Name: Homarus Americanus Stomatogastric Dissecção do Sistema Nervoso (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 22 s
Description: Aprenda a dissecção fina do sistema nervoso estomatogástrico de Homarus americanus para estudos de neurociência. Este método permite isolar gânglios e nervos para análises funcionais de circuitos neurais.

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Gostaríamos de agradecer nosso consultor, Dr. Eve Marder. Esta pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de Saúde concede NS17813 a Eva Marder e NS059255 para AE T.

Antes de começar este protocolo o estômago da lagosta deve ser retirado do animal e preparado como descrito no artigo companheiro Jove (Bierman &amp; Tobin, 2009). A maioria das etapas descritas abaixo devem ser realizados sob um microscópio de dissecação. Parte I-Isolar os gânglios comissural <ol><li> Orientar o prato de modo que a extremidade anterior (pelo lábio) está longe de você e da extremidade posterior (pelo piloro) é para você. </li><li> Garantir que o estômago é preso para que ele fique o mais plano possível no prato. <ol><li> Pin para o esôfago em cada lado do lábio. </li><li> Se necessário, reorganize os outros pinos colocados durante a dissecção macroscópica. </li></ol></li><li> Remova a hipoderme. <ol><li> Agarre a hipoderme perto do gm2/gm3 músculos, retire-os músculos e puxe na direção anterior. </li><li> Separar os hipoderme da gordura subjacente cortando as ligações. Maior utilização de cuidados ao redor da artéria central, que inclui uma parte fundamental do sistema nervoso stomatogastric. Deixe a hipoderme intacta dentro de cerca de um raio de 0,5 cm do gânglio stomatogastric, que fica entre os músculos GM1b. </li><li> Cortadas hipoderme separados. </li></ol></li><li> Separar o cérebro do tecido subjacente. <ol><li> Identificar os dois grandes nervos comissural esse projeto bilateral da parte anterior do cérebro para os gânglios comissurais na porção anterior do estômago. </li><li> Deixando estes nervos intactos, levante cuidadosamente o cérebro com uma pinça e corte para separar o cérebro do resto do tecido. Tenha cuidado como você fazer isso, como o nervo stomatogastric fica embaixo do cérebro e deve ser mantida intacta. </li></ol></li><li> Separar os gânglios comissural de ao redor do tecido. <ol><li> Siga um dos nervos comissural a um dos gânglios comissural. </li><li> Identificar o íon e filho - estes nervos devem permanecer intactos. O gânglio comissural terá muitos nervos que saem. Cortar a maioria deles (exceto o íon e filho), mas deixe um nervo ligado extras para manter o gânglio comissural no lugar quando você terminar a dissecção. </li><li> Repita com o gânglio outros comissural. </li></ol></li><li> Limpe o íon e filho de lateral para medial. Deixe o nervo labial intacta para ancorar o sistema nervoso para o estômago. O gânglio de esôfago fica eram os s ion se cruzam. Você pode limpar abaixo dela, agarrando o nervo ventricular inferior e puxando para cima a cortar por baixo. </li></ol> Parte II-Isolar o gânglio Stomatogastric (STG) e os nervos restantes. <ol start="7"><li> Separar os STG de ao redor do tecido. <ol><li> O STG fica dentro de uma artéria que corre entre os músculos GM1b e para baixo para os músculos gm2a, b. Olhe para a extremidade cortada da artéria perto os músculos gm2a, b. </li><li> Puxe a extremidade cortada da artéria para cima e anteriormente, para expor a DVN. Continue puxando para cima até chegar ao nível da hipoderme restantes. Uma vez separadas, a artéria pode ser cortado para o nível em que toca a hipoderme restantes. </li><li> Cortar o retalho do músculo que estava situada na tribuna da lagosta. </li><li> Levante a hipoderme acima da artéria, observando que a artéria faz um túnel dentro da gordura acima do STG. Coloque uma lâmina de sua tesoura dentro da artéria e cortar o músculo acima dela. Verifique se você pode ver o DVN como você cortar para ter certeza de que você está com segurança acima da STG. Continue o corte anterior, seguindo a artéria. Como você corte acima do STG, você será capaz de ver o stn emanando anteriormente da STG e para baixo mergulho para dentro do músculo. Continue o corte anteriormente ao separar totalmente o músculo acima do STG. </li><li> Limpar qualquer tecido longe da STN. </li></ol></li><li> Separar os s AGN do tecido circundante. (Mesmo se você não planeja gravar a partir da AGN, você vai precisar de uma porção do nervo intacto para fixar para baixo o gânglio para gravações intracelular.) <ol><li> Para ver melhor o s AGN, remover o restante hipoderme e uma fina camada do músculo