Name: Foto-Induzida Cross-Linking de Proteínas Unmodified (picup) Aplicada à Peptídeos amiloidogênicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a técnica PICUP para analisar a distribuição de oligômeros em peptídeos amiloidogênicos usando luz intensa e reagentes de reticulação. Este método auxilia no estudo de doenças neurodegenerativas.

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Este trabalho foi financiado por doações e AG027818 AG030709 de NIH / NIA, 2005/2E da L. Larry Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 da Associação Alzheimer, e 07-65798 da Califórnia Departamento de Saúde Pública.

1. Preparação de peptídeos <ol><li> Pesar ~ 100-200 mg de peptídeo liofilizado usando uma microbalança e transferência para rotulados, revestido a silicone, tubos de microcentrífuga de baixa adsorvente. Aqui, nós usamos seqüências de humanos de Aβ40, Aβ42, calcitonina e GRF. </li><li> Aqui, usamos peptídeos pré-tratados com 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obter homogênea, agregar-free preparativos. Esta etapa é necessária porque pré-formados agregados induzir a agregação rápida de proteínas amiloidogênicas, que resultam em reprodutibilidade pobres entre os experimentos 5. Outros métodos, como a filtração ea SEC também pode ser usado para obter agregados sem preparativos para picup 6. </li><li> Para tratar os peptídeos com HFIP, pré-resfriar o recipiente com gelo dentro HFIP um exaustor usando proteção adequada (HFIP é volátil e tóxico). Resfriamento de uma garrafa de 250 ml normalmente exige 10-15 min. Adicionar HFIP de pré-refrigerados contendo tubos lyophilizates peptídeo para obter uma concentração de peptídeo nominal de 0,5 mM. </li><li> Sonicate as soluções em um peptídeo sonicador banho-maria por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Vortex suavemente e incubar os tubos durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Relaxar os tubos no gelo (para 1 min), e dividir as soluções em 10-50-mL em alíquotas de 0,6 ml rotulados de baixa adsorvente tubos. </li><li> Remover HFIP por evaporação sob uma ligeira corrente de nitrogênio, ou deixar os tubos abertos na capela durante a noite. Para a evaporação durante a noite, coloque os tubos abertos em um rack e cobri-los com uma grande folha de Kimwipes para evitar poeira e contaminação por partículas. </li><li> Enxugar o HFIP restantes no vácuo em um liofilizador, ou um concentrador de centrífuga por 30 min, ou em um exsiccator ligado a uma entrada de vácuo por 2 h. O produto final será um filme peptídeo na parte inferior dos tubos de microcentrífuga. Se devidamente ressecada, os tubos podem ser armazenados por longos períodos hermético (meses) a -20 ou -80 ° C. </li></ol> 2. Solubilizar os peptídeos HFIP-tratados e foto cross-linking <ol><li> Antes de solubilizar os peptídeos HFIP-tratado para cross-linking reações, é preciso preparar o cross-linking e reagentes de extinção. </li><li> Pesar persulfato de amônio (APS, o Sr. 228,2 g / mol) e preparar uma solução de 20 mm em 10 mM fosfato de sódio, pH 7.4. Misture usando um vortex até que a solução é clara. </li><li> Prepare uma solução mM de Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium hexa (II) (RuBpy, deputado 748,63 g / mol) em 10 mM fosfato de sódio, pH 7.4. Misture usando um vortex e verificar a completa dissolução. Proteger o tubo de luz usando uma folha de alumínio. </li><li> Para SDS-PAGE após análise cross-linking, um reagente quenching conveniente é de 5% β-mercaptoetanol em 2 × SDS-PAGE tampão de amostra. Alternativamente, um M ditiotreitol (DTT, o Sr. 154,5 g / mol) em água deionizada ou um tampão adequado pode ser usado. </li><li> Filmes HFIP tratados com peptídeo são dissolvidos em NaOH diluída primeiro e depois tampão fosfato de sódio é adicionado para obter concentração de peptídeo ~ 30 mM. Adicionar 60 mM NaOH seguido de água deionizada no tubo contendo o filme de tal forma que peptídeo NaOH e água constituem 10 e 45% do volume final, respectivamente. Raspe o filme peptídeo fora das paredes dentro do tubo de microcentrífuga, utilizando a ponta, misture pipetando cima e para baixo, e sonicate por 5 minutos em um sonicador banho-maria. </li><li> Adicionar 45% de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, mix de pipetagem, e centrifugar a 