Name: Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda imunohistoquímica em larvas de Drosophila para visualizar proteínas na junção neuromuscular. Este método permite estudar a regulação genética da formação sináptica em neurociência.

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Antes de começar a <ol><li> Prepare as seguintes soluções: PBT (0,1% Triton X100 em 1X PBS), PBTB (0,2% BSA em PBT), e PBTN (NGS 2% em PBTB). </li><li> Dissecar as larvas Drosophila. Consulte Drosophila larval Dissection MNJ. </li></ol> Imuno-histoquímica <ol><li> Mover as larvas a um tubo de 1,5 ml contendo PBT. Lavar as larvas duas vezes por 15 minutos no PBT. Nota: para lavar, coloque o tubo de 1,5 ml em um misturador nutator. Remover o líquido com um pippetor e substituí-lo com o líquido fresco. </li><li> Remover o PBT. Lave em PBTB duas vezes por 30 minutos. </li><li> Remover o PBTB. Lave em PBTN duas vezes por 15 minutos. </li><li> Incubar em anticorpo primário diluído em PBTN à temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 º C durante a noite. </li><li> Enxágüe duas vezes com PBTB. Nota: a Solução de lavagem de adicionar e remover rapidamente. </li><li> Lavar duas vezes por 15 minutos em PBTB. </li><li> Lave em PBTN por 30 minutos. </li><li> Incubar em anticorpo secundário (anticorpo primário e conjugado se você estiver usando uma) diluído em PBTN. </li><li> Capa em papel alumínio e incubar por 1,5 horas em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe duas vezes com PBTB. </li><li> Lavar duas vezes durante 15 minutos com PBTB. </li><li> Proceder à montagem. </li></ol> Montagem Nota: Monte em glicerol se as amostras vão ser trabalhada imediatamente. Montagem em ouro Prolong se as amostras serão armazenadas antes de imagem (para mais de uma semana) ou se as amostras devem ser fotografada várias vezes. Para usar, coloque uma garrafa de prolongar em 65 º banho de água C por 2-3 minutos. Tomar uma alíquota de Prolong Ouro e manter-se em uma fonte de calor bloco de 45-50 º C. <ol><li> Despeje preps coradas em PBT em um vidro de relógio. </li><li> Ponha um pouco de glicerol em uma lâmina de vidro limpa para processamento. </li><li> Move os animais para o processamento de slides, escolhendo-os fora do vidro de relógio por um canto com a pinça. Garantir que eles estão lado cutícula para baixo. </li><li> Retire a cabeça ea cauda com uma lâmina de barbear fresco na lâmina de vidro de processamento. Um exacto faca com lâmina # 16 funciona bem para isso. </li><li> Em outro slide (montagem de slides), coloque uma pequena gota de glicerol / prolongar e espalhá-lo com uma pinça limpa. </li><li> Mover os animais dissecados para a montagem de carros por sua borda, tomando cuidado para não inverter-los. Tentar montá-los em linhas na mesma orientação. Monte 6-8 animais por slide. </li><li> Queda de um deslizamento de capa sobre colocando uma vantagem para o glicerol / Prolong e lentamente liberá-lo. </li><li> Seal o slide com esmalte de unha. [Nota Não imagem até que o verniz está seco. Isso normalmente leva 10 minutos. Para amostras montado em prolongar a ouro, deixe os slides secar por pelo menos três horas antes de selagem ou de imagem.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Imuno-histoquímica (IHQ) é vital para o estudo da biologia MNJ, pois permite a visualização do MNJ. Isto é conseguido usando anticorpos que reconhecem a membrana neuronal (por exemplo, HRP), o presynapse (por exemplo, CSP, SYT), e / ou o postsynapse (por exemplo, DLG). Moléculas sinalizadoras, proteínas estruturais, ou novas proteínas de interesse também pode ser manchada. Então, os genes podem ser mutado ou missexpressed e IHC pode detectar perturbação da estrutura sináptica e / ou de sinalização neuronal. <p class...

