Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Para cortar axônios usando In vivo dois fótons de imagem de imagem de fótons anestesiados embriões de peixe-zebra dentro de uma gota de aros à medida que endurece em uma câmara especializada que consiste em uma lavagem TEFL e lamínula. Uma luz de vidro é colocada no topo da câmara, que é então virada de cabeça para baixo antes da exotomia. Tire uma imagem anterior do axônio que deseja cortar com zoom de 40 x em 70 x na região que deseja exomitar.

E com o laser desligado, aumente a potência do laser. Ligue brevemente o laser. Na imagem posterior do axônio, você verá detritos axonais espalhados se a exotomia for bem-sucedida.

Olá, sou Georgia O'Brien. Olá, sou Sandra Rigo. E eu sou Shauna Martin.

E nós somos do laboratório de Alvarez TI no Departamento de Células Moleculares e biologia do desenvolvimento da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Hoje mostraremos um procedimento para dois fótons ex e imagem confocal de lapso de tempo em embriões vivos de peixe-zebra. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a degeneração e regeneração de axônios somatossensoriais periféricos.

Então vamos começar. Para começar, prepararemos uma solução agro de baixo ponto de fusão a 1% para incorporação. Dissolvemos os agros em água distal dupla aquecendo no micro-ondas antes de Alec regar em pequenos tubos e armazenar em um bloco de aquecimento a 42 graus Celsius.

Os primeiros embriões podem ser colocados em uma solução de ringer de 5% PTU 22 a 24 horas após a fertilização para inibir a formação de pigmento, que é brilhante, autofluorescente e obscurecerá os axônios no microscópio de dois fótons. Em seguida, selecionamos embriões para imagem e removemos seu choon separando-os suavemente com uma pinça. Uma vez que os embriões são selecionados, eles são anestesiados adicionando cerca de 0,02% trica aos toques de PTU.

Antes de prosseguir, certifique-se de que os animais não respondam ao toque. Prepare a câmara de imagem de longo prazo aplicando graxa a vácuo em um lado de um anel de vidro ou Teflon e fixando-o em uma lamínula de vidro. Tomando cuidado para não transferir muito dos toques da PTU.

Transfira um embrião para a solução agrícola de 42 graus com uma pipeta de vidro. Em seguida, transfira o embrião com uma gota de agros para uma lamínula preparada. Uma vez transferido, posicione o embrião conforme desejado enquanto o agros endurece.

Lembre-se de que a câmara de imagem será invertida quando você terminar, de modo que o deslizamento de cobre seja a superfície superior. Se você tiver um estágio motorizado e puder obter imagens de vários locais ao mesmo tempo, repita essas etapas para cada embrião. Deixe as rosas agrícolas solidificarem completamente.

Em seguida, encha o anel com toques de PTU caninos de 0,02%. Por fim, aplique graxa a vácuo no outro lado dos anéis. Em seguida, cubra-os com uma luz de vidro.

Vire as câmaras de vedação. Agora estamos prontos para duas imagens exo tomy de quatro toneladas. Para se preparar para a imagem, coloque os embriões montados em um suporte de lâminas sob o microscópio.

Concentre-se em um embrião com uma objetiva de água de abertura numérica de 40 x 0,8. Em seguida, ligue o laser. Defina o laser para um comprimento de onda de 910 nanômetros e uma potência de 30 miliwatts.

Abra o software de imagem. Utilizamos software de varredura de imagens desenvolvido em corais para o Laboratório de Javali. Com essa potência, pode-se escanear o campo em busca de um axônio candidato que será cortado.

Uma vez encontrado, tire uma imagem do axônio alvo. Marque a primeira e a última posição Z, adquira a imagem e faça uma projeção máxima das pilhas Z. Em seguida, aumente o zoom 70 x no ramo do axônio que você deseja exitemizar.

Aumente a potência para 180 miliwatts e defina o número de fatias Z para um. Inicie uma única varredura com um laser pressionando agarrar. Isso deve ser suficiente para cortar o axônio, no entanto, é necessário otimizar esse procedimento para seu microscópio e objetivo experimental.

Por fim, diminua o zoom. Reduza a potência para 30 miliwatts e tire uma imagem do nosso axônio recém-cortado. Se um escopo de dois fótons personalizado não estiver disponível em seu laboratório, o microscópio confocal de dois fótons Zes five 10 também pode ser usado para cortar axônios.

Começamos colocando o embrião montado no palco e colocando-o em foco usando uma objetiva de 25 x água. Em seguida, ligue os dois fótons nos lasers Argonne em uma configuração de várias faixas para que seja possível alternar de um para o outro. Embora ambos os lasers sejam usados para detectar GFP, a emissão de dois fótons é visualizada com vermelho e a emissão de laser argonne com verde.

Para diferenciar os dois, use o laser de Argonne para identificar um axônio a ser suportado nas configurações Z. Marque a primeira e a última seções ópticas. Tire uma imagem confocal e crie uma projeção máxima do Zack.

Desligue o laser de argônio e ligue a varredura do laser de dois fótons a uma intensidade de cerca de 9% de transmissão. Para garantir que o axônio ainda esteja em foco, clique no botão Parar para que a ferramenta de corte esteja disponível. Use o corte para ampliar a área de interesse.

Normalmente, ampliamos para cerca de 70 x. Escolha a região do axônio a ser lesionada e coloque essa região em foco. O zoom pode ser verificado na guia de modo.

