Drosophila larval Dissection MNJ

Este procedimento começa com a colocação de larvas de terceiro ínstar na placa de dissecação. Os pinos são colocados nas extremidades posterior e anterior das larvas. Tesouras são usadas para cortar as larvas e pinças são usadas para remover os órgãos internos.

Finalmente, mais quatro pinos são colocados em cada canto da parede do corpo da larva para mantê-la esticada durante a fixação. Olá, sou Jonathan Brent do Laboratório de Brian McCabe no Departamento de Fisiologia e biofísica solo da Faculdade de Médicos e Cirurgiões da Universidade de Columbia. Hoje mostraremos o procedimento para dissecção de larvas de drosófilas e MJ.

Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar o desenvolvimento sináptico da junção neuromuscular. Então vamos começar. Nas larvas de drosófila, existem 30 músculos por hemi segmento cujo arranjo dentro da parede periférica do corpo é conhecido.

Um total de 35 neurônios motores inervam esses músculos em um padrão altamente estereotipado. Para acessar a junção neuromuscular ou NMJ, é necessário dissecar cuidadosamente cada larva com dissecção adequada. A JNM pode ser usada para imagem, imuno-histoquímica ou eletrofisiologia.

Comece o procedimento colocando uma gota de tampão HL 3.1 em uma placa de dissecação. O buffer é feito com antecedência e resfriado no gelo. Escolha cuidadosamente uma larva de estrela errante da lateral do frasco usando uma grande pinça SS.

O movimento indica que as larvas não entraram Pupação Coloque as larvas com o lado dorsal para cima na gota tampão na placa de dissecação. O tampão frio anestesiará as larvas e as manterá paradas usando uma pinça. Coloque um alfinete de mnuchin entre as esféricas posteriores e, em seguida, coloque um segundo alfinete perto dos ganchos escuros da boca para que as larvas fiquem esticadas e prontas para se abrirem.

Usando uma tesoura de mola, faça uma pequena incisão horizontal em direção à extremidade posterior das larvas. Insira uma lâmina da tesoura no sci e faça um corte longitudinal em direção à extremidade anterior da larva. Em seguida, faça incisões horizontais na extremidade anterior das larvas à esquerda e à direita do pino.

Para remover órgãos como o intestino, adicione várias gotas de tampão HL 3.1 ao animal, o intestino e outros órgãos flutuarão para dentro da solução e podem ser puxados para longe do corpo usando uma pinça. Além disso, remova o sistema traqueal com os outros órgãos. Agora exponha os músculos internos do corpo prendendo as abas feitas pelas incisões.

Certifique-se de esticar as paredes do corpo horizontalmente e verticalmente. Ao prender as abas. Remova todos os pedaços de órgãos restantes e lave uma vez.

Ao adicionar um tampão HL 3.1 fresco, a larva está agora pronta para ser fixada com formaldeído recém-feito diluído a 3,5% em um XPBS mergulhe completamente as larvas e o fixador e aguarde 25 minutos. Terminado o período de fixação, lavar as larvas duas vezes com tampão HL 3.1 durante três minutos. Remova cuidadosamente os pinos, transfira as larvas para tubos de 1.5 mil contendo um XPBS, se necessário.

As larvas podem ser armazenadas por até dois dias a quatro graus Celsius. Para obter os melhores resultados, use as larvas dissecadas imediatamente. Existem vários componentes-chave para uma larva de drosófila devidamente dissecada.

Primeiro, tome cuidado para não danificar os músculos, especialmente seis, sete e quatro. Em segundo lugar, o animal deve estar devidamente esticado. Caso contrário, a junção neuromuscular pode não ser acessível ou distinguível.

Aqui você pode ver uma larva devidamente dissecada. O NMJ é claramente visível e o sistema agora está pronto para experimentos. Acabamos de mostrar como dissecar larvas esofágicas para estudar a junção neuromuscular.

Ao fazer este procedimento, é importante manter os músculos intactos. Se os músculos estiverem danificados, não haverá junções neuromusculares para estudar. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.