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscópio &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Misturador Nutator Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Faca de precisão nº 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas nº 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidesvanecimento ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila larval mnj imunohistoquímica

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

O<em&gt; Drosophila</em&gt; Junção neuromuscular (MNJ) é um sistema modelo estabelecido utilizada para o estudo do desenvolvimento e plasticidade sináptica. O uso generalizado do<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor do sistema é devido a sua alta acessibilidade. Ele pode ser analisado com uma única célula de resolução. Há 30 músculos por hemisegment cuja disposição dentro da parede do corpo periféricos são conhecidas. Um total de 31 neurônios motores atribuem a estes músculos em um padrão que tem alta fidelidade. Utilização da biologia molecular e genética, pode-se criar animais transgênicos ou mutantes. Então, pode-se estudar as conseqüências do desenvolvimento sobre a morfologia ea função do MNJ. Imuno-histoquímica pode ser usado para imagem claramente os componentes do MNJ. Neste artigo, vamos demonstrar como usar a coloração de anticorpos para visualizar a<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval MNJ.

Este protocolo demonstra como executar imunohistoquímica em dissecados larva Drosophila.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

A junção neuromuscular (JNM) da Drosophila é um sistema modelo estabelecido, utilizado para o estudo do desenvolvimento e da plasticidade sinápticas. O uso generalizado...

Este protocolo descreve como realizar coloração imunohistoquímica em larvas de gsof dissecadas para visualizar proteínas envolvidas no desenvolvimento de sinapses. Um tubo de 1,7 mil é utilizado durante todo o procedimento para a incubação dos anticorpos primário e secundário, bem como para as etapas de lavagem. Em seguida, as larvas são transferidas para uma lâmina de processamento, onde são aparadas com uma faca estilete, e os espécimes para visualização são movidos para uma gota de reagente antidesvanecimento.Em uma lâmina de montagem, uma lamínula é finalmente selada à lâmina com esmalte. Olá, sou Jonathan Brent do laboratório de Brian McCade, do Departamento de Fisiologia e Biofísica Celular da Faculdade de Médicos e Cirurgiões da Universidade Columbia. Utilizamos este procedimento para estudar a regulação genética da formação de sinapses na junção neuromuscular e no nódulo em desenvolvimento.Então vamos começar. Antes de realizar a imunohistoquímica na larva gsof n MJ, primeiro dissecar adequadamente as larvas. Para aprender este procedimento, assista ao artigo em vídeo acompanhante intitulado Dissecação da Larva de Drosophila n MJ.Para iniciar o procedimento, prepare três so

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Biologia

Drosophila larval Dissection MNJ

Este protocolo descreve um método confiável para anestesiados e de imagem de...

Na imagem in vivo de larvas Drosophila Intact no Sub-celular Resolução

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A arborização dendrítica de neurônios sensoriais...

Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

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Para compreender como as formas de células complexas, como dendritos neuronais, são alcançados durante o desenvolvimento, é importante ser capaz de precisão organização de microtúbulos ensaio. Aqui nós descrevemos um método imuno etiquetagem robusta para analisar a organização dos microtúbulos dos dendritos arborização dendrítica neurônio sensorial, traquéia, músculos e...

Labeling imuno dos microtúbulos no Dendrites neurônio sensorial, traquéias, e Músculos no Drosophila Wall Corpo Larva

A junção neuromuscular da Drosophila (NMJ) é usada como modelo para estudar a morfologia e a função das sinapses. Este vídeo descreve características importantes que os pesquisadores quantificam para caracterizar o NMJ. O protocolo de exemplo demonstra um software capaz de realizar a quantificação automaticamente.

drosófila Quantificação da Junção Neuromuscular (NMJ): Um Método para Avaliar a Morfologia e Função Sináptica

Este protocolo demonstra como Ensaio de Proximidade A ligadura pode ser utilizada para detectar em interacções proteína-proteína in situ na junção neuromuscular, de larvas de Drosophila. Com esta técnica, os discos grande e Hu-li Shao tai são apresentados para formar um complexo na região pós-sináptica, uma associação previamente identificado por meio de co-imunoprecipitação.

Detecção de In Situ Complexos proteína-proteína no Drosophila Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

Morfologia, tamanho e localização das organelas intracelulares são evolutivamente conservados e parecem afetar diretamente sua função. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos tornou-se um objetivo importante da biologia moderna. Aqui mostramos como esses estudos podem ser facilitados pela aplicação de técnicas quantitativas.

Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .

Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Aprenda imunohistoquímica em larvas de Drosophila para visualizar proteínas na junção neuromuscular. Este método permite estudar a regulação genética da formação sináptica em neurociência.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

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