Name: Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Aprenda a medir a expectativa de vida de C. elegans em meios sólidos com bactérias mortas por UV. Este protocolo sincronizado por idade permite estudar o envelhecimento em nematoides de forma precisa e controlada.

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Este trabalho foi financiado por um Avanços Glenn / AFAR em Gerontologia e Grant Award NIH 1R01AG031108-01 a MKGS é suportado pelo NIH treinamento conceder P30AG013280. MK é um Ellison Medical Foundation Scholar novo no Envelhecimento.

Parte 1: Prepare nematóide crescimento media (NGM) placas Esta seção descreve a preparação das placas NGM sólido para uso no experimento vida. A experiência de extensão básicas da vida requer dois tipos de placas: placas NGM padrão, que não contêm aditivos, e Amp / FUDR placas, que têm ampicilina (Amp) e fluorodeoxyuridine (FUDR) adicionado ao NGM. Ampicilina é usado para prevenir a contaminação bacteriana estrangeiros. FUDR inibe a divisão celular, reduz a produção de ovos, e impede que os ovos de incubação. O uso de FUDR para a análise da longevidade não afeta expectativa de vida de adultos e elimina a necessidade de transferência de worms cada poucos dias, a fim de separá-los de larva a crescer. Ambos os tipos de placas são semeados com E. coli OP50 bactérias, que é posteriormente morto por exposição a UV. <ol><li> Prepare NGM (ver secção 5 para receita e notas de armazenamento) e placas de petri rótulo. Você vai precisar de uma placa de petri 60 milímetros por 10 mL de NGM. Se você está começando com previamente preparado NGM sólida, avance para o passo 1.2. Se você está começando com NGM recém autoclavado, pule para o passo 1.4. </li><li> Derreter completamente NGM sólido por microondas em alta em 30 pulsos segundo. Media redemoinho entre os pulsos para evitar bolhas de gás pressurizado de edificação. </li><li> NGM lugar líquido em 55 ° C ou banho de água na bancada para esfriar. </li><li> Uma vez que NGM atinge 55 ° C adicionar 33 mL de 150 FUDR mM e 100 mL de 100 mg / mL por 100 mL Ampicilina NGM (para Amp / FUDR placas) e agite para misturar. Para placas NGM sem drogas adicionais prosseguir diretamente para o passo 1.5. </li><li> Utilizando uma técnica estéril, pipetar 10 mL em cada placa NGM petri 60 mm. Evite a formação de bolhas, se possível. Se as bolhas se formam, elas podem ser estalado usando uma ponta da pipeta. </li><li> Deixar as placas sobre a bancada com tampas para permitir NGM para solidificar e seco. Se possível, deixe as placas no banco por 2 dias antes da adição de bactérias, mas um dia vai funcionar se as placas são necessários mais cedo. </li><li> No dia antes de terminar a secagem das placas, a semente da cultura LB líquido com uma única colônia a partir de uma raia fresca de E. coli OP50 bactérias em agar LB. Você deve preparar, pelo menos, 1 mL de uma cultura OP50 noite por 60 placa mm. </li><li> Cultura local OP50 em 37 ° C shaker e permitir que as bactérias cresçam overnight (a cultura deve atingir a saturação). </li><li> Pellet OP50 bactérias girando a 3.500 g por 10 minutos. </li><li> Remover 90% das bactérias sobrenadante e ressuspender concentrar cultura 10x. </li><li> Pipetar 100 mL da cultura 10x OP50 concentrada no centro de placas NGM solidificado. Placas agite cuidadosamente para espalhar cultura de bactérias se necessário (o ideal bactérias deve cobrir a área central da NGM sem chegar perto das muralhas da placa). Tente evitar tocar a ponta da pipeta na superfície da NGM, como falhas na superfície dos meios de comunicação permitirá que as minhocas burrow na NGM. </li><li> Deixe placas no banco durante a noite para permitir cultura de bactérias para secar na NGM sólido (normalmente demora cerca de 24 horas). </li><li> Depois de seco, expor a superfície das placas a uma dose UV suficiente para deter o crescimento das bactérias. Se você estiver usando uma Stratalinker UV Stratagene 2400: <ul><li> Placas lugar no Stratalinker e remover as tampas </li><li> Feche a porta e ligar o Stratalinker </li><li> "Energia" de imprensa </li><li> Digite '9999 'usando o teclado </li><li> 'Start' imprensa </li><li> As placas serão expostos aos raios UV por aproximadamente 5 minutos </li></ul></li><li> Placas com as bactérias UV-morto pode ser armazenado de cabeça para baixo a 4 ° C por até 1 mês. </li></ol> Parte 2: Executar um ovo cronometrados que estabelece uma idade para a aquisição sincronizada população de animais Nesta seção, vamos gerar uma população de vermes com uma data comum hatch. Isto é conseguido, permitindo que adultos reprodutivamente ativos para colocar ovos em um prato por um período definido de tempo e permitindo que os ovos se desenvolvam. <ol><li> (Opcional) Transferência de aproximadamente 20 vermes adultos jovens a uma placa NGM fresca sem FUDR. Deixar