16.000 g por 10 min. Separe alíquotas de descruzar-linked peptídeos misturado com o reagente de têmpera para controles negativos. </li><li> Ajustar a câmera do obturador demora a 1 s. Às vezes maior irradiação, extensas reações radicais podem causar degradação de proteínas. Carregar o obturador da câmera. Tempo de irradiação pode precisar de ser otimizado quando se utiliza o método com uma nova proteína. </li><li> Uma reação típica é picup realizada em um volume de reação 20 l. Transferência de 18 mL da solução de peptídeo em uma parede fina, clara, tubo de PCR de 0,2 ml. </li><li> Para a solução de peptídeo, adicione 1 mL RuBpy seguido por uma APS mL e misturar os reagentes por pipetagem (a concentração final de RuBpy APS e na mistura de reação será 0,05 e 1 mM, respectivamente). </li><li> Colocar rapidamente o tubo de reação dentro de um frasco de vidro de 1,8 mL. Coloque o frasco dentro do fole anexado na frente do corpo da câmera. Anexar o protetor de lente e pressione o botão do obturador para que a amostra é irradiada por 1 s no interior do fole. </li><li> Após a irradiação da amostra, assumir rapidamente o frasco fora do fole e do tubo de PCR fora do frasco. Rapidamente saciar a reação pela adição de um TDT mL ou 10 mL tampão de amostra reduzindo PAGE. Repita a reação para cada alíquota peptídeo. </li><li> As misturas de reação pode agora ser congeladas a -20 ° C para o armazenamento por um período de 7 dias ou mantidos em gelo antes da análise por SDS-PAGE e coloração de prata. </li></ol> 3. SDS-PAGE e tira-manchasde produtos cross-linked peptídeo <ol><li> Rotina SDS-PAGE e coloração prata-são realizadas para visualizar cruzada peptídeos. </li><li> Carga de 5 mL da mistura de reação por pista para obter ~ 130 pmol de peptídeo por pista. </li><li> Incluem quantidades similares de descruzar-linked peptídeos para comparação. Também incluem uma escada de proteína padrão de aproximação visual de bandas de peso molecular de peptídeos. </li><li> Executar o gel utilizando um aparelho de eletroforese em gel padrão. Nós usamos o sistema de XCell SureLock Mini-Cell da Invitrogen e realizar a coloração de prata de acordo com a publicação Invitrogen IM-1002, Novex Pre-Cast Guia de eletroforese em gel. </li></ol> Parte 4: Resultados Representante (Figura 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: géis de poliacrilamida mostrando uncross-linked (-) e foto-cross-linked (+) GRF, calcitonina, Aβ40 e Aβ42 SDS-PAGE e coloração prata-análises de picup gerado Aβ40 oligômeros mostram intensidades banda aproximadamente igual de monômero através tetrâmero, seguido por uma acentuada diminuição na abundância de oligômeros maior 7. Descruze-linked Aβ40 migra com um deputado consistente com a de monômero 7. Aβ42 mostra uma distribuição de tamanho distintas oligômero. Aβ42 compreendem oligômeros 2-3 grupos de 8. O primeiro grupo, através de monômero trímero, exibe a diminuir de intensidade com a ordem crescente de oligômero. No segundo grupo, a distribuição de Gauss-como é observada entre tetrâmero e heptamer, com um máximo em pentâmero e hexâmero. O terceiro grupo, que não é mostrado aqui, contém oligômeros do Sr. ~ 30,000-60,000 Da 8. Estes oligômeros maior Mr normalmente são observados usando SEC isolada LMW Aβ42 mas não peptídeo preparada por filtração ou tratamento HFIP 6. Descruze-linked Aβ42 produz predominantemente duas bandas, uma banda de monômero e uma banda trímero / tetrâmero amplo, que é um artefato induzida por SDS 5,9. Calcitonina produz uma distribuição de tamanho de oligômero que diverge fortemente de uma diminuição monótono exponencial do monômero região através tetrâmero, sugerindo pré-existência de dímeros, trímeros, tetrâmeros e 7. O controle de polipeptídeo, GRF, produz uma distribuição de oligômero monotônica desde dímeros através de hexâmero de tal forma que os montantes aparente relativa de oligômeros diminuir exponencialmente com o aumento da massa molecular. Em outros experimentos, oligômeros mais altas também poderiam ser visualizadas 7. O número exato e intensidades relativas das bandas de oligômero pode variar um pouco entre os experimentos, dependendo da concentração de proteína real, a quantidade de proteína carregado no gel, eo tempo utilizado para a etapa de desenvolvimento no protocolo de coloração prateada.

