Transdução fágica: um método para transferir a resistência à ampicilina da E. coli doadora para a receptora

1. Configuração

1. Antes de iniciar qualquer trabalho envolvendo micróbios, esterilize o espaço de trabalho usando 70% de etanol. Use sempre os EPI necessários (jaleco e luvas).
2. Certifique-se de que as placas de ágar LB com 1x ampicillina, solução de lise de phage P1 disponíveis comercialmente, clorofórmio, citrato de sódio de 1 M, glicerol e uma caixa de pontas de pipeta plástica pré-esterilizada e espalhadores de células estão próximas.
3. Prepare LB estéril autoclaving e use-o para fazer três alíquotas de 1 mL de solução de sal LB.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11.098 mgs), 0,1-0,2% de glicose (100-200 μg)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 mgs), 5 mM CaCl₂ (11.098 mgs)
   3. citrato de sódio mM (25.806 mgs)
4. Uma vez terminado, esterilize todas as superfícies, bem como luvas com 70% de etanol e lave as mãos.

2. Protocolo

1. Preparação de doadores phage lysate
   1. Prepare uma cultura de 1 mL do doador W3110 espeto E. coli em LB com 1x ampicilina cultivada durante a noite a 37 °C com aeração e tremendo a 220 rpm.
   2. Diluir esta cultura durante a noite 1:100 em 1 mL de LB fresco suplementado com 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂e 0,1-0,2% de glicose.
   3. Cresça esta diluição bacteriana a 37 °C durante 2 horas com aeração e tremendo a 220 rpm.
   4. Uma vez que essas células tenham atingido a fase de crescimento logarítmico precoce (crescimento perceptível e leve turbidez), adicione 40 μL de phage P1 comercialmente disponível e deixe a 37 °C com aeração e tremendo a 220 rpm.
      1. Antes da adição de phage, a densidade óptica medida a 600 nm dessas células deve ser de aproximadamente 0,4 (6).
   5. Monitore as células por 1-3 horas até que a cultura tenha sido lise.
      1. A lise resultará em aumento de detritos celulares, bem como uma notável diminuição da turbidez (ou seja, as células serão consideradas lísedas uma vez que se possa ver através da cultura).
   6. Adicione várias gotas (50-100 μL) de clorofórmio ao lise e misture por vórtice.
      1. O clorofórmio esteriliza o flesato de praga matando todas as células doadoras restantes, deixando apenas a praga e aumentando o título deste lysate.
   7. Centrifugar lysate a 14.000 rpm por 2 minutos para remover detritos e transferir supernante para um tubo fresco.
   8. Adicione algumas gotas de clorofórmio e armazene a 4 °C por não mais do que um dia.
2. Transdução
   1. Prepare uma cultura de 1 mL da cepa J53 receptorA E. coli cultivada durante a noite em LB a 37 °C com aeração e tremendo a 220 rpm.
   2. Transfira 100 μL de flesato de doador (2.1) em um tubo de microfuça de 1,5 mL e incubar com tampa aberta a 37 °C por 30 minutos.
      1. Esta incubação permite que qualquer clorofórmio restante na solução de lise P1 evapore antes de ser adicionado às células receptoras.
   3. Células de cepa suavemente receptoras de pelotização por centrifugação a 6.000 rpm por 5 minutos.
   4. Resuspense essas células em 300 μL de LB fresco contendo 100 mM MgSO₄ e 5 mM CaCl₂. (A praga P1 requer que o cálcio seja infeccioso).
   5. Configure duas reações usando as células de bactérias receptoras e o teor de phage de doadores preparados: 1) reação de transdução combinando 100 μL receptor J53 cepa E. coli e 100 μL doador phage lysate, e 2) controle negativo combinando 100 μL receptor J53 cepA E. coli e 100 μL de LB contendo 100 mM MgSO₄ e 5 mM CaCl₂.
   6. Incubar a 37 °C por 30 minutos com agitação a 220 rpm.
   7. Adicione 1 mL LB e 200 μL 1M citrato de sódio (pH=5,5) e incubar por 1 hora a 37 °C com agitação a 220 rpm.
      1. O citrato é usado para reduzir a infectividade de P1 por quechelating com cálcio, prevenindo a lise das bactérias receptoras.
      2. A incubação desta solução permite a expressão do marcador de resistência à ampicilina.
   8. Células de pelotas por centrifugação a 6.000 rpm por 5 minutos.
   9. Pelotas de células resuspendas em 100 μL de LB com citrato de sódio de 100 mM (pH 5.5). Vórtice e placa inteira solução para ambas as reações em duas placas de ágar LB.
      1. A placa LB deve ter 1x Amp para a amostra transduzida e nenhum Amp para o controle negativo.
      2. A contaminação por phage P1 nesta placa requer re-streaking antes que os estoques do congelador possam ser preparados.
      3. Se a praga não for removida, as culturas cultivadas a partir dessas colônias não crescerão a menos que na presença de um quequeador de cálcio.
   10. Escolha cerca de 3-4 colônias de ambas as placas e listra novamente em duas placas de ágar LB espalhadas com 100 μL de 1 M de citrato de sódio (pH=5,5).
       1. A placa LB deve ter 1x Amp para a amostra transduzida e nenhum Amp para o controle negativo.
   11. Incubar as placas a 37 °C durante a noite para permitir que colônias livres de phage cresçam.
   12. Escolha colônias de ambas as placas e use-as para cultivar culturas durante a noite em 5 mL de LB a 37 °C com aeração e tremendo a 220 rpm.
   13. Isole o DNA dessas culturas por miniprep de DNA usando 4,5 mL do volume total da cultura.
       1. DNA eluto usando 35 μL de água sem nuclease.
       2. Meça a concentração resultante por Nanodrop. O DNA puro gerará uma razão de absorção (A_260/280) de aproximadamente 1,8.
   14. Use os 0,5 mL restantes de cada cultura para preparar 1 mL de glicerol, fazendo uma mistura de 1:1 de 100% glicerol e cultura bacteriana.
   15. Armazene estoques de glicerol bacteriano a -80 °C.