as placas a 25 ° C, a fim de permitir que worms se propaguem e comer através de todos os alimentos bacteriana. Depois que o alimento foi consumido bacteriana worms recém-nascidos vai entrar no estágio de crescimento preso Dauer. Você começará a ver larva Dauer em torno de uma semana, dependendo de quantos worms você transferir para a placa inicialmente. Dauer larva pode ser usado para as próximas etapas para até um mês. </li><li> (Opcional) Transferência larva Dauer 20-30 a uma placa NGM fresca sem FUDR. Na presença de larva de alimentos se tornarão adultos Dauer reprodutivamente ativa dentro de 2 dias e manter-se reprodutivamente ativa por alguns dias depois a 25 ° C. </li><li> Transferência de 10-15 adultos reprodutivamente ativa para uma placa NGM fresca sem FUDR. Esta placa é referida como a postura de ovos cronometrado (TEL) da placa. </li><li> Deixe a placa TEL a 25 ° C durante 6 horas, a fim de permitir que tele worms tempo para botar ovos. </li><li> Remover vermes adultos de placa TEL. Placa pode ser inspeccionados visualmente para os ovos antes de remover os adultos. Se os vermes não tenham estabelecido um número suficiente de ovos a placa TEL podem ser deixados a 25 ° C por até um total de 24 horas antes de retirar vermes adultos. </li><li> Colocar a placa TEL a 20 ° C até que os ovos eclodiram e os vermes desenvolveram ao estágio larval L4 (o que normalmente leva 2 dias para tipo selvagem C. elegans, mas pode demorar mais tempo para as cepas com fenótipos de desenvolvimento lento). </li></ol> Parte 3: animais Partituras de vida Nesta seção, siga as idade sincronizado população de vermes na parte 2 até morrerem. Worms são mantidos em Amp / FUDR placas para impedir a produção de ovos ea contaminação bacteriana e são considerados mortos quando não conseguem responder a estímulos externos. <ol><li> Transferência de larva L4 para semeado Amp / FUDR placas. Para cada estirpe ou condição a ser testada, é típico para configurar 2-3 placas com 25-30 worms por placa. Imagens da C. fases da vida elegans são fornecidos para a referência (Figura 1) 1. </li><li> Lugar Amp / FUDR placas a 20 ° C por 24 horas. </li><li> Após 24 horas, visualmente avaliar worms, mídia e bactérias. Transferência de worms para fresco Amp / FUDR placas se qualquer um dos seguintes é observado: <ul><li> Worms ter comido a maior parte dos alimentos bacteriana. No início da vida worms experimento extensão terá de ser transferida 1-2 vezes por semana para evitar que as bactérias fossem esgotados. </li><li> Um número significativo de larvas estão presentes. Isso geralmente é uma indicação de que os vermes foram transferidos para as placas Amp / FUDR como jovens adultos, em vez de L4s e foram capazes de colocar alguns ovos antes da FUDR entrou em vigor. O FUDR geralmente impedir que as larvas se transformem em adultos completa, mas, ocasionalmente, alguns vão se transformar em adultos e se confundem com os animais experimentais. </li><li> Bactérias vivas / crescentes são observadas. Geralmente, a combinação de Amp e UV-matança vai garantir que nenhuma bactéria contaminar viver a experiência, mas ocasionalmente ocorre. </li><li> Crescimento do fungo é observada na mídia. Se detectada a tempo, o crescimento de fungos geralmente podem ser cortadas usando uma ponteira ou espátula. Uma vez que cresce a ser maior do que alguns milímetros de diâmetro é geralmente mais fácil de transferir os vermes para um novo prato. </li><li> Usando o escopo de dissecação, determinar se cada um worm é vivo ou morto. </li><li> Bata suavemente a placa. O worm é vivo se move em resposta ao toque. </li><li> Se o worm não responde a tocar a placa de zoom, em na região da cabeça. </li><li> Bata suavemente a cabeça do verme com pick transferência de platina. Pontuação o worm como morto, se ele não responder movendo a cabeça. </li><li> Worms mortos pode ser removido da placa. </li></ul></li><li> Registrar a data eo número de vermes que estão vivos e mortos. </li><li> Retorno placas a 20 ° C. </li><li> Repita os passos 3,3 a 3,6 a cada 2 a 3 dias até que todos os vermes já morreram. </li></ol> Parte 4: Resultados Representante. Os dados brutos produzidos por um período de experiência de nematóides de vida é uma lista de datas com números correspondentes de vermes que estão vivos e mortos para cada cepa testada. O número de worms que morrem em cada dia é tipicamente invertido para calcular a proporção de vermes vivos em cada dia (Figura 2A), que é plotado graficamente como uma curva de sobrevivência (Figura 2B, o dia da postura de ovos cronometrado é considerado dia 0 ). O tempo de vida para cada verme individuais no estudo pode ser calculado a partir da contagem de vermes que morrem em cada dia e usado para calcular tempo de vida média e mediana para a comparação entre as linhagens. A contagem do número