharão o roxo.
   2. Bactérias gram-negativas mancharão o vermelho.
   3. A forma (cocci, bacilos, hastes curvas, espirais) de bactérias será visível.
   4. O arranjo de células bacterianas (células únicas, células emparelhadas, cadeias de células, aglomerados, agrupamentos) será visível.

2. Mancha de cápsula

1. Configuração
   1. Use luvas e um jaleco como corantes mancham mãos e roupas.
   2. Para preparar 1% de solução Crystal Violet, misture 0,25 gramas Crystal Violet com 25 mL de água destilada até dissolver.
   3. Para preparar 1% de solução Congo Red, misture 0,25 gramas Congo Vermelho com 25 mL de água destilada até dissolver.
   4. Limpe lâminas com lenços de laboratório.
2. Protocolo
   1. Coloque 10 μL Congo Vermelho no slide.
   2. Usando uma ponta de pipeta, esfregue uma colônia bacteriana no corante para produzir uma fina camada uniforme.
   3. Slide completamente seco com mistura de corante/célula, 5-7 minutos.
      Nota: Não aqueça a correção, pois o aquecimento pode desidratar ou distorcer a cápsula.
   4. Inundar a mancha com 1% de Crystal Violet por 1 minuto.
   5. Enxágüe o excesso de mancha segurando o slide em um ângulo e esguichando um fluxo de água suave e indireto para o escorregador e deixando-o escorrer sobre as bactérias manchadas. Não esguiche água diretamente nas bactérias.
   6. Segure o slide em um ângulo de 45 graus até secar completamente o ar.
   7. Examine a mancha no microscópio sob imersão a óleo com um objetivo de 100X.
3. Resultados e Análise de Dados
   1. Células bacterianas mancharão o roxo.
   2. O fundo do slide manchará o escuro.
   3. Cápsulas serão um halo claro ao redor das células contra um fundo escuro.

3. Coloração de Endospore (método Schaeffer-Fulton)

1. Configuração
   1. Use luvas e jaleco não inflamável para proteger as mãos e as roupas dos corantes e da chama.
   2. Um queimador Bunsen é usado para aquecer a bactéria. Use os cuidados ao trabalhar com chama; amarrar cabelo comprido.
   3. Para preparar 0,5% solução Malachite Green, misture 0,125 gramas Malachite Green com 25 mL de água destilada até dissolver.
   4. Use a solução de reagente Safranin da Gram disponível comercialmente.
   5. Limpe lâminas com lenços de laboratório.
2. Protocolo
   1. Pipet 10 μl fosfato tampão salina (PBS) ou caldo de cultura em slide.
   2. Usando técnica asséptica, esfregue uma colônia bacteriana no líquido para produzir uma camada fina e uniforme.
      Nota: Os endosporos geralmente não se formam em células jovens, portanto, recomenda-se que a cultura tenha entre 18 e 36 horas (9).
   3. Deslizamento completamente seco.
   4. Correção de calor passando slide (bactérias lado para cima) através da chama 4-5 vezes.
   5. Para ajudar a conter o corante, coloque um pedaço de papel da lente (corte para caber a mancha bacteriana) sobre a mancha fixa de calor.
   6. Papel de lente saturada com solução Malachite Green.
   7. Coloque deslize em cima de béquer de água fervente em uma placa quente, e deslize a vapor por 5 minutos, mantendo o papel da lente úmido adicionando mais corante uma gota de cada vez, conforme necessário.
      Nota: Evite superaquecer e secar a solução de corante.
   8. Remova o slide do béquer, remova e descarte o papel da lente, deixe deslizar para esfriar 2 minutos.
   9. Segurando o slide em um ângulo, enxágue completamente esguichando um fluxo de água suave e indireto para o escorregador, permitindo que ele escorra por causa da mancha.
   10. Segurando o nível do slide, a mancha de inundação com Safranin, deixe ficar 1 minuto.
   11. Enxágüe o excesso de Safranin como na etapa 3.2.9 acima.
   12. Deixe secar o ar.
   13. Examine o slide no microscópio sob imersão em óleo com um objetivo de 100X.
3. Resultados e Análise de Dados
   1. Esporos mancharão o verde.
   2. As células vegetativas mancharão o vermelho.
   3. Algumas células vegetativas conterão esporos; as células mancharão o vermelho, enquanto os endosporos mancharão o verde.