Name: Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda imunohistoquímica em larvas de Drosophila para visualizar proteínas na junção neuromuscular. Este método permite estudar a regulação genética da formação sináptica em neurociência.

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Antes de começar a <ol><li> Prepare as seguintes soluções: PBT (0,1% Triton X100 em 1X PBS), PBTB (0,2% BSA em PBT), e PBTN (NGS 2% em PBTB). </li><li> Dissecar as larvas Drosophila. Consulte Drosophila larval Dissection MNJ. </li></ol> Imuno-histoquímica <ol><li> Mover as larvas a um tubo de 1,5 ml contendo PBT. Lavar as larvas duas vezes por 15 minutos no PBT. Nota: para lavar, coloque o tubo de 1,5 ml em um misturador nutator. Remover o líquido com um pippetor e substituí-lo com o líquido fresco. </li><li> Remover o PBT. Lave em PBTB duas vezes por 30 minutos. </li><li> Remover o PBTB. Lave em PBTN duas vezes por 15 minutos. </li><li> Incubar em anticorpo primário diluído em PBTN à temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 º C durante a noite. </li><li> Enxágüe duas vezes com PBTB. Nota: a Solução de lavagem de adicionar e remover rapidamente. </li><li> Lavar duas vezes por 15 minutos em PBTB. </li><li> Lave em PBTN por 30 minutos. </li><li> Incubar em anticorpo secundário (anticorpo primário e conjugado se você estiver usando uma) diluído em PBTN. </li><li> Capa em papel alumínio e incubar por 1,5 horas em temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe duas vezes com PBTB. </li><li> Lavar duas vezes durante 15 minutos com PBTB. </li><li> Proceder à montagem. </li></ol> Montagem Nota: Monte em glicerol se as amostras vão ser trabalhada imediatamente. Montagem em ouro Prolong se as amostras serão armazenadas antes de imagem (para mais de uma semana) ou se as amostras devem ser fotografada várias vezes. Para usar, coloque uma garrafa de prolongar em 65 º banho de água C por 2-3 minutos. Tomar uma alíquota de Prolong Ouro e manter-se em uma fonte de calor bloco de 45-50 º C. <ol><li> Despeje preps coradas em PBT em um vidro de relógio. </li><li> Ponha um pouco de glicerol em uma lâmina de vidro limpa para processamento. </li><li> Move os animais para o processamento de slides, escolhendo-os fora do vidro de relógio por um canto com a pinça. Garantir que eles estão lado cutícula para baixo. </li><li> Retire a cabeça ea cauda com uma lâmina de barbear fresco na lâmina de vidro de processamento. Um exacto faca com lâmina # 16 funciona bem para isso. </li><li> Em outro slide (montagem de slides), coloque uma pequena gota de glicerol / prolongar e espalhá-lo com uma pinça limpa. </li><li> Mover os animais dissecados para a montagem de carros por sua borda, tomando cuidado para não inverter-los. Tentar montá-los em linhas na mesma orientação. Monte 6-8 animais por slide. </li><li> Queda de um deslizamento de capa sobre colocando uma vantagem para o glicerol / Prolong e lentamente liberá-lo. </li><li> Seal o slide com esmalte de unha. [Nota Não imagem até que o verniz está seco. Isso normalmente leva 10 minutos. Para amostras montado em prolongar a ouro, deixe os slides secar por pelo menos três horas antes de selagem ou de imagem.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Imuno-histoquímica (IHQ) é vital para o estudo da biologia MNJ, pois permite a visualização do MNJ. Isto é conseguido usando anticorpos que reconhecem a membrana neuronal (por exemplo, HRP), o presynapse (por exemplo, CSP, SYT), e / ou o postsynapse (por exemplo, DLG). Moléculas sinalizadoras, proteínas estruturais, ou novas proteínas de interesse também pode ser manchada. Então, os genes podem ser mutado ou missexpressed e IHC pode detectar perturbação da estrutura sináptica e / ou de sinalização neuronal. <p class...