de vermes vivos em cada dia não é utilizado diretamente na análise de ciclo de vida. Worms mantidos em meios sólidos irá ocasionalmente 'fugir', ou rastrear tanto para cima da parede da placa ou para baixo abaixo da media. O número de vermes vivos em cada dia pode ser usado para determinar quantos worms fugiram durante todo o curso do experimento. Worms que fogem são normalmente removidos da análise. Como referência, o tempo de vida típico mediana para N2, a C. elegans cepa do tipo selvagem, mantidos em UV-matou as bactérias a 20 ° C é de aproximadamente 25 dias, como medida de ovo. Parte 5: Soluções <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Nematóide Crescimento Media (NGM), 100 mL: </td></tr><tr><td colspan="2"> Combine: </td></tr><tr><td> 0,3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 0,25 g </td><td> Peptona </td></tr><tr><td> 2 g </td><td> Agar </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave por 40 minutos e deixe esfriar até 55 ° C, em seguida, acrescentar: </td></tr><tr><td> 100 L </td><td> 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 100 L </td><td> Colesterol 5 mg / mL </td></tr><tr><td> 100 L </td><td> 1 M CaCl2 </td></tr><tr><td> 1,625 mL </td><td> 1,5 M pH 6,0 KPI </td></tr><tr><td colspan="2"> NGM líquido pode ser usado imediatamente para derramar placas ou permissão para solidificar e armazenados a longo prazo na temperatura ambiente </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Luria Broth (LB), 1L: </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> BactoTryptone </td></tr><tr><td> 5 g </td><td> Extrato de levedura </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 10 mL </td><td> 1 M Tris pH 8,0 </td></tr><tr><td> 1 L </td><td> água deionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave e armazenar em temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M MgSO 4, 300 mL: </td></tr><tr><td> 73,95 g </td><td> MgSO 4 </td></tr><tr><td> 300 mL </td><td> água deionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave e armazenar em temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Colesterol 5 mg / mL, 200 mL: </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> colesterol </td></tr><tr><td> 200 mL </td><td> Etanol 100% </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M CaCl 2, 500 mL: </td></tr><tr><td> 27,75 g </td><td> CaCl 2 </td></tr><tr><td> 500 mL </td><td> água deionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1,5 M pH 6,0 KPI, 1L: </td></tr><tr><td colspan="2"> Combine: </td></tr><tr><td> 31,4 g </td><td> KPI dibásico </td></tr><tr><td> 179,6 g </td><td> KPI monobásico </td></tr><tr><td> 850 mL </td><td> água deionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> De calor durante a mistura para permitir KPI para dissolver na solução. Ajustar o pH para 6,0 com NaOH 10 N. </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicione água deionizada para 1 L. </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave e armazenar em temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M Tris, pH 8.0: </td></tr><tr><td> 60,57 g </td><td> Tris </td></tr><tr><td> 400 mL </td><td> água deionizada </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajustar o pH para 8,0 com HCl. </td></tr><tr><td colspan="2"> Adicionar água deionizada até 500 mL. </td></tr><tr><td colspan="2"> Filtro de esterilizar e armazenar à temperatura ambiente. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 mL: </td></tr><tr><td> 0,3693 g </td><td> FUDR </td></tr><tr><td> 10 mL </td><td> água deionizada estéril </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 100 mg / mL Ampicilina (AMP), 10 mL: </td></tr><tr><td> 1 g </td><td> Ampicilina </td></tr><tr><td> 10 mL </td><td> água deionizada estéril </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 50 mg / mL carbenicilina (Carb), 10 mL: </td></tr><tr><td> 500 mg </td><td> Carbenicilina </td></tr><tr><td> 10 mL </td><td> água deionizada estéril </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a -20 ° C. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 1 M isopropílico β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 mL: </td></tr><tr><td> 2,38 g </td><td> IPTG </td></tr><tr><td> 10 mL </td><td> água deionizada estéril </td></tr><tr><td colspan="2"> Armazenar a -20 ° C. </td></tr></tbody></table><img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%201.png" alt="figura 1"> Figura 1. Brilhante imagens campo de C. fases da vida elegans, incluindo ovo, quatro estágios larvais (L1 - L4) e adultos. Todos os painéis mostram hermafroditas, exceto o inferior direito, o que mostra um homem adulto (Imagem de Wood (1988)). <img src="/files/ftp_upload/1152/Figure%202.png" alt="figura 2"> Figura 2. Os resultados representativos de um C. elegans experimento tempo de vida comparando