<ol><li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions%3A+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li>
<li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions%E2%80%94a+review+with+illustrative+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li>
<li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+chemistry+and+biology%3A+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers%E2%80%94what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+aggregate-free%2C+low+molecular+weight+amyloid-%CE%B2+for+assembly+and+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+%28A%CE%B2%29+assembly%3A+A%CE%B240+and+A%CE%B242+oligomerize+through+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li>
<li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+state+characterization+of+amyloid+%CE%B2-derived+diffusible+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+photochemical+cross-linking%E2%80%94a+new+tool+for+studies+of+metastable%2C+amyloidogenic+protein+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li>
<li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li>
<li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+events+of+%CE%B1-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li>
<li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li>
</ol>

Picup foi desenvolvido originalmente para estudar complexos de proteína estável 2. O método foi aplicado mais tarde para estudo quantitativo de assembléias amilóide metaestável proteína, incluindo Aâ 10, prion e doenças associadas ao PrP Sc 11, e α-sinucleína 12. Os fatores mais importantes que devem ser considerados ao projetar um experimento picup estão a estequiometria reagente, tempo de irradiação, eo procedimento de preparação da amostra. As duas primeiras questões podem exigir otimização emp...

<table><tbody><tr><td>Lâmpada incandescente Dolan-Jenner de 200 W</td><td>Outro</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Modelo 170-D</td><td>O calor gerado pela lâmpada d&amp;#8211;s não afeta as amostras em períodos curtos de incubação.</td></tr><tr><td>Corpo de câmera SLR de 35 mm</td><td>Ferramenta</td><td>Pentax</td><td>Modelo SP500</td><td>Em nossa configuração, um fole é acoplado ao corpo da câmera para fornecer uma câmara conveniente para irradiação da amostra colocada a 10 cm da fonte de luz.</td></tr><tr><td>Tubos PCR transparentes e de parede fina</td><td>Outro</td><td>Eppendorf</td><td>951010006 fornecido pela Fisher L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro (1,8 mL)</td><td>Outro</td><td>Kimble Chase</td><td>60940A 2, fornecido pela Fisher 03-340-60</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>Reagente</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>Reagente</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Utilizar em capela de exaustão.</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 e A&amp;#946;42</td><td>Reagente</td><td>Laboratório de Biopolímeros da UCLA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcitonina</td><td>Reagente</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipiridil)diclororutênio(II) hexaidratado</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Vortex até a solução ficar límpida. Cubra o tubo de RuBpy com papel alumínio para proteger o reagente da luz ambiente. O RuBpy é preparado fresco a cada uso e deve ser utilizado dentro de 48 h.</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Vortex até a solução ficar límpida. O APS é preparado fresco a cada uso e deve ser utilizado dentro de 48 h.</td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 mL</td><td>Pode ser usado quando é realizada a análise por SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Tampão amostral Novex Tricina SDS (2x)</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>Célula Mini XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt;</td><td>Ferramenta</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Géis Novex Tricina (10-20%)</td><td>Outro</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de corrida Novex Tricina SDS (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Coloração Silver Express</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

foto-induzida cross-linking de proteínas unmodified (picup) aplicada à peptídeos amiloidogênicas