Em seguida, na guia canais, altere a intensidade dos dois fótons de cerca de 9% de transmissão para 15 a 30% de transmissão. Para ativar as novas configurações, clique no botão XY rápido e, em seguida, clique em parar rapidamente depois. Para evitar danos excessivos, o axônio deve ser visto como detritos espalhados se o procedimento funcionar.

Finalmente, para garantir que o axônio foi realmente danificado, volte para o laser de argônio de 4 88 nanômetros. Pegue outra imagem confocal e crie uma projeção máxima dos Zacks. Agora que mostramos duas maneiras de cortar axônios usando microscopia a laser de dois fótons, veremos a imagem confocal TimeLapse de regeneração usando o zes LSM five 10.

Para preparar imagens temporizadas, certifique-se de que liga o palco aquecido pelo menos 30 minutos antes de configurar o filme time-lapse. Coloque os embriões montados em um suporte de lâminas sob o microscópio. Concentre-se em um embrião com a objetiva de ar desejada.

Usamos uma objetiva de abertura numérica de 20 x 0,5, abrimos o software de imagem Zeiss LSM five 10 e, em seguida, ligamos os lasers apropriados e definimos a configuração desejada. Abra o estágio de digitalização e as janelas de vários horários. Se você tiver um software multitempo, defina a posição e a configuração do seu primeiro embrião na janela multitempo.

Ative a varredura rápida na janela de varredura e mova o palco para a posição XY desejada. Marque a primeira e a última posição Z na janela de digitalização. Pressione parar e depois no meio também na janela de digitalização, aguarde a conclusão da varredura da fatia Z do meio.

Em seguida, pressione marcar posição na janela do palco. Se você estiver visualizando apenas um embrião, clique na guia de localização única na janela de vários tempos. Clique em substituir X, y, Z.Em seguida, clique em salvar configuração.

Concorde quando solicitado a substituir a configuração anterior. Agora você pode configurar os parâmetros para aquisição de imagem na janela multi lo. Se você tiver um estágio mecanizado, poderá configurar vários locais para obter imagens de vários embriões.

Nesse caso, você deve selecionar a guia de vários locais antes de definir o X, Y, Z e a configuração para seu primeiro local. Além disso, certifique-se de que o menu suspenso logo abaixo da guia de vários locais esteja no local um e que o menu suspenso na seção de configuração diga multi lo one. Antes de clicar em salvar configuração, defina a posição e a configuração de seus embriões restantes na janela de vários tempos.

Localize seu próximo embrião, pressione a varredura rápida, mova o estágio para a posição XY desejada e marque sua primeira e última posições Z na janela de varredura. Pressione parar. Em seguida, também no meio da janela de digitalização, aguarde a conclusão da varredura da fatia Z do meio.

Em seguida, pressione a posição da marca Na janela do palco, clique em substituir X, Y, Z.Verifique se o menu suspenso logo abaixo da guia de vários locais está no local dois e se o menu suspenso na seção de configuração diz vários lóbulos dois. Em seguida, clique em salvar configuração. Concordar. Quando solicitado a substituir a configuração anterior, repita esse processo para os embriões restantes.

Configure os parâmetros para aquisição de imagem na janela multi lo. Escolha a opção GR GL na lista de seção de blocos. Em seguida, insira o número desejado de repetições em grupo.

Este é o número de vezes que o confocal adquirirá uma imagem em cada local. Insira o intervalo de peso desejado na seção de parâmetros. Esta é a quantidade de tempo desde o início de uma repetição de imagem até o início da próxima.

Selecione Zack XY na seção de configuração. Digite o nome do arquivo base na seção inferior. Clique em selecionar banco de dados de imagem e escolha seu banco de dados.

Clique no botão de opções e selecione sua pasta MDB para salvar arquivos temporários também. Marque manter a imagem final aberta. Salve a imagem final, no meio do Zack e selecione o intervalo de peso.

Clique em OK para fechar a janela de opções e, em seguida, clique em Hora de início. Deixe a janela de vários tempos aberta durante a geração de imagens. Agora é hora de analisar seus dados.

Quando a imagem de lapso de tempo terminar. O software multi-time compilará todos os seus arquivos temporários em um arquivo de resumo para cada local. Se você quiser parar o filme antes que ele seja concluído, certifique-se de pressionar concluir em vez de parar para que um arquivo de resumo seja criado.

Os arquivos temporários e os arquivos de resumo devem ser salvos automaticamente na pasta MDB designada. Aqui está um exemplo representativo de um filme confocal de lapso de tempo após a exotomia 54 horas após a fertilização. O primeiro quadro mostra uma visão dorsal do axônio antes da exotomia com uma seta amarela apontando para o local da exotomia na próxima vez.

O filme de lapso começa dentro de uma hora após a extomia e dura 12 horas. Uma pilha confocal foi coletada a cada 20 minutos. Este filme confocal de lapso é gravado usando os mesmos parâmetros 78 horas após a fertilização.

O primeiro quadro mostra uma visão lateral do axônio antes da ex-com uma seta amarela apontando para o local da ex-. Acabamos de mostrar como gerar danos precisos aos tecidos e visualizar embriões vivos de peixe-zebra usando de dois fótons e imagens confocais de lapso de tempo. Ao fazer este procedimento, é importante otimizar a quantidade de energia usada para dois fótons

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.