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscópio &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Misturador Nutator Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Faca de precisão nº 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas nº 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidesvanecimento ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila larval mnj imunohistoquímica

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

O<em&gt; Drosophila</em&gt; Junção neuromuscular (MNJ) é um sistema modelo estabelecido utilizada para o estudo do desenvolvimento e plasticidade sináptica. O uso generalizado do<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor do sistema é devido a sua alta acessibilidade. Ele pode ser analisado com uma única célula de resolução. Há 30 músculos por hemisegment cuja disposição dentro da parede do corpo periféricos são conhecidas. Um total de 31 neurônios motores atribuem a estes músculos em um padrão que tem alta fidelidade. Utilização da biologia molecular e genética, pode-se criar animais transgênicos ou mutantes. Então, pode-se estudar as conseqüências do desenvolvimento sobre a morfologia ea função do MNJ. Imuno-histoquímica pode ser usado para imagem claramente os componentes do MNJ. Neste artigo, vamos demonstrar como usar a coloração de anticorpos para visualizar a<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval MNJ.

Este protocolo demonstra como executar imunohistoquímica em dissecados larva Drosophila.

Drosophila larval MNJ Imunohistoquímica

A junção neuromuscular (JNM) da Drosophila é um sistema modelo estabelecido, utilizado para o estudo do desenvolvimento e da plasticidade sinápticas. O uso generalizado...