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

O conjunto de proteínas amiloidogênicas em oligômeros tóxicos é um evento seminal na patogênese de doenças proteína misfolding, incluindo Alzheimer, Parkinson e doenças de Huntington, esclerose amiotrófica hereditária lateral, e diabetes tipo 2. Devido à natureza metaestável destes conjuntos de proteínas, é difícil avaliar a sua distribuição de tamanho de oligômero quantitativamente usando métodos clássicos, tais como eletroforese, cromatografia de espalhamento de luz, fluorescência, ou dinâmico. Oligômeros de proteínas amiloidogênicas existir como misturas metaestável, em que os oligômeros se dissociam em monômeros e associar em conjuntos maiores simultaneamente. Picup estabiliza populações oligômero por covalente cross-linking e quando combinado com métodos de fracionamento, como eletroforese em gel de sulfato de sódio dodecil de poliacrilamida (SDS-PAGE) ou tamanho-exclusão cromatografia (SEC), picup fornece instantâneos das distribuições de tamanho de oligômero que existia antes de cruz -linking. Assim, picup permite a visualização e análise quantitativa das populações de proteína metaestável e pode ser usado para monitorar a montagem e decifrar as relações entre modificações seqüência e oligomerização<sup&gt; 1</sup&gt;. Mecanicamente, picup envolve foto-oxidação de Ru<sup&gt; 2 +</sup&gt; Num (bipyridyl) Ru tris complexo (II) (RuBpy) a Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Por irradiação com luz visível na presença de um receptor de elétrons. Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; É um oxidante de um elétron forte, capaz de abstrair um elétron de uma molécula de proteína vizinhos, gerando uma proteína radical<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Os radicais são instáveis ​​e altamente reativos e, portanto, as espécies desaparecem rapidamente através de uma variedade de reações intra e intermoleculares. Um radical pode utilizar a energia de alta de um elétron desemparelhado reagir com outro monômero formando uma proteína dimérica radical, que, posteriormente, perde um átomo de hidrogênio e forma uma estável, dímero covalentemente ligadas. O dimer pode então reagir ainda mais através de um mecanismo semelhante com monômeros ou dímeros para formar oligômeros de ordem superior. Vantagens de parente picup para outros foto-química ou cross-linking métodos<sup&gt; 3,4</sup&gt; Incluem a exposição (≤ 1 s) curta para não-destrutiva da luz visível, sem necessidade de<i&gt; Pré facto</i&gt; Modificação da seqüência nativa, e de comprimento zero covalente cross-linking. Além disso, permite picup ligação cruzada de proteínas dentro pH de largura e faixas de temperatura, incluindo parâmetros fisiológicos. Aqui, demonstramos a aplicação de picup cross-linking de três proteínas amiloidogênicas a 40 - e 42 resíduos de amilóide β proteínas variantes (Aβ40 e Aβ42) e calcitonina, e uma proteína de controle, fator de crescimento hormônio liberador (GRF).

Foto-induzida ligação cruzada de proteínas não modificadas (picup) permite a caracterização da distribuição de tamanho de oligômero em misturas de proteínas metaestável. Demonstramos aplicação de picup a três peptídeos representante amiloidogênicas a 40 - e 42 resíduos de formas de amilóide β-proteína, e calcitonina, peptídeo e um controle do fator de crescimento hormônio liberador.

Foto-Induzida Cross-Linking de Proteínas Unmodified (picup) Aplicada à Peptídeos amiloidogênicas

A montagem de proteínas amiloidogênicas em oligômeros tóxicos é um evento fundamental na patogênese de doenças de dobramento incorreto de proteínas, incluindo a doença de Alzheimer, ...