subjacente. </li><li> Imediatamente posterior à STG, identificar um túnel escuro na gordura e músculos de cada lado da DVN. </li><li> Vara uma lâmina de tesoura dentro do túnel e cortar o tecido acima do nervo. Continue cortando lateralmente, seguindo o nervo, para isolá-lo. (Dois milímetros é suficiente para a pinagem do gânglio, mas expor pelo menos 5 mm da AGN, se você pretende gravar a partir dele.) </li><li> Destacar a AGN do músculo que inerva cortando as ligações. </li><li> Repita no outro lado para isolar a AGN outros. </li><li> Uma vez que ambos s AGN foram dissecados, cortar todos os músculos e tecido conectivo do STG para o estômago. </li></ol></li><li> Isolar o s. mvn Eles são um par bilateral de pequenos nervos que se ramificam do lvn e atravessando lateralmente embaixo da gordura. <ol><li> Usar tesoura ou duas pinças para cortar a gordura de um lado da DVN, perto de onde se ramifica em duas lvn s. Aqui estão longe do s mvn e não risco cortá-las. </li><li> Levante a camada de gordura, e identificar os debaixo mvn pequeno. Esses nervos executar medial para lateral posterior apenas ao nível dos músculos GM1b. </li><li> Remover a camada de gordura acima do mvn, deixando o nervo intacto para agora assim que não vai se tornar tangled. Você vai cortar a sua extremidade lateral de fora do estômago no final da dissecção. </li><li> Repita o processo do outro lado para isolar o mvn outros. </li></ol></li><li> Isolar o s lvn e nervos posterior. <ol><li> Partida onde o ramo lvn s lateralmente fora da DVN, siga um lvn cortando a gordura acima dela. Dependendo da preparação, por vezes, toda a camada de gordura acima do nervo pode ser puxado para fora. </li><li> Continue revelando a lvn até o ponto onde os ramos psn off. </li></ol></li><li> Isolar o pyn. <ol><li> Localize o pyn, é um nervo que viajam posteriormente sobre o piloro. </li><li> Remover a fina membrana que cobre a região. </li><li> Isolar o pyn cortando uma pequena secção do piloro, anexado ao pyn. </li><li> Levante cuidadosamente a secção do piloro e cortar o tecido de cada lado do pyn até chegar ao ramo que atribui ao PDN. </li></ol></li><li> Isolar o pdn. <ol><li> Localize o pdn, é um nervo viajando posteriormente para o músculo dilatador pilórica. </li><li> Corte uma pequena parte do músculo dilatador pilórica, anexado ao PDN. </li><li> Levante cuidadosamente a secção do músculo pilórico dilatador, cortar o tecido de cada lado do pdn até chegar ao ramo que atribui à pyn. </li></ol></li><li> Isolar o lvn ventral, que liga o pyn e pdn ao lvn. <ol><li> No ponto de ramificação triangular onde o pyn e pdn conectar à lvn ventral, isolar qualquer pequena parte do nervo que se ramifica a lvn ventral, como o vpln. Este será usado como um identificador para puxar o lvn ventral. </li><li> Levante a alça e cortar o tecido de cada lado do lvn ventral, trabalhando na direção anterior até chegar ao ponto onde os ramos psn off. </li></ol></li><li> Repita os passos 10-13 para isolar os nervos lvn e posterior do outro lado. </li><li> Retire o sistema nervoso stomatogastric do estômago. <ol><li> Para remover completamente a lvn do estômago, puxe a psn e cortar todos os tecidos e nervos ligados ao lvn lvn e ventral, exceto para o pdn e pyn. Repita o processo do outro lado. </li><li> Corte a extremidade lateral de cada mvn. Levante a extremidade lateral e corte quaisquer anexos estranhos entre o nervo eo tecido subjacente estômago. </li><li> Na extremidade anterior, cortar quaisquer anexos estranhos para os gânglios comissural, e cortar o nervo vestibular em cada lado. </li><li> Visualmente a varredura do sistema nervoso stomatogastric sistema para identificar e depois cortar quaisquer anexos adicionais ao tecido do estômago. </li><li> Agarre-se a extremidade anterior de ambos os nervos comissural, acima dos gânglios comissural, e descasque o sistema nervoso stomatogastric fora do estômago e movê-lo para o lado do prato. Ao fazer isso, cortar quaisquer anexos restantes para libertar o sistema nervoso. </li></ol></li><li> Preparar o prato Sylgard pequeno. <ol><li> Passe um pouco de tecido do estômago completamente na superfície do Sylgard no prato pequeno. Isto irá diminuir a hidrofobicidade do Sylgard, de modo que a solução salina irá distribuir uniformemente em todo o prato. </li><li> Enxaguar e encher o prato Sylgard com soro fisiológico gelado. </li></ol></li><li> Transferir o sistema nervoso para o prato preparado por Sylgard agarrando as extremidades anterior de ambos os nervos comissural, levantando o sistema nervoso fora do grande prato, e estabelece-lo no pequeno prato. </li><li> Pin