Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Para cortar axônios utilizando imagemagem de dois fótons in vivo, posicione embriões de peixe-zebra anestesiados dentro de uma gota de aros enquanto ela endurece em uma câmara especializada composta por uma lâmina de TEFL e lamínula. Uma lâmpada de vidro é colocada sobre a câmara, que então é virada de cabeça para baixo antes da exotomia. Faça uma imagem prévia do axônio que deseja cortar com zoom de 40x, aumentando para 70x na região que deseja exomizar.

E com o laser desligado, aumente a potência do laser. Ligue brevemente o laser. Na imagem residual do axônio, você verá detritos axonais dispersos se a exotomia for bem-sucedida.

Olá, sou Georgia O'Brien. Olá, sou Sandra Rigo. E eu sou Shauna Martin.

E somos do laboratório de Alvarez TI, do Departamento de Biologia Celular e Desenvolvimental Molecular da Universidade da Califórnia, Los Angeles. Hoje vamos mostrar um procedimento para exocitose de dois fótons e imagem confocal com lapso de tempo em embriões vivos de peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a degeneração e regeneração de axônios somatossensoriais periféricos.

Então vamos começar. Primeiramente, prepararemos uma solução de agarose a 1% de baixo ponto de fusão para inclusão. Dissolvemos a agarose em água destilada aquecendo-a em micro-ondas, antes de alíquotar em tubos pequenos e armazenar em um bloco de aquecimento a 42 graus Celsius.

Primeiros, os embriões podem ser colocados em uma solução de Ringer com 5% de PTU de 22 a 24 horas após a fertilização para inibir a formação de pigmento, que é fortemente autofluorescente e obscurecerá os axônios no microscópio de dois fótons. Em seguida, selecionamos os embriões para imagem e removemos suas coroanas puxando-as suavemente com pinça. Uma vez selecionados os embriões, eles são anestesiados adicionando cerca de 0,02% de trica ao Ringer com PTU.

Antes de prosseguir, certifique-se de que os animais não respondem ao toque. Prepare a câmara de imagem de longo prazo aplicando graxa de vácuo em um lado de um anel de vidro ou teflon e fixando-o em uma lamínula de vidro. Tendo o cuidado de não transferir muito do ringer PTU.

Transfira um embrião para a solução de agro a 42 graus usando uma pipeta de vidro. Em seguida, transfira o embrião com uma gota de agros para uma lamínula preparada. Após a transferência, posicione o embrião conforme desejado enquanto o agros endurece.

Leve em consideração que a câmara de imagem será virada ao final, de modo que a lâmina de cobre fique na superfície superior. Se você tiver uma platina motorizada e puder imaginar múltiplos locais simultaneamente, repita esses passos para cada embrião. Deixe as rosas de agro se solidificarem completamente.

Em seguida, preencha o anel com Ringer de PTU tri canino 0,02%. Por fim, aplique graxa de vácuo no outro lado dos anéis. Em seguida, cubra-os com um vidro de proteção.

Coloque as câmaras de selagem de cabeça para baixo. Agora estamos prontos para a imagem de exotomia de dois quatro toneladas. Para se preparar para a imagem, coloque os embriões montados em um porta-lâminas sob o microscópio.

Foque um embrião com uma objetiva de água de abertura numérica 40x 0,8. Em seguida, ligue o laser. Ajuste o laser para um comprimento de onda de 910 nanômetros e uma potência de 30 miliwatts.

Abra o software de imagem. Utilizamos o software Scan Image desenvolvido no laboratório de Boar para corais. Com esta potência, pode-se escanear o campo em busca de um axônio candidato que será seccionado.

Uma vez encontrado, capture uma imagem do axônio alvo. Marque as posições Z inicial e final, adquira a imagem e faça uma projeção máxima das pilhas Z. Em seguida, aumente o zoom em 70x no ramo do axônio que deseja examinar detalhadamente.

Aumente a potência para 180 miliwatts e defina o número de fatias Z como uma. Inicie uma única varredura com o laser pressionando "grab". Isso deve ser suficiente para seccionar o axônio, entretanto é necessário otimizar este procedimento para o seu microscópio e objetivo experimental.

Por fim, diminua o zoom. Reduza a potência para 30 miliwatts e capture uma imagem do nosso axônio recém-seccionado. Se um microscópio de dois fótons personalizado não estiver disponível no seu laboratório, o microscópio confocal de dois fótons Zeiss LSM 510 também pode ser utilizado para seccionar axônios.

Começamos colocando o embrião montado sobre a platina e focalizando-o com um objetivo de água de 25 x. Em seguida, ligue os lasers de dois fótons e de argônio em uma configuração multi-rastreamento, de modo que seja possível alternar de um para o outro. Embora ambos os lasers sejam usados para detectar GFP, a emissão de dois fótons é visualizada em vermelho e a emissão do laser de argônio em verde.

Para diferenciar os dois, utilize o laser Argonne para identificar um axônio que resista sob as configurações Z. Marque as primeiras e últimas seções ópticas. Adquira uma imagem confocal e crie uma projeção máxima do Zack.

Desligue o laser de argônio e ligue a varredura do laser de dois fótons com uma intensidade de aproximadamente 9% de transmissão. Para garantir que o axônio ainda esteja em foco, clique no botão de parada para que a ferramenta de recorte fique disponível. Use o recorte para ampliar a área de interesse.

Normalmente, aumentamos o zoom para cerca de 70 x. Escolha a região do axônio a ser lesionada e coloque essa região em foco. O zoom pode ser verificado na guia modo.

