Name: Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: Aprenda a identificar proteínas que interagem com o C-terminal do receptor P2X2 usando ensaio de pull-down com GST e espectrometria de massas em lisado de cérebro de rato. Este protocolo avança a compreensão da sinalização de receptores P2X.

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SW e TMV são suportados pelo NCRR NHLBI e no National Institutes of Health. BSK e HS são suportados pelo NINDS e NIGMS do National Institutes of Health.

Procedimentos experimentais O procedimento experimental (Fig. 2) consiste em quatro partes que são descritas em uma maneira passo a passo abaixo. Parte 1: subclonagem e expressão do C-terminal de P2X2 receptores. Nós expressamos o comprimento total C-terminal de receptores P2X2 em bactérias para identificar as proteínas do cérebro para que ele se liga. <ol><li> O C-terminal (resíduos 353-472) do receptor P2X2 (Fig. 1) foi amplificado por PCR, clonados em pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) e verificadas com o seqüenciamento. </li><li> O plasmídeo recombinante foi transformado em E. Coli (BL21) para a expressão de proteínas recombinantes. </li><li> Stocks de glicerol de bactérias (E. coli BL21) contendo o P2X2 CT-GST plasmídeo foram raspadas com uma ponteira de pipeta estéril e inoculadas em 5 ml de Luria-Bertani (LB) de mídia com marcador seletivo adequado (50 g / ml ampicilina) e incubadas durante a noite em um agitador orbital em 37C. </li><li> As culturas cresceram durante a noite foram inoculadas em 250 ml de mídia LB com um antibiótico adequado (50 mg / ml ampicilina) e incubados em agitador orbital a 250 rpm por 2-3 horas a 37C, até a densidade óptica a 600 nm chegou ~ 0,6-0,7. </li><li> A cultura foi induzida com 1 mM de IPTG e ainda incubados a 37 ° C por 3 horas para a expressão da proteína. </li><li> A cultura foi então centrifugada a 5000 g por 15 min a 4C (1 ml da cultura foi salvo para analisar o nível de expressão e rotulados como &quot;induzida&quot;). Sobrenadante foi descartado eo pellet foi ressuspendido em 20 ml de solução salina Tris-EDTA (STE) tampão (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0). </li><li> A suspensão foi centrifugada a 5000 g por 15 min em um tubo falcon 50 ml. O sobrenadante foi descartado eo pellet semi-seco foi congelado a-70C durante a noite. </li><li> A-70C pellet foi ressuspendido em 40 ml de tampão de lise de gelo frio (2% (w / v) sarkosyl, 15 mg de lisozima, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM DTT e comprimido inibidor da protease completa) , ea suspensão foi incubada em gelo por 30 min. Durante esta incubação, 3 ml contas Glutationa-Sepharose 4B foram lavados com 20 ml de tampão fosfato salina (PBS) e 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) tritonX-100 em PBS), seguida por PBS. As contas foram ressuspendidos em 1 ml de PBS. </li><li> A suspensão bacteriana foi freeze-descongeladas três vezes em nitrogênio líquido e sonicado (1s on / off, 30 microns por 3 min no gelo) e incubadas por mais 30 minutos com 4% (v / v) de triton X-100, 10 mM MgSO 4 e 2 mM ATP no gelo. </li><li> O lisado foi centrifugado a 20.000 g por 15 min a 4C e pellet foi descartado (a amostra de pellet e 1 ml do sobrenadante foi guardado para página SDS para testar as quantidades de proteínas no citoplasma e membranas). O sobrenadante foi incubado com as contas para 1 hr (ou noite) em 4C. </li><li> As contas eram girado em 500 g por 5 min eo sobrenadante foi descartado (amostra foi salvo para a fração não ligada). As pérolas foram lavadas cinco vezes com T-PBS (lavagens foram salvos para controles de lavagem). </li><li> As pérolas foram então ressuspendidas em PBS para dar 50% (w / v) O chorume e armazenados em geladeira a 4C até o uso. A concentração de proteína foi estimada pelo ensaio de Bradford (por instruções do fabricante). </li></ol> Parte 2: Preparação do lisados ​​cérebro inteiro P2X2 receptores são conhecidos por serem abundantemente expressa no cérebro 8. Na análise presente, buscou-se identificar as proteínas que interagem com receptores P2X2 de lisados ​​rato todo cérebro (Fig. 3). <ol><li> Cérebro de rato adulto foi colhida (animais foram sacrificados de acordo com um protocolo de UCLA IAACUC-aprovado e de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório) e imediatamente lavados gelada PBS (3X). </li><li> Para lisar as células 10 ml (~ 5 vezes o peso úmido do cérebro colhida) de gelo lise frio contendo 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 5 mg / ml de leupeptin, 1% (v / v) NP-40, e uma protease tablet cocktail inibidor foi adicionado ao cérebro colhida. </li><li> Tecido cerebral foi homogeneizado em gelo com um homogeneizador de Dounce vidro até uma mistura de consistência homogênea foi alcançado. </li><li> Lisado celular foi centrifugado a 2000 g por 5 minutos para remover as células ininterrupta. O sobrenadante foi coletado e girou novamente a 29.000 g por 60 minutos para remover