do STNS no prato pequeno, utilizando uma combinação de pinos Minuten e pinos mais finos corte de fio de tungstênio. <ol><li> Garantir que a preparação é o lado dorsal, verificando que o nervo ventricular inferior está apontando longe do Sylgard. </li><li> Remover o cérebro e os nervos pin comissural. </li><li> Puxe o sistema nervoso apertado e plana, puxando cada um dos s psn posteriormente e lateralmente, e fixando-os para baixo. </li><li> Retire o músculo dilatador pilórica do s pdn, e fixar o s. pdn </li><li> Remova osegmento pilórica do s pyn, e fixar o s. pyn </li><li> Identificar qualquer nervos remanescentes isolados, como os nervos labial, o s mvn e AGN s. </li></ol></li><li> Desheath o STG. <ol><li> Garantir a STG fica encostado ao Sylgard e mantida tensa por lateral AGN s, a stn anterior e posterior DVN. </li><li> Providenciar a iluminação para permitir a visualização dos axônios dentro da DVN. </li><li> Usando um pequeno alfinete ou agulha de tungstênio fino, faça um pequeno furo raso na bainha ao redor da DVN, apenas posterior à STG. </li><li> Puxe a agulha através da DVN, dorsal para os axônios, para criar uma lágrima horizontal na bainha do nervo. </li><li> Agarre a retalho de bainha do nervo posterior à STG anteriormente e puxe para remover a bainha do lado dorsal do STG. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Abreviaturas: </td></tr><tr><td> STNS </td><td> Sistema nervoso Stomatogastric </td></tr><tr><td> STG </td><td> Gânglio Stomatogastric </td></tr><tr><td> CoG </td><td> Gânglio comissural </td></tr><tr><td> stn </td><td> nervo stomatogastric </td></tr><tr><td> mvn </td><td> ventricular nervo medial </td></tr><tr><td> íon </td><td> esofágico inferior do nervo </td></tr><tr><td> filho </td><td> nervo esofágico superiores </td></tr><tr><td> AGN </td><td> nervo gástrica anterior </td></tr><tr><td> DVN </td><td> nervo dorsal ventricular </td></tr><tr><td> lvn </td><td> nervo ventricular laterais </td></tr><tr><td> psn </td><td> nervo posterior do estômago </td></tr><tr><td> vpln </td><td> nervo posterior ventral lateral </td></tr><tr><td> pyn </td><td> nervo pilórica </td></tr><tr><td> pdn </td><td> nervo dilatador pilórica </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+interacting+central+pattern+generators+in+lobster+stomatogastric+ganglion%3A+influence+of+feeding+and+partial+pressure+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen.</a> J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).</li>
<li>Bierman, H. S., Tobin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+dissection+of+the+stomach+of+the+lobster%2C+Homarus+americanus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus%2C+Homarus+americanus+and+Panulirus+argus+%28Decapoda+crustacean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).</li>
<li>Herrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+American+lobster%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+U.S.+Bur.+Fish%22%5BJournal%5D)">Natural history of the American lobster.</a> Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generating+neurons+simultaneously+express+fast+and+slow+rhythmic+activities+in+the+stomatogastric+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion.</a> J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).</li>
<li>Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+channel+distribution+in+a+central+pattern+generator+neuron+by+neuromodulatory+inputs+revealed+by+decentralization+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture.</a> J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+channel+expression+in+identified+single+and+electrically+coupled+neurons+in+different+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals.</a> Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+profiling+of+identified+neurons+reveals+cell-specific+constraints+on+highly+variable+levels+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).</li>
</ol>

