Transdução fágica: um método para transferir a resistência à ampicilina da E. coli doadora para a receptora
Fonte: Alexander S. Gold1, Tonya M. Colpitts1
1 Departamento de Microbiologia, Escola de Medicina da Universidade de Boston, Laboratórios Nacionais de…
1. Configuração
- Antes de iniciar qualquer trabalho envolvendo micróbios, esterilize o espaço de trabalho usando 70% de etanol. Use sempre os EPI necessários (jaleco e luvas).
- Certifique-se de que as placas de ágar LB com 1x ampicillina, solução de lise de phage P1 disponíveis comercialmente, clorofórmio, citrato de sódio de 1 M, glicerol e uma caixa de pontas de pipeta plástica pré-esterilizada e espalhadores de células estão próximas.
- Prepare LB estéril autoclaving e use-o para fazer três alíquotas de 1 mL de solução de sal LB.
- mM MgCl2 (952,11-2,3803 μg), 5 mM CaCl2 (11.098 mgs), 0,1-0,2% de glicose (100-200 μg)
- mM MgSO4 (12,0366 mgs), 5 mM CaCl2 (11.098 mgs)
- citrato de sódio mM (25.806 mgs)
- Uma vez terminado, esterilize todas as superfícies, bem como luvas com 70% de etanol e lave as mãos.
2. Protocolo
- Preparação de doadores phage lysate
- Prepare uma cultura de 1 mL do doador W3110 espeto E. coli em LB com 1x ampicilina cultivada durante a noite a 37 °C com aeração e tremendo a 220 rpm.
- Diluir esta cultura durante a noite 1:100 em 1 mL de LB fresco suplementado com 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2e 0,1-0,2% de glicose.
- Cresça esta diluição bacteriana a 37 °C durante 2 horas com aeração e tremendo a 220 rpm.
- Uma vez que essas células tenham atingido a fase de crescimento logarítmico precoce (crescimento perceptível e leve turbidez), adicione 40 μL de phage P1 comercialmente disponível e deixe a 37 °C com aeração e tremendo a 220 rpm.
- Antes da adição de phage, a densidade óptica medida a 600 nm dessas células deve ser de aproximadamente 0,4 (6).
- Monitore as células por 1-3 horas até que a cultura tenha sido lise.
- A lise resultará em aumento de detritos celulares, bem como uma notável diminuição da turbidez (ou seja, as células serão consideradas lísedas uma vez que se possa ver através da cultura).
- Adicione várias gotas (50-100 μL) de clorofórmio ao lise e misture por vórtice.
- O clorofórmio esteriliza o flesato de praga matando todas as células doadoras restantes, deixando apenas a praga e aumentando o título deste lysate.
- Centrifugar lysate a 14.000 rpm por 2 minutos para remover detritos e transferir supernante para um tubo fresco.
- Adicione algumas gotas de clorofórmio e armazene a 4 °C por não mais do que um dia.
- Transdução
- Prepare uma cultura de 1 mL da cepa J53 receptorA E. coli cultivada durante a noite em LB a 37 °C com aeração e tremendo a 220 rpm.
- Transfira 100 μL de flesato de doador (2.1) em um tubo de microfuça de 1,5 mL e incubar com tampa aberta a 37 °C por 30 minutos.
- Esta incubação permite que qualquer clorofórmio restante na solução de lise P1 evapore antes de ser adicionado às células receptoras.
- Células de cepa suavemente receptoras de pelotização por centrifugação a 6.000 rpm por 5 minutos.
- Resuspense essas células em 300 μL de LB fresco contendo 100 mM MgSO4 e 5 mM CaCl2. (A praga P1 requer que o cálcio seja infeccioso).
- Configure duas reações usando as células de bactérias receptoras e o teor de phage de doadores preparados: 1) reação de transdução combinando 100 μL receptor J53 cepa E. coli e 100 μL doador phage lysate, e 2) controle negativo combinando 100 μL receptor J53 cepA E. coli e 100 μL de LB contendo 100 mM MgSO4 e 5 mM CaCl2.