N2 linhagem selvagem tipo para uma cepa que contém uma mutação no gene daf-2. (A) Uma tabela mostrando os dados coletados, incluindo o número de dias desde worms foram ovos, número de vermes mortos observadas em cada dia, ea porcentagem da amostra original permanecer vivo em cada dia (como calculado a partir da contagem diária de vermes mortos) . (B) Survival curvas correspondentes aos dados de tempo de vida previsto no (A). <imgsrc files alt='"figura'></imgsrc> Figura 3. Comparação Representante da lipofuscina entre jovens e velhos adulto C. elegans. Imagens de campo claro são mostrados à esquerda e as imagens de fluorescência DAPI canal à direita. Painéis superiores mostram um verme 4 dias de idade e painéis de fundo mostram um worm de 11 dias de idade (medida a partir de ovo).

<ol><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWood%2C+WB+%22The+Nematode+Caenorhabditis+elegans%22">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-16 (1988).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+increases+life+span+in+wild-derived+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Dietary restriction by bacterial deprivation increases life span in wild-derived nematodes.</a> Exp Gerontol. 43, 130-135 (2008).</li>
<li>Garigan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Chen, D., Pan, K. Z., Palter, J. E., Kapahi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+determined+by+developmental+arrest+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Longevity determined by developmental arrest genes in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 6, 525-523 (2007).</li>
<li>Curran, S. P., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+regulation+by+evolutionarily+conserved+genes+essential+for+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lifespan regulation by evolutionarily conserved genes essential for viability.</a> PLoS Genet. 3, e56-e56 (2007).</li>
<li>Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Hamilton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19, 1544-1555 (2005).</li>
<li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genes+tied+to+endocrine%2C+metabolic%2C+and+dietary+regulation+of+lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+genomic+RNAi+screen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen.</a> PLoS Genet. 1, 119-128 (2005).</li>
<li>Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat Genet. 33, 40-48 (2003).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+calorie-independent+life+span+extension+from+dietary+restriction+by+bacterial+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Age- and calorie-independent life span extension from dietary restriction by bacterial deprivation in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Dev Biol. 8, 49-49 (2008).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+Mutants+of+the+Nematode+CAENORHABDITIS+ELEGANS%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.</a> Genetics. 91, 67-94 (1979).</li>
<li>Emmons, S. W., Sternberg, P. W. C. ELEGANS II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (1997).</li>
<li>Lipton, J., Kleemann, G., Ghosh, R., Lints, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mate+searching+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+genetic+model+for+sex+drive+in+a+simple+invertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mate searching in Caenorhabditis elegans: a genetic model for sex drive in a simple invertebrate.</a> J Neurosci. 24, 7427-7434 (2004).</li>
<li>Davis, B. O., Anderson, G. L., Dusenbery, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+luminescence+spectroscopy+of+fluorescence+changes+during+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Total luminescence spectroscopy of fluorescence changes during aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 21, 4089-4095 (1982).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Steinkraus, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+restriction+suppresses+proteotoxicity+and+enhances+longevity+by+an+hsf-1-dependent+mechanism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Dietary restriction suppresses proteotoxicity and enhances longevity by an hsf-1-dependent mechanism in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 7, 394-404 (2008).</li>
</ol>

O controle genético da longevidade tem sido estudado extensivamente em C. elegans, em grande parte devido à facilidade e rapidez com que expectativa de vida pode ser determinada. O protocolo discutido neste artigo descreve uma estrutura básica para a obtenção de dados de vida reprodutíveis extensão em C. elegans e também pode ser aplicado às espécies relatednematode. 2 Ao fazer algumas alterações simples desses procedimentos pode ser adaptado para medir a expectativa de vida sob uma variedad...