A anatomia do estômago lagosta e STNS tem sido bem descrita anteriormente 5,6, e as variações deste procedimento dissecção têm sido utilizados em numerosos estudos. Recomendamos familiarizar-se com a anatomia do estômago 5-7 e STNS 5,8 antes dissecções início. Essa familiaridade vai diminuir o risco de danos acidentais aos nervos e tecidos. Para manter a saúde da preparação, é fundamental para manter a preparação em uma temperatura baixa. Isso é facilmente alcançado através da troca de solução salina a cada 30 minutos com 4 ˚ C salina mantidos em uma geladeira. Quando imersos em solução salina fria, a preparação STNS isolada é viável para muitas horas. Gravações em gammarus relacionadas Homarus demonstraram atividade rítmica estável a partir do STG todo cinco dias in vitro 9; robustez semelhante foi visto em H. americanus (pers. obs.). Entrada modulatórios para o STG dos gânglios comissural é necessário para preservar os padrões motores em curso. Portanto, para manter uma atividade normal rítmica estes gânglios e do íon, filho, e os nervos stn deve ser mantida intacta. A dissecção descrevemos preserva vários nervos motores (que contém os axônios do neurônio motor): a s AGN (contendo moinho gástrico (GM) axônios), o mvn s (contendo Lateral gástrica (LG) e Inferior Cardíaca (IC) axônios), a s pyn (contendo Pilórica neurônio (PY) axônios), a s pdn (contendo Dilatador Pilórica (PD) axônios), e os s lvn (contendo Pilórica Lateral (LP), Gastric Medial (MG), os axônios de GLP, bem como os da GM, PD e PY). Dissecando adicionais (ou diferentes) os nervos, outras os axônios do neurônio motor pode ser registrado. Cada tipo individual de axônio do neurônio motor pode ser registrado individualmente por dissecação e gravação do nervo que inervam o músculo para que este tipo de projectos neurônio. Esta preparação pode ser usado para uma variedade de estudos focados em função do sistema nervoso. A atividade dos neurônios pode ser registada utilizando intracelular, gravações eletrodo afiada de somata ou axônios, ou por registro de impulsos elétricos dos nervos extracelularmente. Muitos canais iônicos dos neurônios STG ter sido parcialmente clonado e mRNA pode ser medido a partir somata manualmente puxado 10,11.

<table><tbody><tr><td>Fio Fino de Tungstênio (diâmetro de 0,001 pol.)</td><td>Ferramenta</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>Recortar em pedaços de 1-2 mm para usar como pinos finos.</td></tr><tr><td>Pinzas #5</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Minúsculas</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Moria (lâminas de 7 mm)</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td>Essas são as melhores disponíveis. Existem tesouras de mola mais econômicas oferecidas pela mesma empresa.</td></tr><tr><td>Placa de Petri (100x15 mm)</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>Encher com 2-4 mm de Sylgard 182.</td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>Outro</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>Suporte para Pinos</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Opcional. A dessheathação pode ser feita apenas com tesoura e pinças finas.</td></tr><tr><td>Pinças superfinas #5SF</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de Tungstênio</td><td>Ferramenta</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>Opcional. A dessheathação pode ser feita com tesoura ou com pinos recortados de fio fino de tungstênio.</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

homarus americanus stomatogastric dissecção do sistema nervoso

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Com o objetivo de entender como os sistemas nervosos produzem atividade e respondem ao ambiente, os neurocientistas vez para modelar sistemas que exibem a atividade de interesse e são acessíveis e passíveis de métodos experimentais. O sistema nervoso stomatogastric (STNS) da lagosta americana (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;; Também sabem foi a lagosta Atlântico ou Maine) foi estabelecida como um sistema modelo para estudar o ritmo de geração de redes e neuromodulação das redes. O STNS consiste de 3 gânglios anterior (2 gânglios comissural e um gânglio esofágico), contendo neurônios moduladores que o projeto central para o gânglio stomatogastric (STG). O STG contém aproximadamente 30 neurônios que compõem o padrão de duas redes de centrais de geração, as redes pilórica e gástricas que estão subjacentes comportamentos alimentares em crustáceos<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Embora seja possível estudar este sistema<i&gt; In vivo</i<sup&gt; 3</sup&gt;, O STNS continua a produzir a sua atividade rítmica quando isolados<i&gt; In vitro</i&gt;. Isolamento físico dos STNS em um prato permite fácil acesso ao somata nos gânglios para intracelular gravações eletrofisiológicas e para os nervos do STNS para gravações extracelular. Isolar o STNS é um processo em duas partes. A primeira parte, dissecando o estômago do animal, é descrito em um artigo de vídeo que acompanha<sup&gt; 4</sup&gt;. Neste artigo de vídeo, técnicas de dissecção fina são usadas para isolar o STNS do estômago. Este procedimento resulta em uma preparação do sistema nervoso que está disponível para as gravações eletrofisiológicas.

