Name: Impressão microcontact de Proteínas de Biologia Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprenda a técnica de impressão microcontact para padronizar proteínas em superfícies de vidro usando fibronectina. Este método permite recriar ambientes extracelulares complexos para estudar adesão celular.

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1. Preparação de soluções e materiais Estes passos devem ser realizados vários dias de antecedência. <ol><li> Lamínulas de vidro. Lamínulas foram limpos por imersão por 10 minutos em uma solução de detergente Linbro provêm 7X: água, misturados em um 1: 3 ratio e aquecida, com agitação, até claro. Lamínulas foram lavadas exaustivamente com água deionizada, e depois cozido a 450 ° C por 6 horas. Carregando lamínulas em racks coloração de cerâmica (veja Os reagentes) simplificou o processo. </li><li> Solução de proteína para carimbar. Fibronectina reconstituir seguir as instruções dos fabricantes para uma solução estoque de uma concentração mg / ml. </li></ol> 2. Elenco selos do mestre topológica Estes passos podem ser realizados vários dias de antecedência. Selos loja padrão-up em um prato coberto, como um prato de cultura de tecidos. <ol><li> Remover a poeira solta de mestre usando um fluxo de ar comprimido, ar filtrado ou gás inerte. </li><li> Coloque o mestre lado, modelado para cima, no fundo de um prato de plástico maior que o mestre. 60 - ou 100 mm de placas de cultura de tecidos são bem adaptados para esta finalidade. </li><li> Em um tubo de centrifugação de poliestireno de 50 ml, combine os componentes Sylgard na proporção de agente de cura: base de elastômero de 1: 10 por peso. Misturar bem utilizando um dispositivo de plástico, como uma pipeta descartável. Prepare pelo menos 0,2 ml de elastômero por centímetro quadrado de área prato. </li><li> Centrifugar o tubo de 50 ml a 300 G por 5 min para remover bolhas de ar. </li><li> Despeje o elastômero sobre o mestre, em seguida, coloque em um dessecador, sob vácuo, por 30 minutos. </li><li> Cura do elastômero em um forno a 65 ° C por pelo menos 2 horas. Cura em temperaturas mais altas e para resultados mais vezes em mais aguerrida elastômero. Deixe esfriar até a temperatura ambiente. </li><li> Separe a folha de selos do mestre. </li></ol> 3. Microcontact impressão de fibronectina em vidro <ol><li> Cortar um único carimbo. Carimbos medindo 4 mm x 4 mm a 1 cm X 1 cm de área e 1-2 mm de espessura são mais fáceis de começar. Coloque o lado padrão acima em uma lâmina de vidro ou prato de plástico. </li><li> Coloque selo em um aspirador de plasma, e processo, sob vácuo, por 30 segundos. A Harrick Científico limpo plasma (vide acessórios), fixado em sua configuração mais alta saída será tornar a superfície hidrofílica PDMS. Mais vezes resultar em quebra do elastômero. </li><li> Diluir a solução fibronectina com água deionizada a uma concentração de estampagem de 50 mcg / ml. </li><li> Coloque uma pequena gota (10-50 L) de estamparia solução no selo. Ele vai se espalhar por toda a superfície hidrofílica. Adicionar única solução o suficiente para que a queda cobre o selo, mas não é executado sobre as bordas. Vamos absorver proteína para carimbar por 5 minutos. </li><li> Usando um ® Kimwipe ou lenço de papel limpo outros, pavio a maior parte da solução de proteína do selo, sem tocar na região modelada. </li><li> Secar a solução restante do selo sob um fluxo de limpeza, gás seco e inerte, como nitrogênio. </li><li> Usando uma pinça, retire o selo da lâmina de vidro, invertido, e coloque em contato com a lamela de vidro limpo (a superfície a ser modelada). Coloque um peso em cima para promover um bom contato. O peso específico que fornece a melhor padronização é dependente do tamanho do selo e padrão; começar com um peso de 5 g, e ajuste entre peças estampadas. Deixe selo em contato com a superfície de um minuto. </li><li> Cuidadosamente desmontar a pilha, e carimbo separado lamela. </li><li> Vigorosamente lavar as lamelas padronizadas em PBS, seguido de água deionizada, para remover proteína que não é adsorvido à superfície. Lamela seco sob corrente de nitrogênio. </li></ol> Resultados representante Microcontact impressão é um processo poderoso para moléculas padronização em superfícies. Este processo tem a capacidade de criar recursos com dimensões variando de dezenas de micrômetros de centenas de nanômetros, na fig. 1A, o logos à esquerda estão cada 200 mM de altura, enquanto as manchas verdes ilustrado na figura. 1B são 1 m de diâmetro e espaçadas em intervalos de 4 M, medido de centro a centro. Fig. 1B também ilustra uma propriedade poderosa da impressão microcontact, ou seja, que ela é e processo aditivo. Várias rodadas de impressão microcontact pode ser aplicada a uma única superfície para criar sistemas multicomponentes 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="Figura A" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="Figura B" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

O processo de impressão microcontact é conceitualmente simples e muito robusto, tendo sido aplicada a padronização uma ampla gama de moléculas em uma variedade de substratos. No entanto, este processo continua a ser algo de uma arte. A geometria específica do padrão a ser criada, a proteína a ser modelada, peso aplicado, e revestimento / condições stamping afetam a qualidade de estamparia. Por exemplo, muito pouco de peso, aplicada a características de grande porte, muitas vezes resulta em falhas no padrão de como pode ser visto no logotipo...

