Amplificação rápida das extremidades de cDNA

Normalmente, com novos mRNAs, apenas uma parte de sua sequência completa é conhecida. As sequências de nucleotídeos ausentes nas extremidades do mRNA podem ser determinadas usando um método baseado em PCR chamado Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA, ou RACE.

Em eucariotos, os mRNAs maduros têm características estruturais distintas em ambas as extremidades. Na extremidade de cinco primos, a maioria tem um resíduo de guanosina metilado conectado ao mRNA por meio de uma ligação de trifosfato de cinco primos a cinco primos. Isso também é conhecido como limite de cinco primos. Na extremidade de três primos, a maioria dos eucariotos tem uma cauda de 20 a 250 resíduos de adenilato, chamada de cauda poli (A).

Agora, se a sequência de nucleotídeos de um pequeno segmento for conhecida em qualquer lugar dentro do mRNA, a sequência até sua extremidade de três primos pode ser amplificada usando um primer específico do gene e um primer oligo (dT) não específico que recoze para a cauda poli (A) na extremidade de três primos. Este subconjunto da técnica RACE é chamado de RACE de três primos e permite a detecção de variantes de transcrição e diferentes regiões não traduzidas de três primos, ou UTRs.

A sequência na extremidade de cinco primos pode ser amplificada de forma semelhante. Para fazer isso, uma cauda poli (A) é primeiro anexada na extremidade de cinco primos. Em seguida, usando um primer oligo (dT) não específico que recoze para a cauda anexada e um primer específico do gene, a sequência até a extremidade de cinco primos pode ser amplificada. Este subconjunto de RACE é conhecido como RACE de cinco primos e é usado para encontrar variantes de emenda diferencial de cinco primos e UTRs alternativas de cinco primos.

Para realizar o RACE de três primos para identificar diferentes transcritos codificados por um determinado gene, o RNA é primeiro isolado do organismo ou tecido de interesse. Em seguida, o cDNA é sintetizado a partir dos mRNAs isolados com uma reação de transcrição reversa que utiliza um primer oligo (dT) e uma enzima transcriptase reversa, que gera DNA complementar a partir de um molde de RNA. Em seguida, a partir do pool gerado de cDNAs, a extremidade desconhecida de três primos do cDNA alvo é estendida via PCR, utilizando o primer oligo (dT) não específico e um primer específico do gene, e amplificado durante a reação de PCR.

No entanto, devido à natureza genérica do primer não específico e ao erro aleatório de priming pelo primer específico do gene, eles podem recozer para cDNAs fora do alvo, fazendo com que eles também se amplificem. Para superar esse problema, uma segunda rodada de PCR é conduzida usando primers aninhados, que se ligam a jusante do primeiro conjunto de primers. Este segundo conjunto de primers amplifica ainda mais o cDNA de interesse, mas não o produto não específico, aumentando a especificidade e o rendimento da reação.

Finalmente, os produtos de PCR são separados usando eletroforese em gel de agarose, que separa diferentes transcritos do gene alvo com base em seus tamanhos, produzindo bandas distintas. A banda de interesse pode então ser extirpada, purificada e, finalmente, sequenciada para obter a sequência completa da transcrição.

Neste vídeo, demonstraremos a técnica RACE de três primos para identificar e isolar diferentes transcritos codificados pelo gene Drosophila dSmad2.

Antes de iniciar a síntese e amplificação do cDNA, use um software de design de primer para criar um primer específico de cinco primos para o gene de interesse, dSmad2 neste exemplo. Para garantir que o primer seja altamente específico, ele deve ter cerca de 24 nucleotídeos e ter um Tm variando de 55 a 65 graus Celsius. Em seguida, projete um segundo primer aninhado localizado em três primos do primeiro primer, que também é específico para a sequência alvo.

Para começar, extraia RNA de 10 moscas adultas inteiras com um kit de extração de RNA disponível comercialmente. Uma vez extraído o RNA, ressuspenda o pellet em 20 microlitros de água livre de nuclease. Para uma reação de 50 microlitros, adicione 5 microlitros do tampão de reação a cada tubo de amostra e aumente o volume da reação adicionando 24 microlitros de água livre de nuclease. Em seguida, adicione 1 microlitro de DNase I para evitar a amplificação do DNA genômico. Finalmente, incube as amostras a 37 graus Celsius por 15 minutos.

Após o tratamento com DNase, inative a enzima com 1 microlitro de EDTA 25 milimolar em cada um dos tubos. Adicione a amostra a uma coluna de rotação para purificar o RNA. Em seguida, use um espectrofotômetro de microvolume para medir a concentração de RNA. Ajuste a concentração para 100 nanogramas por microlitro adicionando água livre de nuclease.

Agora, prepare uma mistura mestre para a reação de transcrição reversa. Para além das amostras de ADN de ensaio, incluir um controlo negativo, omitindo a transcriptase inversa do tubo adequado. Incube as reações por 90 minutos a 42 graus Celsius. Em seguida, inative a transcriptase reversa incubando os tubos a 85 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, dilua os níveis de DNA adicionando 80 microlitros de tampão TE a cada tubo para elevar o total da reação para 100 microlitros.

Agora que o cDNA é sintetizado, amplifique o gene de interesse via PCR. Para fazer isso, primeiro prepare a mistura de PCR de amplificação da primeira rodada. Além do molde de cDNA, inclua uma reação de controle negativo que usa o molde do produto não transcrito reversamente, bem como uma reação que não tem o primer específico do gene como controle sem primer.

Uma vez preparadas as reações, realizar amplificações de PCR em um termociclador equipado com tampa aquecida. Em seguida, dilua os produtos de 1 a 20 adicionando 1 microlitro dos produtos de PCR a 19 microlitros de tampão TE. Usando esses produtos diluídos, prepare a mistura de PCR de amplificação de segunda rodada. Em seguida, use um termociclador para executar o segundo PCR.

Para isolar os fragmentos de PCR, prepare um gel de agarose a 1% adicionando 1 grama de agarose por 100 mililitros de tampão TAE. Derreta a mistura por dois minutos no micro-ondas e, em seguida, adicione a mancha SYBR Safe ou o brometo de etídio. Despeje a mistura derretida em uma bandeja de gel e deixe endurecer.

Enquanto o gel está endurecendo, pipete gotículas de 1 microlitro de 6X Loading Dye em um pedaço de parafilme correspondente ao número de amostras. Adicione 5 microlitros de amostra a cada gota. Agora, carregue as amostras, juntamente com uma escada de DNA de 1 quilobase, no gel. Execute o gel a 120 volts por aproximadamente 45 minutos ou até que a frente do corante esteja 75% do caminho para baixo do gel.

Quando o gel terminar de funcionar, verifique as bandas de gel sob um transiluminador UV. Localize as bandas e corte-as com um bisturi. Purifique os fragmentos de cDNA usando um kit de coluna giratória disponível comercialmente. Uma vez purificados, os fragmentos de cDNA podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius ou usados imediatamente para análises posteriores.

Antes deste experimento, dois transcritos para Drosophila dSmad2 foram anotados no banco de dados genômico de Drosophila, FlyBase. Com base no splicing esperado desse gene, dois produtos devem ser identificados pelo protocolo RACE de três primos.

Os resultados deste experimento, no entanto, revelam três transcritos diferentes para dSmad2. Entre os produtos previstos, um transcrito é predominante e um é expresso em um nível inferior. Além disso, um produto menor não descrito anteriormente, visível em 750 pares de bases, foi detectado.