Descrevemos a dissecção fina do sistema nervoso stomatogastric do estômago da lagosta americana (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;).

Homarus Americanus Stomatogastric Dissecção do Sistema Nervoso

Com o objetivo de compreender como os sistemas nervosos produzem atividade e respondem ao ambiente, os neurocientistas recorrem a sistemas modelo que exibem a ...

O procedimento para isolar o sistema nervoso gástrico ST da lagosta pode ser dividido em duas partes: a dissecação grossa e a dissecação fina. Este vídeo aborda a dissecação fina do sistema nervoso gástrico somático a partir do estômago, incluindo o gânglio gastríco estomatogástrico, denominado STG, e os gânglios comissurais, denominados COGs. Essencialmente, os nervos e gânglios devem ser separados do tecido circundante, começando pelo isolamento dos COGs, seguido pelo isolamento do STG. O resultado deste procedimento é o sistema nervoso gástrico sistematicamente fixado em uma placa de Petri, pronto para ser utilizado em diversos estudos focados na função do sistema nervoso.Olá, sou Annalise Tobin do laboratório da Dra. Eve Martyr, do departamento de biologia da Universidade Brandeis. Olá, sou Hillary Burman, também do Laboratório Martyr. Hoje vamos mostrar um protocolo para isolar o sistema nervoso gástrico somático do estômago da lagosta Homarus americanus, a fim de observar como o estômago foi removido.Consulte nosso protocolo em vídeo no JoVE. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a função de neurônios em pequenos circuitos neurais na produção de comportamentos rítmicos. Então, vamos começar.Para começar, é necessária uma preparação do estômago de lagosta para observar como isso é realizado. Veja o vídeo acompanhante em que Beerman e Tobin primeiro orientam a placa de modo que a extremidade interna, próxima ao lábio, fique voltada para longe de você e a extremidade posterior fique voltada para você. Esta parte do procedimento começa com uma fixação mais precisa da preparação.Fixe o esôfago em cada lado do lábio e, se necessário, reorganize os outros alfinetes colocados durante a dissecação macroscópica para que o estômago fique plano. Em seguida, remova a hipoderme agarrando-a inicialmente próxima aos músculos gm, dois GM três, desprendendo-a desses músculos e puxando-a suavemente na direção anterior. Separe a hipoderme da gordura subjacente cortando quaisquer conexões, tomando cuidado com a artéria central, que envolve parte do sistema nervoso gástrico somático, mantendo a hipoderme intacta.A cerca de 0,5 centímetro de raio ao redor do gânglio gástrico somático, que está localizado entre os músculos GM um B, a hipoderme separada pode agora ser cortada. O próximo passo é destacar o cérebro do tecido subjacente. Comece identificando os dois grandes nervos comissurais que se projetam bilateralmente da porção anterior do cérebro até os gânglios comissurais na porção anterior do estômago.Deixando esses nervos intactos, levante suavemente o cérebro com pinça e corte para separar o cérebro do restante do tecido. Tenha cuidado ao fazer isso, pois o nervo gástrico somático está localizado sob o cérebro e deve ser mantido intacto. Para separar os gânglios comissurais do tecido circundante, localize-os primeiramente seguindo um dos nervos com até um gânglio.Agora identifique o nervo IO e o nervo SO. Esses nervos devem permanecer intactos. Cada gânglio comissural terá muitos nervos irradiando-se a partir dele.Corte a maioria deles, exceto o nervo ION e o SON. Deixe um nervo extra preso para manter o gânglio comissural no lugar enquanto você finaliza a dissecação. Agora localize e seccione os nervos do outro gânglio comissural da mesma maneira.Em seguida, limpe o NIO e o NSO de lateral para medial. Deixe o nervo labial intacto para ancorar a preparação ao estômago. O gânglio esofágico situa-se junto à interseção do iOS.Você pode liberar abaixo dela agarrando o nervo ventricular inferior e apontando para cima para cortar por baixo. O próximo passo é separar o STG do tecido circundante. O STG está localizado dentro de uma artéria que percorre entre os músculos GM um B e desce até os músculos GM dois a