- Incubar a 37 °C por 30 minutos com agitação a 220 rpm.
- Adicione 1 mL LB e 200 μL 1M citrato de sódio (pH=5,5) e incubar por 1 hora a 37 °C com agitação a 220 rpm.
- O citrato é usado para reduzir a infectividade de P1 por quechelating com cálcio, prevenindo a lise das bactérias receptoras.
- A incubação desta solução permite a expressão do marcador de resistência à ampicilina.
- Células de pelotas por centrifugação a 6.000 rpm por 5 minutos.
- Pelotas de células resuspendas em 100 μL de LB com citrato de sódio de 100 mM (pH 5.5). Vórtice e placa inteira solução para ambas as reações em duas placas de ágar LB.
- A placa LB deve ter 1x Amp para a amostra transduzida e nenhum Amp para o controle negativo.
- A contaminação por phage P1 nesta placa requer re-streaking antes que os estoques do congelador possam ser preparados.
- Se a praga não for removida, as culturas cultivadas a partir dessas colônias não crescerão a menos que na presença de um quequeador de cálcio.
- Escolha cerca de 3-4 colônias de ambas as placas e listra novamente em duas placas de ágar LB espalhadas com 100 μL de 1 M de citrato de sódio (pH=5,5).
- A placa LB deve ter 1x Amp para a amostra transduzida e nenhum Amp para o controle negativo.
- Incubar as placas a 37 °C durante a noite para permitir que colônias livres de phage cresçam.
- Escolha colônias de ambas as placas e use-as para cultivar culturas durante a noite em 5 mL de LB a 37 °C com aeração e tremendo a 220 rpm.
- Isole o DNA dessas culturas por miniprep de DNA usando 4,5 mL do volume total da cultura.
- DNA eluto usando 35 μL de água sem nuclease.
- Meça a concentração resultante por Nanodrop. O DNA puro gerará uma razão de absorção (A260/280) de aproximadamente 1,8.
- Use os 0,5 mL restantes de cada cultura para preparar 1 mL de glicerol, fazendo uma mistura de 1:1 de 100% glicerol e cultura bacteriana.
- Armazene estoques de glicerol bacteriano a -80 °C.
3. Análise e Resultados de Dados
- Confirmação da transdução por qPCR
- Prepare duas misturas mestres qPCR para seis reações qPCR, três usando primers qPCR para o gene de resistência à ampicilina, e as outras três usando primers qPCR para um gene de limpeza (14,5 μL por reação): 12,5 μL qPCR buffer mix + 1 μL primer para a frente + 1 μL primer reverso.
- Neste experimento, usamos a mistura mestre SYBR Green.
- Os primers genéticos de limpeza foram projetados para amplificar um segmento de DNA dentro da codificação genética bacteriana para o DNA gyrase B (7).
- Para cada reação qPCR, combine 100 μg de DNA de cada reação (10,5 μL) com 14,5 μL de mix mestre qPCR.
- Utilizando uma máquina qPCR e o protocolo termociclizador listado na Tabela 1, a amplificação foi medida para a resistência à ampicilina e genes de limpeza para todas as seis reações.
- Os valores de CQ gerados pelo qPCR foram utilizados para calcular a eficiência de transdução normalizada do gene de resistência à ampicilina (Figura 3), confirmando a transdução bem sucedida do gene de resistência à ampicilina.
- O valor do Cq, ou valor de quantificação do ciclo, de uma amostra é o número de ciclo PCR mais antigo no qual um sinal excedeu o limiar de fundo é detectado. Os valores baixos do Cq correspondem a mais sequência de alvos, vice-versa.
- A eficiência de transdução normalizada de um gene dentro de uma amostra pode ser calculada usando esses valores de Cq subtraindo o valor do gene de limpeza do gene alvo, gerando um valor ΔCq, que pode ser usado para calcular a eficiência de transdução normalizada em 2(-ΔCq).
