Transdução fágica: um método para transferir a resistência à ampicilina da E. coli doadora para a receptora

As bactérias podem se adaptar rapidamente a um ambiente em rápida mudança trocando material genético e uma maneira de fazer isso é por meio da transdução, a troca de material genético mediada por vírus bacterianos. Um bacteriófago, muitas vezes abreviado para fago, é um tipo de vírus que infecta bactérias primeiro se ligando à superfície do hospedeiro e depois injetando seu DNA na célula bacteriana. Em seguida, degrada o próprio DNA da célula hospedeira e replica seu genoma viral, enquanto sequestra o maquinário da célula para sintetizar muitas cópias de suas proteínas. Essas proteínas de fagos então se auto-montam e empacotam os genomas de fagos para formar várias progênies. No entanto, devido à baixa fidelidade do mecanismo de empacotamento do DNA, ocasionalmente, o fago empacota fragmentos de DNA bacteriano no capsídeo do fago. Depois de induzir a lise do hospedeiro, a progênie do fago é liberada e, uma vez que esse fago infecta outra célula hospedeira, ele transfere o fragmento de DNA de seu hospedeiro anterior. Isso pode então se recombinar e se tornar permanentemente incorporado ao cromossomo do novo hospedeiro, mediando assim a transferência de genes entre as duas bactérias.

Para realizar a transdução de fagos em laboratório, é necessária uma cepa doadora que contenha um gene de interesse, uma cepa receptora que não o possua, um fago que possa infectar ambas as cepas e um método para selecionar as bactérias transduzidas. Na maioria dos casos, este será um meio de crescimento sólido seletivo que suporta o crescimento de bactérias transduzidas, mas inibe o crescimento de bactérias não transduzidas. Para começar, a cepa doadora que contém o gene de interesse é cultivada em um meio de crescimento líquido. Quando todas as bactérias estão se dividindo ativamente na fase logarítmica de seu crescimento, a cultura é inoculada com o fago alvo. Após três a quatro horas de incubação, quando quase todas as bactérias lisaram e liberaram as partículas de fago, o lisado de fago do doador é inoculado em uma cultura recém-cultivada da cepa bacteriana receptora. Após uma breve incubação de uma hora, a cultura deve agora conter uma mistura de células bacterianas transduzidas e não transduzidas e esta é rastreada para as células transduzidas espalhando uma fração da suspensão em um meio de crescimento sólido seletivo apropriado. Após incubação adicional, as células transduzidas devem crescer e se multiplicar para produzir colônias visíveis. Essas colônias podem então ser selecionadas para análise posterior usando uma variedade de métodos para confirmar ainda mais a transdução bem-sucedida, como PCR de colônia, sequenciamento de DNA ou PCR quantitativo.

Antes de iniciar o procedimento, coloque qualquer equipamento de proteção individual apropriado, incluindo jaleco e luvas. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho com etanol 70% e limpe a superfície.

Depois disso, prepare três alíquotas de um mililitro de solução salina LB. Agora, prepare uma cultura de cepa doadora adicionando 100 microlitros de E. coli a um frasco cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio de crescimento LB com 500 microgramas de ampicilina. Em seguida, cultive a cultura durante a noite a 37 graus Celsius com aeração e agitação a 220 rpm. No dia seguinte, limpe a bancada com etanol a 70% antes de remover a cultura da incubadora agitada. Em seguida, dilua a cultura noturna de um a 100 adicionando 10 microlitros de cepa doadora a 990 microlitros de LB fresco suplementado com solução salina.

Deixar a diluição bacteriana crescer a 37 graus Celsius durante duas horas com arejamento e agitação a 220 rpm. Assim que as células atingirem a fase logarítmica inicial, remova a cultura da incubadora, adicione 40 microlitros de fago P1 à cultura e incube novamente. Continue a monitorar as células por uma a três horas até que a cultura tenha lisado. Em seguida, adicione 50 a 100 microlitros de clorofórmio ao lisado e misture por vórtice. Em seguida, centrifugue o lisado para remover os detritos e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Adicione algumas gotas de clorofórmio ao sobrenadante e armazene-o a quatro graus Celsius por no máximo um dia.

Para iniciar o procedimento de transdução, obter uma cultura de um mililitro da cepa receptora. Em seguida, transfira 100 microlitros de lisado de fago doador para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e incube-o a 37 graus Celsius com a tampa aberta por 30 minutos para permitir que o clorofórmio restante evapore. Enquanto o fago lisado do doador incuba, pelete as células da cepa receptora por meio de centrifugação suave. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 300 microlitros de LB fresco contendo 100 milimolares de sulfato de magnésio e cinco milimolares de cloreto de cálcio.