Em seguida, na guia canais, altere a intensidade do dois fótons de cerca de 9% de transmissão para 15 a 30% de transmissão. Para ativar as novas configurações, clique no botão XY rápido e, em seguida, clique em parar logo em seguida. Para evitar danos excessivos, o axônio deve aparecer como detritos dispersos se o procedimento funcionou.

Por fim, para garantir que o axônio foi realmente danificado, volte para o laser de argônio de 488 nanômetros. Faça outra imagem confocal e crie uma projeção máxima dos Zacks. Agora que mostramos a você duas maneiras de seccionar axônios usando microscopia a laser de dois fótons, vamos analisar a imagem confocal em lapso de tempo da regeneração utilizando o zes LSM cinco 10.

Para preparar a imagem de lapso de tempo, certifique-se de ligar o palco aquecido pelo menos 30 minutos antes de configurar o filme de lapso de tempo. Coloque os embriões montados em um suporte de lâmina sob o microscópio. Foque em um embrião com o objetivo de ar desejado.

Utilizamos um objetivo com abertura numérica de 20 x 0,5, abrimos o software de imagem Zeiss LSM five 10 e, em seguida, ligamos os lasers apropriados e configuramos a configuração desejada. Abra a janela de varredura e as janelas de múltiplos tempos. Se você tiver o software de múltiplos tempos, defina a posição e a configuração do seu primeiro embrião na janela de múltiplos tempos.

Ative a varredura rápida na janela de varredura, depois mova o estágio para a posição XY desejada. Marque a primeira e a última posições Z na janela de varredura. Pressione parar e depois meio também na janela de varredura, aguarde a conclusão da varredura da fatia Z intermediária.

Em seguida, pressione marcar posição na janela do estágio. Se você estiver imageando apenas um embrião, clique na aba de localização única na janela de múltiplos tempos. Clique em substituir X, y, Z. Em seguida, clique em salvar configuração.

Concorde quando solicitado a substituir a configuração anterior. Agora você pode definir os parâmetros para a aquisição de imagens na janela multi lo. Se você tiver uma platina mecanizada, poderá configurar múltiplos locais para imagens de múltiplos embriões.

Neste caso, você deve selecionar a aba de múltiplos locais antes de definir os valores de X, Y, Z e a configuração para o seu primeiro local. Além disso, certifique-se de que o menu suspenso logo abaixo da aba de múltiplos locais esteja em localização um e que o menu suspenso na seção de configuração indique multi lo um. Antes de clicar em salvar configuração, defina a posição e a configuração dos embriões restantes na janela multi-tempo.

Localize seu próximo embrião com uma varredura rápida, depois mova a platina para a posição XY desejada e marque suas primeiras e últimas posições Z na janela de varredura. Pressione parar. Em seguida, também na janela de varredura, aguarde a conclusão da varredura da fatia Z intermediária.

Em seguida, pressione marcar posição. Na janela de estágio, clique em substituir X, Y, Z. Verifique se o menu suspenso logo abaixo da aba de múltiplos locais está em localização dois e se o menu suspenso na seção de configuração indica multi lobo dois. Em seguida, clique em salvar configuração. Concordar. Quando solicitado a sobrescrever a configuração anterior, repita este processo para os embriões restantes.

Configure os parâmetros para a aquisição de imagens na janela multi lo. Escolha a opção GR GL na lista de seções de bloco. Em seguida, insira o número desejado de repetições de grupo.

Este é o número de vezes que o microscópio confocal adquirirá uma imagem em cada localização. Insira o intervalo de tempo desejado na seção de parâmetros. Este é o período de tempo entre o início de uma repetição de aquisição de imagem e o início da próxima.

Selecione Zack XY na seção de configuração. Insira o nome base do arquivo na seção inferior. Clique em selecionar banco de dados de imagens e escolha o seu banco de dados.

Clique no botão de opções, depois selecione sua pasta MDB para salvar também os arquivos temporários. Marque a opção manter imagem final aberta. Salve a imagem final, no centro do Zack, e selecione o intervalo de peso.

Clique em OK para fechar a janela de opções, depois clique em tempo inicial. Mantenha a janela de múltiplos tempos aberta durante todo o período de aquisição de imagens. Agora é hora de analisar seus dados.

Quando a imagem em intervalos de tempo for concluída, o software multitemporal compilará todos os seus arquivos temporários em um arquivo resumo para cada localização. Se desejar interromper o vídeo antes de sua conclusão, certifique-se de pressionar finalizar em vez de parar, para que um arquivo resumo seja criado.

Os arquivos temporários e arquivos de resumo devem ser salvos automaticamente na pasta MDB designada. A seguir, há um exemplo representativo de um filme confocal com lapso de tempo após exotomia às 54 horas pós-fertilização. O primeiro quadro mostra uma vista dorsal do axônio antes da exotomia, com uma seta amarela apontando para o local da exotomia no momento seguinte.

O filme com intervalo começa dentro de uma hora após a exotomia e dura 12 horas. Uma pilha confocal foi coletada a cada 20 minutos. Este filme confocal com intervalo é gravado usando os mesmos parâmetros às 78 horas pós-fertilização.

O primeiro quadro mostra uma vista lateral do axônio antes da exsodomia, com uma seta amarela apontando para o local da exsodomia. Acabamos de mostrar como gerar danos teciduais precisos e visualizar embriões de peixe-zebra vivos utilizando sodomia de dois fótons e imagem confocal com lapso de tempo. Ao realizar este procedimento, é importante otimizar a quantidade de potência utilizada para a exsodomia a laser de dois fótons, a fim de evitar danos excessivos.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com o seu Experimento.