- Prepare duas misturas mestres qPCR para seis reações qPCR, três usando primers qPCR para o gene de resistência à ampicilina, e as outras três usando primers qPCR para um gene de limpeza (14,5 μL por reação): 12,5 μL qPCR buffer mix + 1 μL primer para a frente + 1 μL primer reverso.
| Temperatura | Hora | |
| Desnaturação | 94 °C | 2 min. |
| 40 ciclos: | ||
| Desnaturação | 94 °C | 15 seg |
| Annealing, extensão e fluorescência ler | 60 °C ou 5 °C abaixo do primer mais baixo Tm | 1 min. |
Tabela 1: protocolo de termociclismo qPCR
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As bactérias podem se adaptar rapidamente a um ambiente em rápida mudança trocando material genético e uma maneira de fazer isso é por meio da transdução, a troca de material genético mediada por vírus bacterianos. Um bacteriófago, muitas vezes abreviado para fago, é um tipo de vírus que infecta bactérias primeiro se ligando à superfície do hospedeiro e depois injetando seu DNA na célula bacteriana. Em seguida, degrada o próprio DNA da célula hospedeira e replica seu genoma viral, enquanto sequestra o maquinário da célula para sintetizar muitas cópias de suas proteínas. Essas proteínas de fagos então se auto-montam e empacotam os genomas de fagos para formar várias progênies. No entanto, devido à baixa fidelidade do mecanismo de empacotamento do DNA, ocasionalmente, o fago empacota fragmentos de DNA bacteriano no capsídeo do fago. Depois de induzir a lise do hospedeiro, a progênie do fago é liberada e, uma vez que esse fago infecta outra célula hospedeira, ele transfere o fragmento de DNA de seu hospedeiro anterior. Isso pode então se recombinar e se tornar permanentemente incorporado ao cromossomo do novo hospedeiro, mediando assim a transferência de genes entre as duas bactérias.
Para realizar a transdução de fagos em laboratório, é necessária uma cepa doadora que contenha um gene de interesse, uma cepa receptora que não o possua, um fago que possa infectar ambas as cepas e um método para selecionar as bactérias transduzidas. Na maioria dos casos, este será um meio de crescimento sólido seletivo que suporta o crescimento de bactérias transduzidas, mas inibe o crescimento de bactérias não transduzidas. Para começar, a cepa doadora que contém o gene de interesse é cultivada em um meio de crescimento líquido. Quando todas as bactérias estão se dividindo ativamente na fase logarítmica de seu crescimento, a cultura é inoculada com o fago alvo. Após três a quatro horas de incubação, quando quase todas as bactérias lisaram e liberaram as partículas de fago, o lisado de fago do doador é inoculado em uma cultura recém-cultivada da cepa bacteriana receptora. Após uma breve incubação de uma hora, a cultura deve agora conter uma mistura de células bacterianas transduzidas e não transduzidas e esta é rastreada para as células transduzidas espalhando uma fração da suspensão em um meio de crescimento sólido seletivo apropriado. Após incubação adicional, as células transduzidas devem crescer e se multiplicar para produzir colônias visíveis. Essas colônias podem então ser selecionadas para análise posterior usando uma variedade de métodos para confirmar ainda mais a transdução bem-sucedida, como PCR de colônia, sequenciamento de DNA ou PCR quantitativo.
Antes de iniciar o procedimento, coloque qualquer equipamento de proteção individual apropriado, incluindo jaleco e luvas. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com etanol 70% e limpe a superfície.
Depois disso, prepare três alíquotas de um mililitro de solução salina LB. Agora, prepare uma cultura de cepa doadora adicionando 100 microlitros de E. coli a um frasco cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio de crescimento LB com 500 microgramas de ampicilina. Em seguida, cultive a cultura durante a noite a 37 graus Celsius com aeração e agitação a 220 rpm. No dia seguinte, limpe a bancada com etanol a 70% antes de remover a cultura da incubadora agitada. Em seguida, dilua a cultura noturna de um a 100 adicionando 10 microlitros de cepa doadora a 990 microlitros de LB fresco suplementado com solução salina.
