Amplificação rápida das extremidades de cDNA

1. Experimento configurado para corrida de 3'

1. Projete um primer específico de 5' para um gene de interesse (primer específico de genes 1, GSP-1). Deve ser altamente específico, pois é a única cartilha que introduz especificidade. Portanto, uma cartilha relativamente longa seria preferível (comprimento típico em torno de 24 nucleotídeos, Tm variando de 55-65°C).
2. Projete uma segunda primer aninhada (GSP-2), ou seja, a cartilha deve estar localizada a 3' de GSP-1. Esta etapa é opcional, mas realizar um segundo PCR com uma cartilha aninhada aumentará o rendimento e a especificidade do PCR para o gene de interesse. Os primers usados para amplificar dSmad2 cDNAs estão listados na Tabela 2.

2. Síntese de cDNA

1. Extrair RNA de amostras, utilizando um método de extração de RNA ou kit seguindo o protocolo do fabricante. Trate as amostras com DNase para evitar a amplificação do DNA genômico. Em nosso exemplo, extraímos RNA de 10 moscas adultas inteiras.
2. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume e ajuste com água livre de RNase até um máximo de 100 ng/μl, se necessário.
3. Prepare o cDNA em uma reação de transcrição reversa (RT), usando um kit recomendado para RACE. Prepare uma mistura mestra, com os seguintes reagentes por amostra:
   - 4 μl Tampão de transcrição reversa (5x)
   - 2 μl Oligo(dT)₂₀ primer (um oligo composto por 20 desoxidinadinas)
   - 10 μl RNA (máx. 1 μg)
   - 3 μl ddH₂O
   - 1 μl transcriptase reversa
   - TOTAL: 20 μl
4. Incubar a reação por 90 min a 42ºC. Inclua um controle negativo omitindo transcriptase reversa.
5. Inative a transcriptase reversa incubando a 85ºC por 5 min.
6. Para diluir os níveis de DNA para PCR eficiente, adicione 80 μl de te buffer para levar o volume total a 100 μl.

3. Amplificação de fragmentos de cDNA

1. Prepare o mix pcr de amplificação de primeira rodada usando uma polimerase Taq de alta fidelidade (HF):
   - 4 μl 5x HF Taq tampão de polimerase
   - 0,4 μl dNTP mix (10 mM cada)
   - 1 μl GSP1 primer (10 μM)
   - 1 μl Oligo(dT)20 primer (10 μM)
   - 1 modelo cDNA μl
   - 0,2 μl HF Taq DNA polimerase
   - 12,4 μl ddH2O
   - Total: 20 μl
2. Execute o PCR usando o programa PCR1 (Tabela 1). Inclua um controle negativo usando como modelo o produto RNA original sem RT. Além disso, um controle "sem primer" pode ser incluído.
3. Opcional: PCR aninhado para aumentar a especificidade e a quantidade de produtos cDNA. Diluir 1 μl dos produtos PCR e controle negativo 1:20 no buffer TE. Use-os como modelo para as segundas reações do PCR:
   - 4 μl 5x HF Taq tampão de polimerase
   - 0,4 μl dNTP mix (10 mM cada)
   - 1 μl GSP2 primer (10 μM)
   - 1 μl Oligo(dT)₂₀ primer (10 μM)
   - 1 modelo de produto PCR de 1 μl
   - 0,2 μl HF Taq DNA polimerase
   - 12,4 μl ddH2O
   - Total: 20 μl
4. Execute o segundo PCR usando o programa PCR2 (Tabela 1)

4. Isolamento de fragmentos de CDNA

1. Prepare um gel de 1-2% de agarose com tampão TAE, usando brometo de ethidium ou uma mancha alternativa de DNA.
2. Misture 5 μl de amostra com 1 μl de tampão de carga de gel de 6x.
3. Carregue as amostras e a escada de DNA de 1kb como marcador e execute o gel a 120 V por cerca de 45 minutos ou até que a frente de corante seja ~75% do caminho para baixo do gel. Certifique-se de que as amostras não saiam do gel.
4. Verifique as bandas de gel sob uma lâmpada UV. Para posterior processamento dos produtos, use UV de baixa intensidade, localize as bandas amplificadas e corte-as do gel usando um bisturi.
5. Purifique o DNA do gel usando um método como freeze-squeeze ou um kit.
6. Armazene os fragmentos de cDNA purificados a -20ºC ou use-os imediatamente para outras aplicações, como sequenciamento ou clonagem.