<table><tbody><tr><td>Ágar</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Reagente</td><td>MidSci</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>BactoTryptone</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3 (211705)</td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptona</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9699248 (1332-01)</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>Reagente</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C75209</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodesoxiuridina (FUDR)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &amp;#946;-d-Tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Reagente</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C5</td><td></td></tr><tr><td>KPi dibásico</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087862 (3252-01)</td><td></td></tr><tr><td>KPi monobásico</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>5087861 (3246-01)</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9561800 (2500-01)</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>S251</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr></tbody></table>

medição caenorhabditis elegans expectativa de vida em meios sólidos

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

O envelhecimento é um processo degenerativo caracterizado por uma deterioração progressiva de componentes celulares e organelas, resultando em mortalidade. O nematóide<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Surgiu como um modelo principal utilizado para estudar a biologia do envelhecimento. Porque praticamente todos os subsistemas biológico sofre declínio funcional com o aumento da idade, expectativa de vida é o objetivo primário de interesse quando se considera taxa total de envelhecimento. Em nematóides, expectativa de vida é normalmente definida como o número de dias de um animal continua a responder a estímulos externos. Nematóides podem ser propagadas tanto em meios líquidos ou em meios sólidos em placas, e as técnicas foram desenvolvidas para medir o tempo de vida em ambas as condições. Aqui apresentamos um protocolo generalizada para medir tempo de vida dos nematóides mantidos em meio de crescimento sólido de nematóides e alimentados com uma dieta de UV-morto bactérias. Estes procedimentos podem ser facilmente adaptado a vida útil do ensaio sob várias condições comuns, incluindo uma dieta composta de bactérias vivas, a restrição alimentar e interferência de RNA.

Neste artigo apresentamos um protocolo geral para medir a expectativa de vida dos nematóides mantidos em meios sólidos com alimentos UV-morto bacteriana.

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

O envelhecimento é um processo degenerativo caracterizado por uma deterioração progressiva dos componentes e organelas celulares, resultando em mortalidade. O nematoide ...