<table><tbody><tr><td>Limpeza a plasma</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>Kit de marcação proteica</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja para coloração</td><td>Reagente</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Reagente</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>Grade de difração</td><td>Reagente</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

impressão microcontact de proteínas de biologia celular

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

A capacidade de proteínas e outras biomoléculas padrão sobre substratos é importante para captar a complexidade espacial do ambiente extracelular. Desenvolvimento da impressão microcontact pelo grupo Whitesides (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; Http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;), Em meados da década de 1990 revolutionalized neste campo, fazendo microeletrônica / técnicas de microfabricação acessível a laboratórios focados em ciências da vida. Implementações iniciais deste método utilizado PDMS (polidimetilsiloxano) selos para criar padrões de produtos químicos nas superfícies de materiais funcionalizados<sup&gt; 1</sup&gt;. Desde então, uma série de abordagens inovadoras foram desenvolvidos para moléculas de outro padrão, incluindo proteínas<sup&gt; 2</sup&gt;. Este vídeo demonstra o processo básico de criação de selos de PDMS e as utiliza para proteínas padrão, como estes passos são difíceis de expressar em palavras com precisão. Nós nos concentramos em padronização da proteína fibronectina da matriz extracelular sobre lamínulas de vidro como um exemplo específico de padronização. Um componente importante do processo de impressão microcontact é um mestre topológico, a partir do qual os selos são lançados; as regiões levantados e abaixados do mestre são espelhados no selo e definir o padrão final. Tipicamente, um mestre consiste em um wafer de silício revestido com fotorresiste e depois modelado por fotolitografia como é feito aqui. Criação de mestres contendo um padrão específico requer equipamento especializado, e é melhor abordado em consulta com um centro de fabricação ou instalação. No entanto, quase todos os suportes com a topologia pode ser usado como um mestre, como redes de difração de plástico (ver Reagentes para um exemplo), e tais mestres serendipitous fornecer prontamente disponíveis, os padrões simples. Este protocolo começa no ponto de ter um mestre na mão.

Microcontact impressão é usado extensivamente às proteínas padrão e outras moléculas nas superfícies de materiais. Demonstramos as etapas básicas desse processo, carimbar padrões de fibronectina em vidro.

Impressão microcontact de Proteínas de Biologia Celular

A capacidade de criar padrões de proteínas e outras biomoléculas em substratos é fundamental para capturar a complexidade espacial do ambiente extracelular.

A microimpressão por contato é utilizada para criar padrões de proteínas e outras moléculas em superfícies de materiais, recriando a complexidade dos ambientes extracelulares. Para iniciar a microimpressão por contato, cria-se um molde topológico e, em seguida, utiliza-se litografia macia para moldar um carimbo a partir do molde, feito de Sylgard. O carimbo pode ser revestido com proteína e então usado para transferir proteínas para uma nova superfície na qual as células podem aderir.Olá, meu nome é Chen. Sou do laboratório do Dr. Lance Camp de engenharia biomédica da Universidade Columbia. Olá, sou GT do Departamento de Engenharia Mecânica.Olá, sou Lance Kem do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade Columbia. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar como as células respondem a arranjos complexos de proteínas em seu ambiente extracelular. Este método foi desenvolvido na metade da década de 1990 pelo laboratório de George Whitesides e tornou-se uma ferramenta amplamente utilizada e valiosa.Existem muitas variações desta técnica, mas hoje G e Co U irão demonstrar o processo básico de microimpressão por contato. Então vamos começar. Para a microimpr

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Biology

Biologia

Este vídeo mostra experimentos com posterior análise de interações proteína-proteína através da utilização de micro-padrão superfícies. A abordagem oferece a possibilidade de detectar as interações de proteínas em células vivas e combina alta capacidade de processamento com a possibilidade de extrair informações quantitativas.

In vivo Detecção de interações proteína-proteína em Micro-padrão Superfícies

Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Uma descrição dos métodos utilizados para converter uma HP DeskJet 500 impressora em um bioprinter. A impressora é capaz de processar as células vivas, o que provoca poros transientes na membrana. Estes poros pode ser utilizada para incorporar pequenas moléculas, incluindo fluorescente G-actina, para dentro das células impressas.

Criando poros celulares transitórios membrana utilizando uma impressora jato de tinta padrão

Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.

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Esta tecnologia de impressão microfluídica 3D imprime matrizes de células em superfícies submersas.  Descrevemos como as matrizes de células são entregues microfluidicamente em células de fluxo 3D em superfícies submersas.  Ao imprimir em superfícies submersas, foram produzidos microarrays celulares que permitem a triagem de medicamentos e a avaliação da citotoxicidade em várias áreas.

A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

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