Deixar a diluição bacteriana crescer a 37 graus Celsius durante duas horas com arejamento e agitação a 220 rpm. Assim que as células atingirem a fase logarítmica inicial, remova a cultura da incubadora, adicione 40 microlitros de fago P1 à cultura e incube novamente. Continue a monitorar as células por uma a três horas até que a cultura tenha lisado. Em seguida, adicione 50 a 100 microlitros de clorofórmio ao lisado e misture por vórtice. Em seguida, centrifugue o lisado para remover os detritos e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Adicione algumas gotas de clorofórmio ao sobrenadante e armazene-o a quatro graus Celsius por no máximo um dia.
Para iniciar o procedimento de transdução, obter uma cultura de um mililitro da cepa receptora. Em seguida, transfira 100 microlitros de lisado de fago doador para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e incube-o a 37 graus Celsius com a tampa aberta por 30 minutos para permitir que o clorofórmio restante evapore. Enquanto o fago lisado do doador incuba, pelete as células da cepa receptora por meio de centrifugação suave. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 300 microlitros de LB fresco contendo 100 milimolares de sulfato de magnésio e cinco milimolares de cloreto de cálcio.
Em seguida, configure a reação de transdução combinando 100 microlitros da cepa receptora e 100 microlitros do lisado de fago doador em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, configure o controle negativo combinando 100 microlitros da cepa receptora e 100 microlitros do LB com sulfato de magnésio e cloreto de cálcio. Após a incubação, adicione 200 microlitros de citrato de sódio molar e um mililitro de LB a ambos os tubos e misture pipetando suavemente para cima e para baixo. Então, depois que os tubos forem incubados por uma hora, pelete suavemente as células por centrifugação.
Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 100 microlitros de LB com citrato de sódio a 100 milimolares. Vortex as soluções e pipetar toda a amostra transduzida em uma placa de ágar LB com ampicilina 1X. Por fim, pipetar todo o volume da mistura de células de controlo negativo para uma placa de ágar-ágar LB sem ampicilina. Depois de incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius, use uma ponta de pipeta estéril para pegar três a quatro colônias da placa de transdução e coloque-as em uma nova placa de ágar LB contendo 1X ampicilina e 100 microlitros de citrato de sódio molar. Repita este método de plaqueamento para o controle negativo em outra placa de ágar LB contendo apenas 100 microlitros de citrato de sódio molar. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite para permitir que as colônias livres de fagos cresçam.
No dia seguinte, limpe a bancada com etanol 70% antes de remover as placas da incubadora. Usando uma ponta de pipeta estéril, pegue três colônias da placa de transdução e adicione-as a um tubo separado contendo cinco mililitros de meio LB. Em seguida, selecione três colônias da placa de controle negativo e adicione-as a outro tubo contendo cinco mililitros de meio LB. Cultive as culturas durante a noite a 37 graus Celsius com aeração e agitação a 220 rpm. Depois de esterilizar a bancada conforme demonstrado anteriormente, use um kit de minipreparação de DNA para isolar o DNA de 4,5 mililitros de cada cultura de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, eluir o DNA com 35 microlitros de água livre de nuclease e medir a concentração resultante por espectrofotômetro de laboratório. Finalmente, prepare os estoques de glicerol adicionando os 0,5 mililitros restantes de ambas as soluções bacterianas a 0,5 mililitros de glicerol a 100%.
Para confirmar a transdução, primeiro prepare duas misturas principais de qPCR para 24 reações de qPCR. Para a primeira mistura principal, adicione 150 microlitros de mistura tampão qPCR a um tubo de microcentrífuga e 12 microlitros cada de um primer direto e reverso projetado para amplificar o gene de resistência à ampicilina. Em seguida, prepare uma segunda mistura mestre de qPCR adicionando 150 microlitros de mistura mestre de qPCR a um tubo de microcentrífuga e, em seguida, adicionando 12 microlitros de um primer direto e um primer reverso projetados para amplificar um gene de limpeza.