Acredita-se que os oligômeros solúveis de proteínas amiloidogênicas, por meio de suas propriedades citotóxicas, estejam na base da fisiopatologia das doenças neurodegenerativas. Esses oligômeros se formam e se dissociam continuamente quando em solução, um fato que complica os estudos estruturais essenciais para o desenvolvimento de moléculas inibitórias capazes de contornar esse problema.A ligação cruzada induzida por luz de proteínas não modificadas, ou pickup, é utilizada. Este método envolve a exposição de peptídeos amiloidogênicos desagregados e solubilizados a reagentes de ligação cruzada e a um pulso de um segundo de luz intensa para ligar covalentemente dímeros e allers. A distribuição de tamanho dos allers pode então ser analisada por meio de técnicas bioquímicas padrão.Olá, sou Far Rahimi do Laboratório Batan, do Departamento de Neurologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Sou Al Mai do Laboratório Bean. Hoje vamos mostrar a vocês um procedimento para a reticulação induzida por luz de proteínas não modificadas.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para gerar oligômeros do peptídeo beta-amilóide estabilizados e estudar as modificações estruturais na distribuição oligomérica. Este procedimento foi inicialmente publicado por Fancy e Coate para estudar complexos proteicos estáveis. O método foi posteriormente aplicado por Battan e outros para o estudo quantitativo de agregados proteicos amiloidogênicos metaestáveis, incluindo a beta pram e a alpha sycle.Então vamos começar. Para iniciar o protocolo, HEXA fluoro ISOPROPANOL ou HFIP, previamente resfriado em gelo, é adicionado a um tubo revestido com silicone e de baixa absorção contendo de um a 200 microgramas de peptídeo liofilizado, de modo que a concentração final seja cerca de 0,5.O HFIP milimolar evita que os peptídeos amiloidogênicos se agreguem e melhorará a consistência dos resultados. Agora, sonique o tubo do peptídeo por cinco minutos, à temperatura ambiente.Quando a sonicação estiver concluída, agite suavemente os tubos em vórtex e deixe-os em incubação por 30 minutos à temperatura ambiente. Após 30 minutos, resfrie os peptídeos em gelo por um minuto. Os peptídeos resfriados podem agora ser divididos em alíquotas de 10 a 50 microlitros em tubos de baixa absorção de 0,6 mil.Em seguida, coloque os tubos na capela com as tampas removidas. Para permitir a evaporação do HFIP durante a noite, envolva o suporte com os tubos e as toalhas de papel Kim para evitar que poeira se deposite nos tubos. Após a maior parte do HFIP ter evaporado, qualquer traço remanescente de HFIP deve ser removido colocando os tubos em um dessecador sob vácuo por duas horas.O produto final é uma camada fina de filme peptídico dentro dos tubos. Esses tubos podem ser armazenados por meses a menos 20 ou menos 80 graus Celsius. Para iniciar as etapas de solubilização e reticulação fotoquímica, o filme peptídico é primeiro dissolvido em uma solução de hidróxido de sódio diluído.Após adicionar o hidróxido de sódio, adiciona-se água desionizada e, em seguida, tampão fosfato, devendo a solução final conter 45% de tampão fosfato, 45% de água e 10% de solução de hidróxido de sódio. Se houver filme proteico residual aderido à parede do tubo, raspe-o para dentro da solução. Usando a ponteira de uma pipeta, pipete para cima e para baixo; os peptídeos em suspensão devem agora ser sonicados em banho-maria Sonica por um a dois minutos.Após a sonicação, adicione a solução de fosfato e misture pipetando para cima e para baixo. Em seguida, centrifugue o tubo a 16.000 G por 10 minutos. Enquanto a centrífuga estiver em funcionamento, prepare sua câmera para os passos de fotoconjugação.O atraso do obturador da câmera deve ser definido em um segundo e o obturador deve ser carregado. Após a centrifugação dos tubos, faça alíquotas de 18 microlitros da solução de peptídeos em tubos PCR transparentes de 0,2 mL. Essas alíquotas serão usadas para a fotoconjugação cruzada.Certifique-se de separar um pouco da solução de peptídeo para ser usada como controle negativo logo antes da reticulação. Adicione um microlitro de persulfato de amônio e um microlitro de rutênio. Agora, coloque rapidamente o tubo dentro de um vial de vidro de 1,8 M e posicione o vial dentro do fole conectado à frente do corpo da câmera.Feche a câmera com o protetor da lente e pressione o obturador. A amostra é agora irradiada por um segundo. Em tempos de irradiação mais elevados, reações radicais extensivas provocam a degradação da proteína.Uma vez irradiado, recupere rapidamente o tubo PCR de 0,2 mil e adicione 10 microlitros de tampão amostral preparado previamente contendo beta-mercaptoetanol. Os peptídeos reticulados podem ser armazenados por até sete dias a menos 20 graus Celsius. Antes da eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, fracionamento e coloração com prata.Para analisar os peptídeos reticulados, pode-se usar rotineiramente eletroforese em gel de SDS e coloração por prata para estimar os volumes a serem carregados; cinco microlitros da mistura de reação devem gerar aproximadamente 130 picomoles de peptídeo. Recomenda-se utilizar o sistema Xcel Sherlock mini cell da in Vitrogen para eletroforese em gel e realizar a coloração por prata. De acordo com a publicação da in Vitrogen, IM 1 0 0 2, guia de eletroforese em gel pré-moldado NOx, analise seu gel de SDS-PAGE após a coloração por prata; o controle de polipeptídeo não reticulado, GRF, migra principalmente como um monômero.O GRF reticulado produz uma distribuição contínua de todas as ligas que varia desde o dímero até o hexâmero, de modo que a intensidade aparente relativa das bandas de oligômeros diminui exponencialmente com o aumento da massa molecular. A calcitonina não reticulada migra principalmente como monômero e, em parte, como dímero. A calcitonina reticulada gera uma distribuição de tamanhos de ligas que diverge fortemente de uma diminuição exponencial monótona na região.Mônômero até tetrâmero, sugerindo a pré-existência de dímeros, trímeros e tetrâmeros não cruzados. Uma beta 40 migra apenas como um mônômero; sinal detectado gerou uma Beta 40. Todas as ligaduras mostram intensidades de banda aproximadamente semelhantes de mônômero a tetrâmero, seguidas por uma diminuição na abundância de ligaduras superiores.Um não ligado por cross-linking. A beta 42 produz predominantemente duas faixas, uma faixa de monômero e uma faixa de trímero. A faixa de tetramero é um artefato produzido pelo SDS com cross-linking.A Beta 42 mostra uma distribuição distinta de tamanhos de olímeros composta por dois grupos. O primeiro grupo, do monômero ao trímero, exibe intensidade decrescente com o aumento da ordem do olímero. No segundo grupo, observa-se uma distribuição semelhante a um pico entre o tetrâmero e o heptâmero, com um máximo no pentâmero e hexâmero.Acabamos de mostrar como realizar a reticulação da proteína utilizando pika com este procedimento. É importante lembrar que, ao utilizarmos uma proteína amilóide, devemos garantir que os preparos estejam livres de agregados para obter resultados reprodutíveis. As condições apresentadas aqui e esses experimentos podem ser modificados experimentalmente de acordo com os íons de interesse. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte ao utilizar o experimento de pickup.

