Drosophila larval Dissection MNJ

Este procedimento começa com a colocação de uma larva de terceiro estádio em uma placa de dissecação. Alfinetes são posicionados nas extremidades posterior e anterior da larva. Uma tesoura é usada para abrir a larva e uma pinça é utilizada para remover os órgãos internos.

Por fim, mais quatro alfinetes são colocados em cada canto da parede corporal da larva para mantê-la esticada durante a fixação. Olá, sou Jonathan Brent do Laboratório de Brian McCabe, do Departamento de Fisiologia e Biofísica Solúvel da Faculdade de Médicos e Cirurgiões da Universidade Columbia. Hoje mostraremos a você o procedimento para dissecação de larva de drosófila e MJ.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o desenvolvimento sináptico da junção neuromuscular. Então, vamos começar. Em larvas de drosófila, existem 30 músculos por hemiesegmento, cuja disposição na parede corporal periférica é conhecida.

No total, 35 neurônios motores inervam esses músculos em um padrão altamente estereotipado. Para acessar a junção neuromuscular ou NMJ, é necessário dissecar cuidadosamente cada larva com uma dissecação adequada. A NMJ pode ser usada para imagens de imunohistoquímica ou eletrofisiologia.

Inicie o procedimento colocando uma gota de tampão HL 3.1 sobre uma placa de dissecação. O tampão é preparado previamente e resfriado em gelo. Cuidadosamente, escolha uma larva de terceiro estágio em movimento na lateral do frasco utilizando pinças SS grandes.

O movimento indica que a larva ainda não entrou em pupação. Posicione a larva com o lado dorsal voltado para cima na gota de tampão sobre a placa de dissecação. O tampão frio anestesiará a larva e a manterá imóvel com o uso de pinças. Coloque um alfinete mnuchin entre as esferas posteriores, depois posicione um segundo alfinete próximo aos ganchos bucais escuros, de modo que a larva fique esticada e pronta para ser aberta.

Usando tesoura de ponta, faça uma pequena incisão horizontal em direção à extremidade posterior das larvas. Insira uma lâmina da tesoura na cavidade do corpo e faça um corte no sentido longitudinal em direção à extremidade anterior da larva. Em seguida, faça incisões horizontais na extremidade anterior das larvas, à esquerda e à direita do alfinete.

Para remover órgãos como o intestino, adicione várias gotas de tampão HL 3.1 ao animal; o intestino e outros órgãos flutuarão na solução e poderão ser retirados do corpo com pinça. Remova também o sistema traqueal junto com os outros órgãos. Agora, exponha os músculos internos do corpo fixando com alfinetes as abas criadas pelas incisões.

Certifique-se de esticar as paredes do corpo abertas horizontal e verticalmente ao fixar as abas. Remova quaisquer pedaços remanescentes de órgãos e lave uma vez.

Adicionando tampão HL 3.1 fresco, a larva está agora pronta para ser fixada com formaldeído recém-preparado diluído a 3,5% em um XPBS, imergindo completamente as larvas e o fixador e aguardando 25 minutos. Quando o período de fixação terminar, lave as larvas duas vezes com tampão HL 3.1 por três minutos. Remova cuidadosamente os pinos e transfira as larvas para tubos de 1,5 mL contendo um XPBS, se necessário.

As larvas podem ser armazenadas por até dois dias a quatro graus Celsius. Para obter resultados ideais, utilize as larvas dissecadas imediatamente. Existem vários componentes principais em uma larva de drosófila dissecada corretamente.

Primeiro, tenha cuidado para não danificar os músculos, especialmente os seis, sete e quatro. Segundo, o animal deve ser adequadamente esticado. Caso contrário, a junção neuromuscular pode não ser acessível ou distinguível.

Aqui você pode ver uma larva dissecada corretamente. A junção neuromuscular é claramente visível e o sistema agora está pronto para experimentos. Acabamos de mostrar como dissecar larvas esofágicas para estudar a junção neuromuscular.

Ao realizar este procedimento, é importante manter os músculos intactos. Se os músculos forem danificados, não haverá junções neuromusculares para estudar. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.