Name: Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprenda a realizar mutagênese dirigida a sítio em plasmídeos inteiros de forma simples e econômica. Este método utiliza enzimas padrão e primers mutagênicos para introduzir substituições de bases com eficiência.

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Princípio do método: O site dirigido mutagênese de plasmídeos toda explicada neste vídeo é um método de mutagênese que permite que você alterar um gene alvo clonado pela exclusão, substituição ou inserção de algumas bases diretamente em um plasmídeo. Ele funciona, amplificando o plasmídeo inteiro, em uma reação termociclagem não baseados em PCR. Durante a reação primers mutagênico, carregando a mutação desejada na forma de incompatibilidades para o plasmídeo original, estão integrados no plasmídeo recém-sintetizada. Após a remoção do plasmídeo original a partir da reação do plasmídeo mutante se transforma em E. coli. Os passos seguintes são para fins de triagem somente, porque a eficiência de mutação deste método não é 100%. O processo todo leva três dias, mas a parte principal pode ser feito dentro de um dia. 1,0 O primeiro dia: 1,1 termociclagem reação: Original Plasmid: Este site dirigido mutagênese protocolo funciona melhor com plasmídeos de até 10kb. Plasmids maiores são um pouco difícil de sofrer mutações com este método e pode levar um pouco de paciência e ajuste das condições de termociclagem e / ou células competentes. Além disso, o plasmídeo que você trabalha com deve ser isolado de uma represa + cepa de bactérias. Para a reação termociclagem você vai precisar 10-60 ngs do plasmídeo você quer se transformar. Primers: Antes de você pode configurar a sua reação termociclagem você tem que ter o seu primers na mão. Você precisa de cerca de 150 ng de cada cartilha mutagênico. É ok se você tirar 1,5 mL de uma ação diluída 1:10 pm 100. Existem algumas orientações simples que você deve considerar ao projetar seu primers mutagénicos: <ul><li> Os primers devem ser complementares um ao outro </li><li> Os primers devem ter entre 25 e 45 nucleotídeos de comprimento </li><li> As mutações na forma de incompatibilidades para o plasmídeo original deve ser contido em ambos os primers </li><li> As incompatibilidades devem ser centrados na cartilha e ladeado por pelo menos 8 nucleotídeos em cada lado </li><li> Os primers devem ter um GC Conteúdo de pelo menos 40% </li><li> Os primers deve terminar 5 principais e 3 privilegiada, com um ou mais Gs ou Cs </li><li> Os primers não precisa ser fosforilada, nem têm de ser purificados FPLC ou PAGE, apenas devem ser dessalinizada. </li><li> Para o cálculo da Tm você não precisa de nenhuma fórmula, mas Tm no certificado de transporte deve ser superior a 60 ° C. </li><li> Para fins de triagem é prático para inserir ou excluir um sítio de restrição com o seu mutação. Por causa da degeneração do código genético há muitas possibilidades para inserir um sítio de restrição com a sua mutação desejada. O site do New England Biolabs fornece uma ferramenta para encontrar tal um sítio de restrição apropriada. Basta digitar a seqüência de cartilha de codificação para a seqüência de aminoácidos que você deseja, utilizando o código ambigüidade de DNA. A ferramenta de localização da enzima irá dizer-lhe que sítios de restrição pode ser introduzido em paralelo à sua mutação desejada. Se você não consegue encontrar nenhum sítio de restrição possível ou prático desta forma, você pode inserir qualquer sítio de restrição novo sem se preocupar o código genético no local da mutação. A partir daí você pode usar este plasmídeo como modelo para uma série de mutações em que este sítio de restrição será eliminado através da inserção do novo primers mutagênico. Esta abordagem pode ser muito conveniente se você estiver planejando fazer uma série de mutações no mesmo local do plasmídeo. </li></ul> DNA polimerase: Para este método você precisa de uma termoestável DNA polimerase, que exibe 3&#39;-5 &#39;atividade de exonuclease e cria termina sem corte. Usamos sempre recombinante Pfu Polimerase a partir Fermentas. Se você tem problemas com as etapas de amplificação, você pode tentar uma polimerase de maior qualidade, mas para a maioria dos propósitos do Pfu padrão será