3. Análise e Resultados de Dados

1. Confirmação da transdução por qPCR
   1. Prepare duas misturas mestres qPCR para seis reações qPCR, três usando primers qPCR para o gene de resistência à ampicilina, e as outras três usando primers qPCR para um gene de limpeza (14,5 μL por reação): 12,5 μL qPCR buffer mix + 1 μL primer para a frente + 1 μL primer reverso.
      1. Neste experimento, usamos a mistura mestre SYBR Green.
      2. Os primers genéticos de limpeza foram projetados para amplificar um segmento de DNA dentro da codificação genética bacteriana para o DNA gyrase B (7).
   2. Para cada reação qPCR, combine 100 μg de DNA de cada reação (10,5 μL) com 14,5 μL de mix mestre qPCR.
   3. Utilizando uma máquina qPCR e o protocolo termociclizador listado na Tabela 1, a amplificação foi medida para a resistência à ampicilina e genes de limpeza para todas as seis reações.
   4. Os valores de CQ gerados pelo qPCR foram utilizados para calcular a eficiência de transdução normalizada do gene de resistência à ampicilina (Figura 3), confirmando a transdução bem sucedida do gene de resistência à ampicilina.
      1. O valor do Cq, ou valor de quantificação do ciclo, de uma amostra é o número de ciclo PCR mais antigo no qual um sinal excedeu o limiar de fundo é detectado. Os valores baixos do Cq correspondem a mais sequência de alvos, vice-versa.
      2. A eficiência de transdução normalizada de um gene dentro de uma amostra pode ser calculada usando esses valores de Cq subtraindo o valor do gene de limpeza do gene alvo, gerando um valor ΔCq, que pode ser usado para calcular a eficiência de transdução normalizada em 2^(-ΔCq).

	Temperatura	Hora
Desnaturação	94 °C	2 min.
40 ciclos:
Desnaturação	94 °C	15 seg
Annealing, extensão e fluorescência ler	60 °C ou 5 °C abaixo do primer mais baixo Tm	1 min.

Tabela 1: protocolo de termociclismo qPCR