organelas intactas e agregados membrana. </li><li> Imediatamente após a centrifugação o sobrenadante foi transferido para um tubo limpo. A concentração de proteína do cérebro inteiro lisado foi medida por ensaio de Bradford (normalmente ~ 15 mg / ml). </li><li> O lisado foi aliquotado e armazenado a-70C. </li></ol> Parte 3: Isolamento de P2X2 C-tail proteínas associadas Para identificar os parceiros de ligação de P2X2 CT-GST de lisados ​​cérebro inteiro, um pull down ensaio foi realizado usando CT-GST imobilizada em esferas de glutationa sepharose 4B como isca. Para controles, GST sozinho ligada a grânulos foi usado. <ol><li> Cérebro lisado foi contas devem ser pré-GST para 1 hora a 4C. O pellet foi descartado eo sobrenadante foi usado para análises posteriores. </li><li> Quantidades iguais de GST e P2X2 CT-GST (10 mg) obrigado a glutationa sepharose 4 contas B foram incubadas durante a noite com 100 g de proteínas solubilizadas precleared de rato lisado cérebro inteiro, com rotação de 4C no tampão de lise. </li><li> Contas foram centrifugada a 1000 g por 5 min eo sobrenadante foi descartado. </li><li> As pérolas foram lavadas uma vez com o tampão de lise e cozido em modificadas Laemli buffer [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-mercaptoetanol, 2% (v / v) de glicerol, 0,004% (w / v) de azul de bromofenol e 0,125 M pH 6,8 TrisCl] por 5 min. </li><li> As amostras foram girados em 5000 g por 5 min eo sobrenadante separado por 10% SDS-PAGE (Fig. 4). Géis foram corados com SYPRO gel de proteínas de Ruby mancha (de acordo com as instruções do fabricante) e visualizado sob luz ultravioleta. P2X2 CT-proteínas associadas foram comparados com aqueles recuperados usando GST nulo como isca. Quatro réplicas biológicas foram realizadas (ou seja, quatro cérebros e quatro downs puxar independentes). </li></ol> Parte 4: Identificação de proteínas. Proteínas separadas por eletroforese em gel foram excisados ​​do gel e identificados por espectrometria de massa 12. Nota: ausência de poeira ao longo do processo é fundamental para reduzir a contaminação de queratina. O experimentador deve usar uma máscara facial, rede de cabelo e luvas em todos os momentos e nunca toque na região gel de interesse sem o uso de luvas. <ol><li> Todas as bandas de proteínas visíveis recuperou a força para baixo P2X2 foram excisadas com uma lâmina de barbear limpo e picado (Fig. 4). Regiões correspondentes do gel na GST nulo pull down lane também foram excisadas da mesma forma sem levar em conta a coloração da banda (bandas específicas para a isca GST nulo também foram retirados e identificados) para garantir que a presença de proteínas abaixo do nível da sensibilidade a marcação não foi desperdiçada. </li><li> As peças gel foram incubadas com 200 mL de bicarbonato de amônio 50 mM em 50% (v / v) acetonitrila (ACN) e os tubos agitadas por 15 min em temperatura ambiente. Repita este passo de lavagem. </li><li> As peças foram desidratadas gel pela adição de 200 mL de acetonitrila (peças gel deve encolher e tornar-se opaco na cor). </li><li> Acetontrile foi removido e as peças em um gel seco speedvac para ~ 10 min. </li><li> As peças gel foram incubadas com 30 mL do recém-preparada 10 mM mM Tris DTT/10 (2-carboxi-etílico) fosfina cloridrato (TCEP) de volume suficiente para mergulhar as peças. Isso foi deixado por 30 min em banho-maria 56C. </li><li> Em seguida a solução de DTT foi substituído por 100 l de bicarbonato de amônio 500 mM em solução de acetonitrila 50% e as fatias de gel lavado com bicarbonato ammounium. </li><li> A solução de lavagem foi aspirado e 200 mL de acetonitrila adicionado ao desidratar o gel. </li><li> Acetonitrila foi então removido e 100 l preparada solução a 100 iodoacetamida mM foi adicionado em alquilação sulfhydryls livre. Esta etapa começou há 25 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Solução iodoacetamida foi removido e as peças gel foram lavadas com 200 mL de bicarbonato de amônio 50 mM em acetontrile 50% (pH 8,0) por 2 min, enquanto vórtex. Esta etapa de lavagem foi repetido. </li><li> Após a remoção da solução de lavagem, as peças gel foram incubadas com 200 mL de acetonitrila que foi retirado por speedvac por ~ 10min. </li><li> Nesta etapa as peças gel está pronto para a digestão de tripsina. Pedaços de gel foram incubadas em 30 mL de solução de tripsina (20 concentração ng / mL de trabalho) e colocado em gelo por 10 min para o gel de ser bem inchado. Tripsina excesso foi removido e reidratados partículas de gel revestida com 30 mL com 50 mM de bicarbonato de amónio para mantê-los imersos durante a digestão que foi autorizado a prosseguir por 12 a 16 horas a 37C. </li><li> Cinco mL de 5% (v / v) ácido fórmico é adicionado para desativar a digestão com tripsina e prisão. </li><li> Tubos foram agitadas para ~ 15 min e centrifugado brevemente para levar o líquido até o fundo do tubo, que foi então transferido para um frasco limpo e rotulado ml 0,5. </li><li> ML 30 próxima de 