suficiente. Completar a reação com dNTPs tampão da polimerase e água. 1.2 Condições de termociclagem O termociclador deve ser criado da seguinte maneira. A fase de desnaturação inicial e recorrente é definida como 30 seg a 95 ° C. A temperatura de anelamento dos primers não devem ser calculados com fórmulas complicadas. Costumamos definir a temperatura de anelamento a 55 ° C eo tempo de recozimento para um minuto. Para primers de 25 a 30 nucleotídeos que você estará usando em sua maioria, isso funciona para nós 95% do tempo. De qualquer forma se isso não deve funcionar, simplesmente tente variar a temperatura de tratamento térmico entre 50 - e 60 ° C. A temperatura alongamento depende da polimerase que você usa. Nesta demonstração usamos o Pfu Polimerase a partir Fermentas, que apela a uma temperatura de alongamento de 72 ° C. O tempo de alongamento varia de acordo com o tamanho do plasmídeo. Nós sempre calcular 1 min por kb, e adicionar um minuto extra para quetempo. Por exemplo, para um plasmídeo 9kb nós escolheríamos 10min como tempo de alongamento. 18 ciclos são suficientes para criar o suficiente mutante plasmídeo para o uso posterior. Manter o número de ciclos de baixa, também poupa tempo. <img src="/files/ftp_upload/1135/figure1.png" alt="Figura 1" width="600" height="287" /> 1,3 Gelcheck após reação termociclagem A amplificação bem-sucedido deve ser verificado através da realização de uma electroforese. Diretamente após o ciclo terminar, coloque 5 mL da reação em um gel de agarose 1% TAE. Se a amplificação foi bem-sucedido, você deve ver uma banda distinta. No entanto, se o DNA recém sintetizado não é claramente visível no gel, você pode tentar precipitar a reação de todo e usá-lo para a transformação na próxima etapa. Para nós, isso raramente funcionou, mas vale a pena dar uma tentativa. A melhor coisa a fazer se a reação não funciona é para ajustar a temperatura de recozimento. 1,4 digestão DpnI: Antes da transformação do plasmídeo original, que serviu como um modelo deve ser removido da reação para impedir de fundo forte. Isto é feito por digestão com restrição DpnI. Este endonuclease de restrição corta somente metilado plasmídeo. Seu reconhecimento e sítio de restrição é o GATC seqüência ao passo que A tem de ser metilado. Quando digerir com DpnI apenas o plasmídeo originais não mutada que foi isolado de uma represa + tensão é cortada, o plasmídeo recém-sintetizado mutante que não é metilado não é afetado por DpnI. Basta adicionar 1-2 mL de DpnI à reação e incubar pelo menos uma hora a 37 °. Ao usar o Fast digerir DpnI o tempo de incubação pode ser reduzida para cerca de 15 minutos. A qualidade de sua DpnI eo tempo de incubação desta digestão restrição muito forte determina como o seu fundo com plasmídeo não mutada será. 1,5 Transformação: Após a digestão do plasmídeo DpnI está pronto para transformação em E. competente células coli. Basta adicionar 5 mL da reação de digestão DpnI nas células competentes e realizar a transformação, como recomendado no seu laboratório. No nosso caso, usamos o procedimento de choque térmico, incubando a mistura de bactérias plasmídeo em gelo por 30 min e depois de choque térmico é a 42 ° C por 90 seg. Após a adição de 200 mL SOC-solução, as bactérias são incubadas, vigorosa agitação, a 37 ° C por 1 h. Após uma hora as bactérias são semeadas em agar a seleção da mídia. 2,0 segundo dia 2,1 Triagem de clones parte 1: Seleção de clones Porque a eficiência de mutação não é 100% você precisa de tela para o seu mutantes. Fazemos isso por digestão de restrição em que nós verificamos a presença ou ausência do sítio de restrição que nós adicionados ou excluídos por meio da integração primer. Para isso, geralmente pegar oito colônias e cultivá-las durante a noite para a preparação de plasmídeo, no dia seguinte. 3,0 Dia três 3,1 Triagem de clones parte 2: Restrição de digestão com a enzima marcador No terceiro dia você executar um Mini Prep e digestão subsequente restrição da enzima com seu marcador. No gel, em seguida, você pode ver que um de seus clones carregam a mutação desejada e que não aquelas. O método de rastreamento usando a digestão restrição funciona muito bem. No entanto, você deve confirmar a sua mutação bem sucedida por seqüenciamento.