B.Procure a extremidade cortada da artéria próxima ao gm. Dois músculos AB puxam a artéria para cima e para a região interior para expor o DVN. Continue puxando para cima, até o hipoderma remanescente.Uma vez separada, a artéria pode ser aparada até o nível em que toca o hipoderma remanescente. Agora, corte o retalho muscular que estava situado no rostro do lagostim. Em seguida, levante o hipoderma acima da artéria.A artéria faz um túnel dentro da gordura. Acima do STG. Coloque uma lâmina da sua tesoura dentro da artéria e corte o músculo acima dela.Verifique se você consegue visualizar o DVN enquanto corta, para garantir que está seguro. Acima do STG, continue cortando anteriormente, seguindo a artéria. Ao cortar acima do STG, você será capaz de ver o STN se projetando anteriormente a partir do STG e descendo em direção ao músculo.Continue cortando anteriormente para separar completamente o músculo acima do STG. Remova qualquer tecido ao redor do STN. Agora podemos prosseguir para isolar vários outros nervos.Os próximos nervos a serem separados do tecido circundante são os NGA. Mesmo que você não pretenda realizar gravações a partir do NGA, será necessária uma porção dele para fixar o gânglio. Para visualizar melhor os NGA, remova o hipoderma remanescente e uma fina camada do músculo subjacente logo posterior ao GST.Procure um túnel escuro na gordura e no músculo em ambos os lados do bastão do nervo DVN, insira uma lâmina da tesoura dentro do túnel e corte o tecido acima do nervo. Continue cortando lateralmente, seguindo o nervo, para isolá-lo. Alguns milímetros são suficientes para prender o gânglio, mas exponha pelo menos cinco milímetros do GN A se planeja gravar a partir dele.Destaque um GN do músculo que ele inerva cortando as conexões. Em seguida, repita esse processo no outro lado para isolar o outro GN A. Após dissecar ambos os GNA, corte todos os músculos e tecidos que conectam o GST ao estômago. Em seguida, isole os vnm M.São um par bilateral de pequenos nervos que se ramificam do LVN e percorrem lateralmente sob a gordura. Use uma tesoura ou dois pinças para cortar a gordura em um dos lados do DVN próximo ao ponto onde ele se ramifica nos dois LVNs. Aqui, você estará distante do M VNS e não correrá o risco de cortá-los.Levante a camada de gordura e procure abaixo por um pequeno nervo. O VNS do músculo M corre lateralmente logo posteriormente ao nível dos músculos GM um B. Remova a camada de gordura acima do MVN, mantendo o nervo intacto por enquanto para que não se enrosque.Você cortará sua extremidade lateral e quaisquer inserções no M VNS ao final da dissecação do sistema nervoso. Repita o processo no outro lado para isolar o outro MVN. Em seguida, para isolamento, vêm os LVNs nos nervos posteriores.Começando com os ramos dos LVNs lateralmente a partir do DVN. Siga um LVN cortando a gordura acima dele. Dependendo do preparo, às vezes toda a camada de gordura acima do nervo pode ser removida.Continue expondo o NVP até o ponto onde o NSP se ramifica. Agora localize o NIP. É um nervo que se estende posteriormente sobre o poro.Remova a membrana fina que recobre esta região. Isole o PYN cortando uma pequena seção do pori ligada à lata do PYN. Em seguida, levante suavemente a seção pric e corte o tecido em ambos os lados do PYN até alcançar o ramo que se prende ao PDN.Prossiga com o isolamento do nervo PDNA que se estende posteriormente até o músculo dilatador da pric. Primeiro, corte uma pequena seção do músculo dilatador da pric ligada ao NPD. Em seguida, levante suavemente a seção do músculo dilatador da pric.Remova o tecido em ambos os lados do NDP até alcançar o ramo que se liga ao NYP. Agora localize o LVN ventral que conecta o NYP e o NDP ao LVN no ponto de bifurcação triangular onde o NYP e o NDP se ligam ao LVN ventral. Isole qualquer pequeno segmento de nervo que se ramifica do LVN ventral, como o NLPV. Este será usado como uma alça para puxar o LVN ventral, levantando a alça.Remova o tecido em ambos os lados do LVN ventral, trabalhando no sentido anterior até alcançar o ponto onde o PSN se ramifica. Agora você isolou com sucesso os nervos posteriores em um lado do estômago. Em