Em seguida, configure a reação de transdução combinando 100 microlitros da cepa receptora e 100 microlitros do lisado de fago doador em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, configure o controle negativo combinando 100 microlitros da cepa receptora e 100 microlitros do LB com sulfato de magnésio e cloreto de cálcio. Após a incubação, adicione 200 microlitros de citrato de sódio molar e um mililitro de LB a ambos os tubos e misture pipetando suavemente para cima e para baixo. Então, depois que os tubos forem incubados por uma hora, pelete suavemente as células por centrifugação.

Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 100 microlitros de LB com citrato de sódio a 100 milimolares. Vortex as soluções e pipetar toda a amostra transduzida em uma placa de ágar LB com ampicilina 1X. Por fim, pipetar todo o volume da mistura de células de controlo negativo para uma placa de ágar-ágar LB sem ampicilina. Depois de incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius, use uma ponta de pipeta estéril para pegar três a quatro colônias da placa de transdução e coloque-as em uma nova placa de ágar LB contendo 1X ampicilina e 100 microlitros de citrato de sódio molar. Repita este método de plaqueamento para o controle negativo em outra placa de ágar LB contendo apenas 100 microlitros de citrato de sódio molar. Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius durante a noite para permitir que as colônias livres de fagos cresçam.

No dia seguinte, limpe a bancada com etanol 70% antes de remover as placas da incubadora. Usando uma ponta de pipeta estéril, pegue três colônias da placa de transdução e adicione-as a um tubo separado contendo cinco mililitros de meio LB. Em seguida, selecione três colônias da placa de controle negativo e adicione-as a outro tubo contendo cinco mililitros de meio LB. Cultive as culturas durante a noite a 37 graus Celsius com aeração e agitação a 220 rpm. Depois de esterilizar a bancada conforme demonstrado anteriormente, use um kit de minipreparação de DNA para isolar o DNA de 4,5 mililitros de cada cultura de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, eluir o DNA com 35 microlitros de água livre de nuclease e medir a concentração resultante por espectrofotômetro de laboratório. Finalmente, prepare os estoques de glicerol adicionando os 0,5 mililitros restantes de ambas as soluções bacterianas a 0,5 mililitros de glicerol a 100%.

Para confirmar a transdução, primeiro prepare duas misturas principais de qPCR para 24 reações de qPCR. Para a primeira mistura principal, adicione 150 microlitros de mistura tampão qPCR a um tubo de microcentrífuga e 12 microlitros cada de um primer direto e reverso projetado para amplificar o gene de resistência à ampicilina. Em seguida, prepare uma segunda mistura mestre de qPCR adicionando 150 microlitros de mistura mestre de qPCR a um tubo de microcentrífuga e, em seguida, adicionando 12 microlitros de um primer direto e um primer reverso projetados para amplificar um gene de limpeza.

Para cada reação de qPCR, combine 100 microgramas de DNA experimental de cada reação com 14,5 microlitros de mistura principal de qPCR. Agora, prepare as reações restantes conforme demonstrado anteriormente. Transfira as reações para um termociclador pré-aquecido a 94 graus Celsius e, em seguida, inicie o programa. Finalmente, use os valores de quantificação do ciclo, ou Cq, gerados por qPCR para calcular a eficiência de transdução normalizada do gene de resistência à ampicilina.

Os valores de quantificação do ciclo, ou Cq, para os genes de interesse foram tabulados para cada um dos controles negativos e amostras transduzidas. Valores baixos de Cq, normalmente abaixo de 29 ciclos, como as amostras transduzidas neste exemplo, indicam grandes quantidades da sequência alvo.

Um gene de manutenção, também tabulado aqui, é usado como um controle de carga para normalizar a quantidade de DNA em cada reação e como um controle positivo para garantir que o qPCR esteja funcionando. Desde que as mesmas quantidades do gene de limpeza sejam carregadas, ele é encontrado relativamente na mesma taxa em cada amostra.

Em seguida, para calcular o valor delta Cq para cada amostra, subtraia o valor Cq do gene de manutenção para cada amostra do valor Cq de seu gene alvo correspondente. Por exemplo, o delta Cq do primeiro controle negativo é 13,54. Em seguida, use esse valor para calcular a eficiência de transdução normalizada de cada amostra usando a fórmula mostrada aqui. Finalmente, a eficiência média de transdução normalizada para cada grupo de amostra pode ser calculada.