Name: Drosophila larval Dissection MNJ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprenda a dissecar larvas de Drosophila para análise de junções neuromusculares usando pinos, tesoura e pinças. Este protocolo padronizado permite visualização clara para imunohistoquímica e estudos de neurociência.

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Antes de começar a <ol><li> Todas as culturas devem ser cultivadas a 25 ° C. </li><li> HL3.1 tampão dissecção pode ser preparado com antecedência. Dê uma alíquota de 50 ml de HL3.1 e mantê-lo no gelo. </li><li> Prepare 15 ml de formaldeído 3,5% fresco em HL3.1. Mantê-lo no gelo. </li></ol> Dissecação das larvas <ol><li> Coloque uma gota de HL3.1 fria na placa de dissecção. Isto irá manter o animal de secagem e atordoar o animal tornando-o mais fácil de trabalhar. </li><li> Usando a pinça longa, selecione um errante larva de terceiro instar e coloque-o na queda de HL3.1. </li><li> Primeiro, utilize uma pinça curta para agarrar um alfinete minutien. Coloque o pino entre os espiráculos posteriores. O animal normalmente irá tentar arrastar para longe o pino estendendo-se para fora e tornando mais fácil para você colocar um pino diretamente na cabeça da larva perto os ganchos na boca. Estique o animal no sentido longitudinal. Isso irá ajudá-lo a maximizar a quantidade de parede do corpo exposto você pode conseguir durante o corte. Nota: Se você optar por fixar a cabeça primeiro, o animal pode envolver seu corpo em torno do pino ou chicote o seu corpo para trás e para frente o que dificulta a pino. Geralmente você pode contrariar esta removendo o HL3.1 e colocando uma gota limpa e fria impressionante o animal novamente. O cientista ambidestro também pode simplesmente pegar o animal e mantê-lo no lugar. </li><li> Tesoura primavera, utilizando fazer uma incisão horizontal logo anterior ao pino posterior no lado dorsal da larva. Coloque uma lâmina da tesoura na incisão e fazer um corte vertical ao longo da linha média dorsal até o final rostral da larva. Na tribuna do animal fazer incisões horizontal para a esquerda e direita do pino. Nota: o resultado final deverá ser parecido com um I do lado dorsal da larva ao longo do eixo rostro-caudal. </li><li> Remover os órgãos. Comece por colocar várias quedas adicionais da HL3.1 na larva. Isso permitirá que os órgãos de flutuar para fora do corpo que lhe permite removê-los muito mais facilmente. Primeiro, remova o sistema traqueal. Em segundo lugar, use a pinça para pegar o resto dos órgãos e removê-los. </li><li> Durante a etapa 3, você fez um flap flap esquerdo e direito na parede do corpo. Pin as abas em uma ordem no sentido horário certificando-se de esticar a parede do corpo tanto horizontalmente quanto verticalmente. </li></ol> Fixação Fix cada animal em formol 3,5% em HL3.1 por 25 minutos. Lavar o animal duas vezes na HL3.1 por 5 minutos. Armazenamento Remova os pinos e transferir as larvas a um tubo de 1,5 ml contendo 1X PBS. Se você pretende usar a imagem do MNJ fundido etiquetas fluorescentes, você deve imagem dos animais dentro de dois dias. Você pode armazenar as larvas dissecadas por até uma semana a 4 ° C. Resultados representativos Existem vários componentes chave de uma larva Drosophila devidamente dissecado. Primeiro, é preciso tomar cuidado extra para não danificar os músculos, principalmente os músculos 4, 6 e 7. Estes são os músculos mais populares de estudar e se eles forem danificados descartar a prep filé e dissecar um outro animal. Em segundo lugar, é preciso se certificar de que o animal é esticado ao máximo para que cada músculo e MNJ podem ser distinguidos.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

A técnica de dissecação demonstrou neste vídeo pode ser usado para preparar larvas Drosophila para uma variedade de técnicas experimentais. Se as tags proteína fluorescente estão presentes, as larvas podem ser montados e representado imediatamente. Caso contrário, imunocoloração podem ser realizadas a fim de marca específica compartimentos sináptica. Além disso, eletrofisiologia pode facilmente ser executada no larvas dissecadas para avaliar o funcionamento da neurotransmissão. O MN...

HL3 buffer Dissection: (em mM) 70 NaCl, KCl 5, 0,2 CaCl2, MgCl2 20, 10 NaHCO3, 5 trealose, 115, sacarose e 5 HEPES, pH 7.3.<br /<br /&gt; Placa Sylgard Dissecando: Misture delicadamente (para evitar bolhas) 10:01 num copo. Despeje a mistura em Placa de Petri (qualquer tamanho). Permitir Sylgard para curar durante a noite em 37C incubadora.

drosophila larval dissection mnj

Drosophila Larval NMJ Dissection

O<em&gt; Drosophila</em&gt; Junção neuromuscular (MNJ) é um sistema modelo estabelecido utilizada para o estudo do desenvolvimento e plasticidade sináptica. O uso generalizado do<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor do sistema é devido a sua alta acessibilidade. Ele pode ser analisado com uma única célula de resolução. Há 30 músculos por hemisegment cuja disposição dentro da parede do corpo periféricos são conhecidas. Um total de 35 neurônios motores atribuem a estes músculos em um padrão que tem alta fidelidade. Utilização da biologia molecular e genética, pode-se criar animais transgênicos ou mutantes. Então, pode-se estudar as conseqüências do desenvolvimento sobre a morfologia ea função do MNJ. Para acessar o MNJ para o estudo, é necessário dissecar cuidadosamente cada larva. Neste artigo vamos demonstrar a maneira correta de dissecar<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas para o estudo do MNJ, removendo todos os órgãos internos, deixando a parede do corpo intacto. Esta técnica é adequada para preparar as larvas para imagens, imuno-histoquímica, ou eletrofisiologia.