Para cada reação de qPCR, combine 100 microgramas de DNA experimental de cada reação com 14,5 microlitros de mistura principal de qPCR. Agora, prepare as reações restantes conforme demonstrado anteriormente. Transfira as reações para um termociclador pré-aquecido a 94 graus Celsius e, em seguida, inicie o programa. Finalmente, use os valores de quantificação do ciclo, ou Cq, gerados por qPCR para calcular a eficiência de transdução normalizada do gene de resistência à ampicilina.
Os valores de quantificação do ciclo, ou Cq, para os genes de interesse foram tabulados para cada um dos controles negativos e amostras transduzidas. Valores baixos de Cq, normalmente abaixo de 29 ciclos, como as amostras transduzidas neste exemplo, indicam grandes quantidades da sequência alvo.
Um gene de manutenção, também tabulado aqui, é usado como um controle de carga para normalizar a quantidade de DNA em cada reação e como um controle positivo para garantir que o qPCR esteja funcionando. Desde que as mesmas quantidades do gene de limpeza sejam carregadas, ele é encontrado relativamente na mesma taxa em cada amostra.
Em seguida, para calcular o valor delta Cq para cada amostra, subtraia o valor Cq do gene de manutenção para cada amostra do valor Cq de seu gene alvo correspondente. Por exemplo, o delta Cq do primeiro controle negativo é 13,54. Em seguida, use esse valor para calcular a eficiência de transdução normalizada de cada amostra usando a fórmula mostrada aqui. Finalmente, a eficiência média de transdução normalizada para cada grupo de amostra pode ser calculada.
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Q1: How does a bacteriophage transfer DNA between bacterial cells?
A bacteriophage attaches to a bacterial cell surface and injects its DNA, then replicates its genome while hijacking the host's machinery. Due to low-fidelity DNA packaging, the phage occasionally packages bacterial DNA fragments into its capsid. When this phage infects another cell, it transfers the bacterial DNA, which can recombine and integrate into the new host's chromosome, mediating gene transfer between bacteria.
Q2: What are the key requirements for performing phage transduction in the laboratory?
Phage transduction requires a donor strain containing the gene of interest, a recipient strain lacking it, a phage capable of infecting both strains, and a selective growth media that supports transduced bacteria while inhibiting non-transduced ones. The selective media is essential for screening and identifying which bacterial cells successfully received the transferred genetic material.
Q3: Why is chloroform added to the phage lysate during preparation?
Chloroform is added to the phage lysate to inhibit bacterial growth and preserve the phage particles. After centrifugation removes debris, the supernatant containing phage is treated with chloroform and stored at four degrees Celsius for no more than one day, ensuring the phage remains viable for the transduction procedure.
Q4: What role do magnesium sulfate and calcium chloride play in transduction?
Magnesium sulfate and calcium chloride are added to the recipient strain suspension to enhance phage attachment and DNA transfer efficiency. These divalent cations stabilize the phage-bacterial cell interaction, increasing the likelihood of successful transduction by promoting optimal conditions for DNA uptake by recipient cells.
Q5: How does qPCR confirm successful transduction of the ampicillin resistance gene?
qPCR measures cycle quantification (Cq) values for the ampicillin resistance gene and a housekeeping gene. Low Cq values below 29 cycles indicate high target sequence amounts in transduced samples. Delta Cq values normalize results against the housekeeping gene, and normalized transduction efficiency is calculated to confirm the gene transfer occurred in recipient cells.
Q6: What is the purpose of the negative control in phage transduction experiments?
The negative control combines recipient strain with LB medium containing magnesium sulfate and calcium chloride, but without phage lysate. This control undergoes identical steps as the transduction reaction, allowing researchers to verify that any ampicillin resistance detected in transduced samples resulted from phage-mediated gene transfer, not contamination or spontaneous resistance.
Q7: Why is sodium citrate used during the transduction procedure?
Sodium citrate is added after the one-hour incubation period to chelate divalent cations and halt phage-mediated DNA transfer. This stops the transduction reaction at a defined time point, preventing continued gene transfer and allowing researchers to accurately assess the efficiency of the transduction event that occurred during the incubation window.