<ol><li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuikChange+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">QuikChange site-directed mutagenesis.</a> Strategies. 9, 3-4 (1996).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Mutagênese dirigida local é um método de mutagênese, que fornece uma maneira rápida de mutação de um gene transportado por um plasmídeo. A reação geral pode ser feito em apenas um dia. Com este método, ele vai precisar de apenas um par de primers complementares levando a mutações desejadas e uma revisão da polimerase como Pfu Polimerase. O plasmídeo recém-sintetizado pode ser separado do plasmídeo parental por digerir a reação com o DpnI enzima de restrição. Esta enzima digere apenas o DNA metilado. Portanto, apenas o p...

<table><tbody><tr><td>Polimerase Pfu (recombinante ou nativa)</td><td>Fermentas</td><td>EP0571 ou EP0501</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de dNTPs 10 mM</td><td>Fermentas</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DpnI ou DpnI Fast digest</td><td>Fermentas</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>primers</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>dessalinizados</td></tr></tbody></table>

mutagênese do site caseiros direção de plasmids whole

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagênese dirigida local de plasmídeos todo é uma maneira simples de criar variações ligeiramente diferentes de um plasmídeo original. Com este método, o gene-alvo clonados podem ser alterados pela exclusão, substituição ou inserção de algumas bases diretamente em um plasmídeo. Ela funciona por simplesmente ampliar o plasmídeo inteiro, em uma reação termociclagem não baseados em PCR. Durante a reação primers mutagênico, carregando a mutação desejada, são integrados no plasmídeo recém-sintetizada. Neste vídeo tutorial vamos demonstrar uma maneira fácil e de custo eficaz para introduzir substituições de base em um plasmídeo. O protocolo trabalha com reagentes de referência e é independente de kits comerciais, que muitas vezes são muito caros. Aplicando este protocolo pode reduzir o custo total de uma reação a um oitavo do que custa o uso de alguns dos kits comerciais. Neste vídeo também comentar sobre as etapas críticas durante o processo e dar instruções detalhadas sobre como desenhar os iniciadores mutagênicos.

Mutagênese dirigida local de plasmídeos todo é uma maneira simples de criar variações ligeiramente diferentes de um plasmídeo original. Aqui nós demonstramos uma forma fácil e de custo eficaz para introduzir substituições de base em um plasmídeo reagentes padrão usando.

Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

A mutagênese dirigida de plasmídeos completos é uma maneira simples de criar variações ligeiramente diferentes de um plasmídeo original. Com este método, o plasmídeo clonado...

Olá. Meu nome é Mark Blo. Sou estudante de pós-graduação em biologia na Universidade de Mines, na Alemanha. Hoje, meu amigo Kajo e eu gostaríamos de mostrar a você como realizar uma neurogênese direcionada caseira.O método foi originalmente desenvolvido por Ethal e adaptado por muitos outros. Assim, quando você procurar na internet hoje, encontrará diversas protocolos diferentes que variam em alguns pontos mais ou menos significativos. Hoje, gostaríamos de mostrar a vocês uma maneira simples e economicamente eficiente que funciona bem para nós.Então vamos começar. Para este experimento, você precisa de uma DNA polimerase termoestável com atividade de correção de provas. Sempre usamos a polimerase PFU da Fermentas. Logicamente.Você também precisa do tampão da polimerase, mistura de dNTPs e água. Além disso, são necessários a enzima de restrição DpnI, células competentes de E. coli, uma placa de ágar, caldo de cultura bacteriana e uma série de palitos. A parte mais essencial e crítica deste método é o planejamento dos iniciadores mutagênicos.Existem algumas diretrizes simples que você deve considerar ao projetar seu par de primers. Os primers devem ser complementares entre si e ter e