Para medir a longevidade em C. elegans, uma população sincronizada por idade é gerada por meio de uma postura de ovos controlada no tempo. Vermes hermafroditas adultos ativos são transferidos para placas de meio de crescimento de nematoides inoculadas com E. coli morta por UV, onde permanecem por seis a oito horas para postura de ovos e, em seguida, são removidos. Nos dois dias seguintes, vermes eclodem desses ovos e crescem até o estágio larval L4. Os vermes L4 são transferidos para novas placas de NGM contendo ampicilina para prevenir contaminação bacteriana viva e FUDR para impedir a reprodução, sendo então deixados desenvolverem-se até a fase adulta.A partir deste momento, os vermes adultos são observados a cada dois ou três dias até que todos os vermes tenham morrido. Em cada ponto temporal, os vermes mortos são removidos da placa e o número de vermes vivos e mortos é registrado. Eu sou George Seton do laboratório de Matt Capline do Departamento de Patologia da Universidade de Washington.Hoje vamos mostrar como medir a longevidade e observar a nossa elegância em hepatite. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a genética do envelhecimento. Então, vamos começar.Um experimento básico de longevidade requer dois tipos de placas: placas NGM padrão, que não contêm aditivos, e placas AMP FUDR, que possuem ampicilina e fluordesoxiuridina adicionadas ao NGM. Ambos os tipos de placas são semeados com bactérias e coli OP50, que posteriormente são inativadas pela exposição à radiação ultravioleta. Comece preparando 10 mililitros de solução NGM.Para cada placa de Petri de 60 milímetros, derreta completamente o NGM sólido aquecendo-o no micro-ondas em pulsos de 32 segundos na potência máxima. Agite o meio entre os pulsos para evitar o acúmulo de bolhas de gás pressurizado. Coloque o NGM líquido em banho-maria a 55 graus Celsius ou sobre a bancada para permitir que o meio esfrie. Uma vez que o meio tenha atingido 55 graus Celsius, temperatura na qual você deve conseguir segurar o recipiente de vidro com as mãos nuas confortavelmente, ele estará pronto para receber os fármacos.E para preparar as placas com drogas, adicione 33 microlitros de FUDR 150 milimolar e 100 microlitros de ampicilina a 100 miligramas por mililitro por 100 mililitros de NGM e agite suavemente para misturar. A ampicilina é utilizada para prevenir contaminação bacteriana estranha e o FUDR para impedir a eclosão dos ovos. Assim, os vermes não precisarão ser transferidos a cada poucos dias para separá-los das larvas em desenvolvimento.Agora, despeje o meio e deixe as placas secarem sobre a bancada por dois dias. No dia anterior à conclusão da secagem das placas, inicie um cultivo líquido de LB com uma colônia isolada de um streak fresco de e coli. Bactérias OP 50 em ágar LB. Prepare pelo menos 0,5 mililitro de cultivo por placa de 60 milímetros.Coloque o cultivo OP 50 em um agitador a 37 graus Celsius e deixe as bactérias crescerem durante a noite. No dia seguinte, pelletize as bactérias OP 50 com uma força centrífuga de 3.500 ×g por 10 minutos. Decante parte do sobrenadante suficiente para ressuspender as bactérias em uma concentração 10×.Agora, inocule cada placa com 100 microlitros da cultura concentrada. Evite tocar a ponteira da pipeta na superfície do NGM, pois imperfeições na superfície do meio permitirão que os vermes se enterrem; gire as placas até que as bactérias cubram a área central do NGM sem se aproximar das paredes da placa e deixe as placas secarem sobre a bancada por 24 horas. Após a secagem, exponha a superfície das placas a uma dose de UV suficientemente forte para interromper o crescimento bacteriano; utilizamos um crosslinker de UV Strata Gene 2400.Inicie carregando as placas no conector tipo garfo sem as tampas. Agora pressione energia. Digite 9 9 9 9 no teclado numérico e pressione iniciar.As placas serão expostas à radiação UV por aproximadamente cinco minutos. As placas com bactérias mortas por UV podem ser armazenadas de cabeça para baixo a quatro graus Celsius por até um mês. Esta seção descreve como gerar uma população de vermes com uma data de eclosão comum.Inicie transferindo aproximadamente 20 vermes adultos jovens para uma placa NGM fresca sem drogas. Deixe a placa a 25 graus Celsius por cerca de uma semana para permitir que os vermes se multipliquem e consumam todo o alimento bacteriano em uma semana. Vermes recém-eclodidos no estágio de repouso em forma de doura devem aparecer; transfira 20 a 30 larvas em estágio de doura para uma placa NGM fresca sem drogas e incube-os a 25 graus Celsius na presença de alimento.As larvas recém-nascidas se tornarão adultos reprodutivamente ativos em até dois dias e permanecerão reprodutivamente ativos por alguns dias após esse período. Agora, transfira de 10 a 15 adultos reprodutivamente