Este protocolo demonstra como dissecar<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas em preparação para imuno-histoquímica e / ou imagem da junção neuromuscular.

Drosophila larval Dissection MNJ

A junção neuromuscular (JNM) de Drosophila é um sistema modelo estabelecido, utilizado para o estudo do desenvolvimento e da plasticidade sináptica. O uso generalizado...

Este procedimento começa com a colocação de uma larva de terceiro estádio em uma placa de dissecação. Alfinetes são posicionados nas extremidades posterior e anterior da larva. Uma tesoura é usada para abrir a larva e uma pinça é utilizada para remover os órgãos internos.Por fim, mais quatro alfinetes são colocados em cada canto da parede corporal da larva para mantê-la esticada durante a fixação. Olá, sou Jonathan Brent do Laboratório de Brian McCabe do Departamento de Fisiologia e biofísica solitária na Faculdade de Médicos e Cirurgiões da Universidade Columbia. Hoje mostraremos a você o procedimento para dissecação de larva de drosófila e MJ.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o desenvolvimento sináptico da junção neuromuscular. Então, vamos começar. Nas larvas de drosófila, existem 30 músculos por hemiesegmento cuja disposição na parede corporal periférica é conhecida.No total, 35 neurônios motores inervam esses músculos em um padrão altamente estereotipado. Para acessar a junção neuromuscular ou NMJ, é necessário dissecar cuidadosamente cada larva com uma dissecação adequada. A NMJ pode ser usada para imagens de imunohistoquímica ou eletrofisiologia.Inicie o procedimento colocando uma gota de tampão HL 3.1 sobre uma placa de dissecação. O tampão é preparado previamente e resfriado em gelo. Escolha cuidadosamente uma larva de terceiro estágio em fase de dispersão do lado do frasco utilizando pinças de aço inoxidável grandes.O movimento indica que a larva ainda não entrou em pupação. Coloque a larva com o lado dorsal voltado para cima na gota de tampão sobre a placa de dissecação. O tampão frio anestesiará a larva e a manterá imóvel com o uso de pinças. Coloque um alfinete mnuchin entre as esferas posteriores, depois posicione um segundo alfinete próximo aos ganchos bucais escuros, de modo que a larva fique esticada e pronta para ser aberta. Usando tesoura de ponta fina, faça uma pequena incisão horizontal em direção à extremidade posterior das larvas. Insira uma lâmina da tesoura na cavidade do corpo e faça um corte no sentido longitudinal em direção à extremidade anterior da larva. Em seguida, faça incisões horizontais na extremidade anterior das larvas, à esquerda e à direita do alfinete.Para remover órgãos como o intestino, adicione várias gotas de tampão HL 3.1 ao animal; o intestino e outros órgãos flutuarão na solução e poderão ser puxados para longe do corpo com pinças. Remova também o sistema traqueal junto com os demais órgãos. Agora, exponha os músculos internos do corpo fixando para trás as abas criadas pelas incisões.Certifique-se de esticar as paredes do corpo abertas horizontal e verticalmente ao fixar as abas. Remova quaisquer pedaços remanescentes de órgãos e lave uma vez.Adicionando tampão HL 3.1 fresco, a larva está agora pronta para ser fixada com formaldeído recém-preparado diluído a 3,5% em um XPBS, imergindo completamente as larvas e o fixador e aguardando 25 minutos. Quando o período de fixação terminar, lave as larvas duas vezes com tampão HL 3.1 por três minutos. Remova cuidadosamente os alfinetes e transfira as larvas para tubos de 1,5 mL contendo um XPBS, se necessário.As larvas podem ser armazenadas por até dois dias a quatro graus Celsius. Para obter resultados ideais, utilize as larvas dissecadas imediatamente. Existem vários componentes principais em uma larva de drosófila corretamente dissecada.Primeiro, tenha cuidado para não danificar os músculos, especialmente os seis, sete e quatro. Segundo, o animal deve ser adequadamente esticado. Caso contrário, a junção neuromuscular pode não ser acessível ou distinguível.Aqui você pode ver uma larva dissecada corretamente. A junção neuromuscular é claramente visível e o sistema agora está pronto para experimentos. Acabamos de mostrar como dissecar larvas esofágicas para estudar a junção neuromuscular.Ao realizar este procedimento, é importante manter os músculos intactos. Se os músculos forem danificados, não haverá junções neuromusculares para estudar. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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No patch situ gravações de fixação são usados ​​para a caracterização eletrofisiológica dos neurônios no circuito intacto. No modelo genético Drosophila patch clamping é difícil, porque o SNC é pequeno e está rodeado por uma bainha robusto. Este artigo descreve o procedimento para remover os neurônios bainha e limpa para gravações posteriores braçadeira de patches.

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Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

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Aprenda a dissecar larvas de Drosophila para análise de junções neuromusculares usando pinos, tesoura e pinças. Este protocolo padronizado permite visualização clara para imunohistoquímica e estudos de neurociência.

Drosophila larval Dissection MNJ

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