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

Fonte: Tomás, J. M., et al. Geração de mutantes nulos para elucidar o papel das glicosiltransferases bacterianas na motilidade bacteriana. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra a amplificação dependente do iniciador de um plasmídeo suicida em E. coli. O plasmídeo, que carrega um gene de resistência a antibióticos, se replica apenas na presença de uma proteína iniciadora codificada pelo hospedeiro. Após eletroporação e incubação em meio de recuperação, a mistura é semeada em ágar contendo...

Amplificação de um plasmídeo suicida em um hospedeiro bacteriano

Fonte: Lea-Smith, D. J., et al. Geração de mutantes marcados e sem marcadores em espécies de cianobactérias modelo. J. Vis. Exp. (2016)O vídeo demonstra um método para gerar mutantes marcados com antibióticos em cianobactérias. O protocolo começa com a cultura de cianobactérias, seguida pelas etapas de centrifugação e lavagem que preservam os pili da superfície. Um plasmídeo carregando um gene de resistência a antibióticos flanqueado por sequências homólogas é então introduzido. Durante a...

Geração de mutantes marcados com antibióticos em cianobactérias por meio de recombinação homóloga

Nós apresentamos um protocolo para a avaliação funcional de bibliotecas de um único site saturação mutagênese abrangentes de proteínas utilizando sequenciamento de alto rendimento. É importante ressaltar que essa abordagem usa pares de primers ortogonais multiplex construção da biblioteca e sequenciamento. Os resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamase seleccionado a uma dosagem clinicamente relevante de ampicilina são fornecidos.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Expansão do código genético serve como uma ferramenta poderosa para estudar uma grande variedade de processos biológicos, incluindo acetilação de proteínas. Aqui vamos demonstrar um protocolo fácil de explorar esta técnica para gerar homogeneamente acetilado proteínas em locais específicos em células de Escherichia coli .

Um protocolo Facile para gerar proteínas Site-Specifically acetiladas em Escherichia Coli

Este artigo descreve uma metodologia detalhada para o mutagenesis aleatório de um gene alvo no fermento de fissão. Como exemplo, temos como alvo rpt4 +, que codifica uma subunidade do proteossomo 19S e tela para as mutações que desestabilizam a heterocromatina.

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no Ácido desoxirribonucleico (DNA). Este protocolo descreve como fazer o mutagenesis local-dirigido com um 2-passo e passo 3-cadeia da polimerase (PCR) com base em abordagem, que é aplicável a qualquer fragmento de DNA de interesse.

Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

Endonucleases de restrição com nova especificidade de seqüência podem ser desenvolvidas a partir de enzimas que reconhecem uma seqüência parcialmente degenerada. Aqui fornecemos um protocolo detalhado que usamos com sucesso para alterar a especificidade da seqüência da enzima NlaIV. Os ingredientes-chave do protocolo são a compartimentação in vitro da reação de transcrição/tradução e a seleção de variantes com novas especificidades de seqüência.

In Vitro Evolução dirigida de uma endonuclease de restrição com especificidade mais rigorosa

O presente protocolo descreve novas ferramentas para ensaios de ligação ao SPR para examinar a ligação de CV-N ao AH, glicoproteína S, glicanos do tipo híbrido relacionados e oligossacarídeos com alto teor de manose. O SPR é usado para determinar o KD para ligar o CV-N dimérico ou monomérico a esses glicanos.

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Aqui, apresentamos um protocolo para reduzir as modificações de DNA em bacteriófagos usando a enzima NgTET, permitindo a mutagênese CRISPR-Cas eficiente e sem cicatrizes. Este método facilita a engenharia genética de fagos para aplicações em biotecnologia e terapia fágica.

Mutagênese precisa de fagos com sistemas CRISPR-Cas assistidos por NgTET

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Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

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