seguida, isole o LVN e os nervos posteriores no outro lado.Desprenda completamente o LVN do estômago. Puxe o PSN e corte todos os tecidos e nervos ligados ao LVN e ao LVN ventral, exceto o PDN e o PYN. Repita este processo do outro lado.Em seguida, corte a extremidade lateral de cada MVN. Levante a extremidade lateral e corte quaisquer conexões com o MVN na extremidade anterior. Corte quaisquer conexões com os gânglios comissurais e corte o nervo labial de cada lado.Examine visualmente o sistema nervoso gástrico somático para identificar e, em seguida, cortar quaisquer ligações adicionais ao tecido gástrico. E, uma vez que tenha cortado todas as conexões, será capaz de segurar a extremidade anterior de ambos os nervos comissurais acima dos gânglios comissurais e destacar o sistema nervoso gástrico somático do estômago, movendo-o para o lado da placa. Ao fazer isso, corte quaisquer ligações adicionais para liberar o sistema nervoso.A dissecação está agora completa. Comece preparando o prato Söderberg no qual o sistema nervoso será fixado. Esfregue cuidadosamente algum tecido gástrico sobre a superfície do prato Söderberg no recipiente pequeno.Isso diminuirá a hidrofobicidade do prato de agar para que a solução salina se distribua uniformemente sobre o prato. Enxágue e preencha o prato de agar com solução salina gelada. Transfira o sistema nervoso para o prato de agar preparado, segurando as extremidades anteriores de ambos os nervos comissurais.Levantar o sistema nervoso para fora do recipiente grande e colocá-lo no recipiente pequeno. Para fixar o sistema nervoso, utilize uma combinação de pinos de minutia e pinos mais finos. Corte primeiramente o fio de tungstênio e certifique-se de que a preparação está com o lado dorsal voltado para cima, verificando se o nervo ventricular inferior está apontando para longe da guarda sial. Agora remova o cérebro e fixe os nervos comissurais. Puxe suavemente o sistema nervoso esticado e plano, puxando cada um dos nervos PSN posterior e lateralmente e fixando-os com alfinetes. Em seguida, remova o músculo dilatador do PNS e fixe esses nervos.Em seguida, remova o segmento pilórico dos GYNs e fixe os GYNs. Por último, fixe quaisquer nervos isolados remanescentes, como os nervos labiais, os m vns e os AGNs. O próximo passo é desserrar o S st.Primeiro, certifique-se de que o S st G está plano contra a proteção S e firmemente segurado pelos AGNs laterais. O STN anterior e o DVN posterior organizam a iluminação para permitir a visualização dos axônios dentro do DVN. Em seguida, utilizando um pequeno pino ou uma fina agulha de tungstênio.Faça um pequeno orifício raso na bainha que envolve o nervo DVN, logo posterior à área STG. Puxe a agulha através do nervo DVN corado dorsalmente aos axônios para criar um rasgo horizontal na bainha do nervo. Agora, segure uma prega da bainha nervosa posterior à área STG e puxe-a anteriormente, cortando-a para remover a bainha do lado dorsal da STG.Uma vez removida a bainha, o preparo está pronto para experimentação, desde que seja mantido frio entre aproximadamente quatro e 15 graus Celsius. Observou-se que este preparo permanece experimentalmente estável por até cinco dias. O sistema nervoso gástrico Sato intacto deve ser fixado em forma de T contra a placa de guarda Syl.Como mostrado, os nervos devem estar livres de danos e acessíveis para gravações extracelulares. Os corpos celulares do STG intacto devem ser visíveis e acessíveis para gravações intracelulares. Acabamos de mostrar como isolar o sistema nervoso gástrico somático da lagosta Homa Americana.Ao realizar esta dissecação, é importante tornar-se muito familiarizado com a anatomia para evitar danificar qualquer tecido ou nervo. Além disso, é fundamental manter o preparo em uma temperatura fria, entre quatro e 15 graus Celsius. Isso pode ser facilmente alcançado durante a dissecação trocando a solução salina a cada meia hora por salina fria mantida no refrigerador a quatro graus Celsius, quando o preparo deve permanecer resfriado.É viável por horas até dias. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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