ativos para uma placa fresca de NGM sem drogas. Essa placa é denominada placa de postura de ovos em tempo determinado ou placa TEL.Deixe a placa TEL a 25 graus Celsius para que os vermes possam pôr ovos. Os animais que eclodirem desses ovos serão os animais experimentais e terão sua longevidade avaliada após seis horas. Inspecione a placa TEL em busca de ovos.Se ainda não houver ovos suficientes, deixe a placa TEL a 25 graus Celsius por até um total de 24 horas, verificando periodicamente a presença de ovos. Quando um número suficiente de ovos tiver sido depositado, remova os adultos da placa TEL.Um experimento típico de longevidade exigirá de 30 a 90 ovos por grupo experimental, mas várias centenas de ovos podem ser geradas em uma única placa TEL. Aproximadamente 150 ovos serão postos por 10 a 15 adultos reprodutivamente ativos em seis a oito horas. Ao comparar grupos experimentais, a significância estatística pode ser alcançada para grandes diferenças de longevidade com apenas 30 animais.Devem ser utilizados mais animais para distinguir diferenças mais modestas. Agora, coloque a placa TEL sem adultos a 20 graus Celsius até que os ovos eclodam e os vermes tenham se desenvolvido até o estágio larval L4. Isso geralmente leva dois dias para o tipo selvagem C. elegans, mas pode levar mais tempo para linhagens com fenótipos de desenvolvimento lento.Esta seção descreve como acompanhar o ciclo de vida de uma população sincronizada por idade. Primeiro, transfira as larvas L4 do prato TEL para pratos AMP FUDR dispostos em posição horizontal. Para cada linhagem ou condição testada, é comum preparar duas a três placas com 25 a 30 vermes por placa.Incube as placas AMP FUDR a 20 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, avalie visualmente os vermes, o meio e a bactéria; transfira os vermes para placas AMP FUDR frescas. Se os vermes tiverem consumido a maior parte do alimento bacteriano, isso geralmente ocorrerá uma ou duas vezes por semana.No início do experimento, se um número significativo de larvas estiver presente, isso geralmente indica que os vermes foram transferidos para as placas com AMP FUDR como adultos jovens em vez de como L4. Adultos jovens podem pôr ovos antes que o FUDR faça efeito, e ocasionalmente as larvas escapam dos efeitos do FUDR e se desenvolvem em adultos. Essas larvas irão confundir o experimento nesta situação; transfira os vermes adultos para placas frescas e descarte as placas antigas contendo as larvas.Os vermes também devem ser transferidos para placas frescas caso sejam observadas bactérias vivas em crescimento. Geralmente, a combinação de AMP e inativação por UV garante que nenhuma bactéria viva contamine o experimento, mas ocasionalmente isso pode ocorrer. Além disso, transfira os vermes.Se o crescimento fúngico for observado no meio. Se detectado precocemente, o fungo pode ser removido usando a ponta de uma pipeta ou uma espátula. Uma vez que cresça até atingir um diâmetro maior que alguns milímetros, geralmente é mais fácil transferir os vermes para uma nova placa.Avalie a longevidade de todos os vermes a cada dois ou três dias. Utilizando um microscópio estereoscópico, determine se cada verme está vivo ou morto.Toque suavemente na placa. O verme está vivo se se mover em resposta à batida. Se o verme não responder ao toque na placa, aumente o zoom na região da cabeça e toque suavemente na cabeça do verme com uma alça de platina.Classifique o verme como morto. Se ele não responder movendo a cabeça, remova o verme morto da placa. Após verificar todos os vermes, registre a data e o número de vermes vivos e mortos.Vermezinhos mantidos em meio sólido ocasionalmente escapam da superfície da placa ao se enterrarem ou rastejarem pela parede. Os vermezinhos que fogem são completamente omitidos do estudo. Ao finalizar, devolva as placas ao incubador a 20 graus Celsius.Aguarde mais dois a três dias e, em seguida, verifique novamente as placas. Continue esse regime até que todos os vermes tenham morrido. O número de vermes que morrem a cada dia é normalmente invertido para calcular a proporção de vermes vivos em cada dia; esses dados são representados graficamente como uma curva de sobrevivência, considerando-se o dia da postura programada dos ovos.Dia zero. A longevidade mediana típica para N dois. A linhagem selvagem de C. elegans mantida em bactérias mortas por UV a 20 graus Celsius é de aproximadamente 25 dias, medida a partir do ovo.Acabamos de mostrar como medir a longevidade e observar a elegância. Você pode modificar este procedimento básico para testar uma variedade de condições ambientais, incluindo restrição dietética e interferência por RNA, o que é discutido no texto complementar. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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