photo-induced-cross-linking-unmodified-proteins-picup-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aptâmeros são ribo-/deoxyribo-oligonucleotides curtas selecionados...

Seleção de Aptamers para proteína β-amilóide, o agente causador da doença de Alzheimer

As proteínas podem adotar uma estrutura nativa ou se dobrar em amilóide insolúvel. As condições que favorecem a via de desdobramento levam à formação de diferentes tipos de fibrilas amilóides. Os métodos descritos aqui permitem a rápida conversão de proteínas nativas em amilóide in vitro.

Geração rápida de amilóide a partir de proteínas nativas in vitro

Embora o transporte de proteínas de superfície celular está relativamente facilmente estudado, visualizando o tráfico de proteínas intracelulares é muito mais difícil. Aqui, usamos construções que incorporam GFP fotoactivável e demonstrar um método para seguir com precisão a proteína precursora de amilóide do aparelho de Golgi para compartimentos a jusante e siga a sua depuração.

Imaging o tráfego intracelular de APP com GFP fotoactivável

O amilóide-β (Ap) -injected modelo animal permite a administração de uma quantidade e espécie de fragmentos de Ap definidos e reduz as diferenças individuais dentro de cada grupo de estudo. Este protocolo descreve a injecção intracerebroventricular (ICV) de Ap sem instrumentos estereotáxicas, permitindo a produção de anormalidades comportamentais Alzheimer-like em ratinhos normais.

Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like

Aqui, relatamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado que produz peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza, capazes de formação de oligômeros. A beta-amiloide é um peptídeo hidrofóbico altamente propenso a agregação implicado na doença de Alzheimer. A natureza amiloidogênica do peptídeo torna sua purificação um desafio.

A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Oligï¿½ero

Deposição de amiloide é uma marca registrada de diferentes doenças e aflige muitos órgãos diferentes. Este artigo descreve a aplicação da fluorescência luminescent oligothiophene conjugados coloração em combinação com técnicas de microscopia de fluorescência. Este método de coloração representa uma poderosa ferramenta para detecção e exploração de agregados de proteínas em configurações clínicas e científicas.

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

Um protocolo para a síntese de um 1,2-Ditiolano modificado de peptídeo e a caracterização das estruturas supramoleculares resultantes do peptide auto-montagem.

Síntese e caracterização de 1,2-Ditiolano modificado peptídeos auto-montagem

Este trabalho descreve como a microscopia de dois fótons sensível à polarização pode ser aplicada para caracterizar a organização local dentro de superestruturas-esferulitos amiloides livres de marcação. Também descreve como preparar e medir a amostra, montar a configuração necessária e analisar os dados para obter informações sobre a organização local das fibrilas amiloides.

Microscopia de dois fótons sensível à polarização para caracterização estrutural amiloide livre de marcação

Aqui, apresentamos um método sistemático que descreve a automontagem quase reversível dos agregados de ouro de 20 nm revestidos com beta amilóide 1-40 (Aβ 1-40). A rede quase reversível dependente do tamanho nanométrico entre os peptídeos foi correlacionada com aminoácidos específicos ou seções do monômero Aβ 1-40.

Caracterização da automontagem reversível dependente de pH de colóides de ouro revestidos com beta-amiloide 1-40

Aprenda a técnica PICUP para analisar a distribuição de oligômeros em peptídeos amiloidogênicos usando luz intensa e reagentes de reticulação. Este método auxilia no estudo de doenças neurodegenerativas.

Foto-Induzida Cross-Linking de Proteínas Unmodified (picup) Aplicada à Peptídeos amiloidogênicas

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