Este protocolo descreve como realizar coloração imunohistoquímica em larvas de gsof dissecadas para visualizar proteínas envolvidas no desenvolvimento de sinapses. Um tubo de 1,7 mil é utilizado durante todo o procedimento para a incubação dos anticorpos primário e secundário, bem como para as etapas de lavagem. Em seguida, as larvas são transferidas para uma lâmina de processamento, onde são aparadas com uma faca estilete, e os espécimes para visualização são movidos para uma gota de reagente antidesvanecimento.Em uma lâmina de montagem, uma lamínula é finalmente selada à lâmina com esmalte. Olá, sou Jonathan Brent do laboratório de Brian McCade, do Departamento de Fisiologia e Biofísica Celular da Faculdade de Médicos e Cirurgiões da Universidade Columbia. Utilizamos este procedimento para estudar a regulação genética da formação de sinapses na junção neuromuscular e no nódulo em desenvolvimento.Então vamos começar. Antes de realizar a imunohistoquímica na larva gsof n MJ, primeiro dissecar adequadamente as larvas. Para aprender este procedimento, assista ao artigo em vídeo acompanhante intitulado Dissecação da Larva de Drosophila n MJ.Para iniciar o procedimento, prepare três soluções frescas. Primeiro, prepare a Solução PBT adicionando detergente ao PBS recém-preparado. Em seguida, retire uma alíquota de albumina de soro bovino e adicione-a à solução PBT.Para preparar o PBTB terciário, pegue soro de cabra normal aquoso e adicione-o à solução PB TB para obter a solução PBTN. Após preparar essas soluções, transfira as larvas para um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de PBT. Esta é a primeira lavagem.Cada lavagem envolve a substituição da solução na qual as larvas estão imersas e, em seguida, a incubação das larvas em um agitador rotativo lento. Não transfira as larvas de tubo para tubo, pois isso poderá danificá-las. Esta primeira lavagem dura 15 minutos à temperatura ambiente.Após 15 minutos de mistura, substitua o PBT por PBT fresco usando uma pipeta e lave as larvas por mais 15 minutos. Ao trocar as soluções de lavagem, tenha sempre cuidado para não danificar as larvas. Quando as lavagens com PBT estiverem concluídas, lave as larvas em PBTB por 30 minutos.Repita esta lavagem com solução fresca por mais 30 minutos. Com o PBTB, a lavagem está completa. Lave duas vezes com PBTN por 15 minutos por lavagem.Durante o segundo passo de lavagem, o anticorpo primário pode ser diluído em PBTN na concentração de trabalho desejada. Após a lavagem, incubar as larvas nesta mistura de anticorpos por uma hora com mistura suave à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Quando a incubação estiver concluída, aspirar a solução de anticorpo primário e lavar rapidamente as larvas várias vezes com PBTB para remover qualquer anticorpo remanescente.Para preparar as larvas para a próxima incubação com anticorpo, lave-as uma vez em PBTB por 15 minutos e lave duas vezes com PBTN por 30 minutos. Dilua o anticorpo secundário em PBTN na concentração de trabalho desejada e incube as larvas nesta mistura por uma hora e meia. À temperatura ambiente, certifique-se de cobrir as larvas para evitar a exposição à luz e minimizar o desbotamento do corante fluorescente.Após uma hora e meia, remova a solução do anticorpo secundário e enxágue as larvas várias vezes adicionais em PBTB. Agora, lave as larvas em PBTV por 15 minutos, duas vezes. Todas as lavagens restantes e o armazenamento das larvas devem ser feitos com exposição mínima à luz, portanto, certifique-se de mantê-las cobertas.Transfira as larvas do tubo de 1,5 mL para PBT em uma lâmina de vidro para processamento. As larvas estão agora prontas para serem montadas; monte as larvas coradas na solução de gold prolongado a quente em banho-maria a 65 graus Celsius por dois a três minutos. Em seguida, pegue uma Eloqua e mantenha-a em um bloco de aquecimento regulado a 50 graus Celsius.Adicione um pouco de PB TB a uma lâmina de processamento. Transfira as larvas para o PB tb. Gire as larvas de modo que o lado do cutículo fique voltado para baixo, utilizando uma lâmina número 16, e corte as cabeças e as caudas das larvas.Você também pode usar uma lâmina de barbear nesta etapa. Agora, prepare a lâmina de montagem colocando em uma lâmina limpa 40 microlitros de prolongado ouro do alíquota aquecido e espalhe com pinças limpas. Usando pinças.Transfira cuidadosamente de seis a oito larvas preparadas da lâmina de processamento para a lâmina de montagem. Tente mantê-las na mesma orientação e com os lados da cutícula voltados para baixo para montar as larvas. Coloque uma lamínula sobre a solução prolongada.Posicione-o em uma borda na periferia da lâmina prolongada e deixe cuidadosamente escorregar a lamínula para cobrir as amostras. Sobre as bordas da lamínula, aplique seu esmalte grosso e barato na cor de sua preferência para selar à lâmina. Deixe a lâmina secar por um mínimo de três horas.Se as lâminas forem analisadas apenas uma vez e imediatamente após o preparo, a solução de ouro prolongada pode ser substituída por glicerol. Nesse caso, o tempo de secagem do esmalte e do glicerol é de apenas cerca de 10 minutos, em contraste com três horas em qualquer protocolo de coloração. O objetivo é obter um sinal específico alto combinado com baixo fundo.Isso é conseguido utilizando anticorpos de alta qualidade e realizando minuciosamente as etapas de bloqueio e lavagem. Essas imagens mostram sinapses do tipo selvagem, bem como aquelas de uma linhagem de mosca que expressa um receptor BMP tipo dois mutado, conhecido como wishful thinking ou mutante witch. A membrana neuronal é corada de azul com um anticorpo contra a peroxidase do rábano-picante.As vesículas sinápticas mostradas em vermelho são coradas com anticorpo anti-sináptico. A pós-sinapse mostrada em verde é corada com anticorpo contra discs large. Esses resultados mostraram que a mutação no receptor BMP tipo dois, wit, produz um fenótipo de subcrescimento sináptico.Esse mutante foi fundamental para estabelecer as BMPs como sinais retrógrados que regulam o número de botões terminais sinápticos. Acabamos de mostrar como realizar imunohistoquímica em uma junção neuromuscular larval do esôfago. Ao realizar este procedimento.É importante executar o procedimento com o tempo adequado para garantir a máxima reprodutibilidade e um fundo baixo. Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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