0,1% (v / v) de ácido fórmico em acetonitrila 50% foi adicionado em pedaços gel que eles eram apenas cobertos seguido por vórtex duas vezes por 10-15 min, separado por centrifugação breve. Este passo foi repetido uma vez, substituindo o ácido fórmico e acetonitrilo entre as etapas. </li><li> O líquido final foi removido e toda a solução de extração combinados em um único frasco. Este volume foi reduzido para ~ 30 uL na speedvac. A amostra foi agora pronto para cromatografia de fase reversa nano-líquidos e identificação de proteínas por espectrometria de massa. Neste exemplo específico, esta etapa é realizada em um espectrômetro de massa Orbi-trap conjunto de ThermoFIsher (escolhido pela sua precisão massa elevada, ciclo de trabalho rápido para detecção da proteína e, geralmente, características operacionais robustos), embora outros modelos e instrumentos de fabricantes poderiam facilmente ser conjugada com a abordagem descrita para este ponto. </li><li> Os detalhes e critérios para análises de espectrometria de massa são brevemente apresentados. Todos os peptídeos foram separados por fase reversa nano-LC (Eksigent) e peptídeos foram carregados em uma coluna de fase reversa C18 a uma vazão de 3 mL / min. A fase móvel foi de 0,1% de ácido fórmico e ACN 2% da água; B da fase móvel foi de 0,1% de ácido fórmico e 20% de água em ACN. Peptídeos foram eluídos da coluna a uma vazão de 220 nl / min utilizando um gradiente linear de 5% para B B 50% mais de 90 min, e depois a B 95% mais de 5 min, e, finalmente, manter B constante de 95% por 5 min . Espectros foram adquiridos em data-dependente com o modo de Orbi armadilha utilizada para scans MS e LTQ para MS / MS scans. Peptídeos foram identificados através de pesquisa os espectros no banco de dados de rato IPI v.3.53 usando o algoritmo SEQUEST integrado no pacote de software Bioworks. Cada peptídeo preencheram os seguintes critérios: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (2), ≥ 4 (+3), e DeltaCN&gt; 0,1. Todos os espectros utilizados para identificação de proteínas foram inspecionadas manualmente e sem proteínas aceitos quando menos de dois peptídeos foram identificados. Proteínas presentes apenas seguir cada um dos quatro downs P2X2 puxar e ausentes durante downs GST nulo pull foram considerados para análises posteriores. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Representação esquemática de um receptor P2X2 subunidade. A. O desenho ilustra a topologia de uma subunidade do receptor P2X2. O domínio citosólico consiste em N e C termini. O C-terminal do receptor P2X2 (vermelho) foi usado como isca para puxar para baixo ensaio. B. seqüência de aminoácidos do receptor P2X2 C-terminal utilizado neste estudo. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> Figura 2. Fluxograma e linha do tempo do protocolo utilizado para a expressão, purificação, puxar para baixo e identificação de proteínas. Mostramos o esboço do protocolo com a linha do tempo. Lisado de cérebro de rato adulto foi preparado fresco imediatamente antes do uso para a puxar para baixo os ensaios. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> Figura 3. Representação esquemática da análise proteômica de binário P2X2 rede C-terminal no cérebro de ratos. O C-terminal de receptores P2X2 em fusão com GST proteína ligada a grânulos GST foi utilizada para puxar para baixo os ensaios. Lisado cérebro foi preparado e proteínas foram incubadas com as proteínas recombinantes imobilizado. Fracção livre foi lavado com o tampão de lise. Proteínas foram identificadas por espectrometria de massa. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> Figura 4. Identificação dos parceiros de ligação do C-terminal de P2X2 receptores. Sypro gel corado mostrando um espectro de proteínas putativas que interagem com o C-terminal dos receptores de fusão com GST (caixa azul). Controles pistas para GST sozinho (caixa amarela) e glutationa sepharose contas sozinhos também são mostrados. As setas indicam exemplos de bandas de originais que foram excisadas para posterior análise por espectrometria de massa.

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</ol>

Canais iônicos são uma classe importante de proteínas da membrana integral. Eles contêm poros cheios de água que, seletivamente, permitir o movimento de íons para baixo suas gradientes eletroquímicos através da membrana plasmática. Ion portão canais entre os estados aberto e fechado. A etapa de propagação é desencadeada por transmissores (por exemplo, ATP) em caso de ligante P2X canais iônicos fechado, ou pode ser regulada por interações com outras proteínas. A última década testemunhou um aumento na nossa compreensão d...

<table><tbody><tr><td>Acetonitrila</td><td>Reagente</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Reagente</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Reagente</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Reagente</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Peroxissulfato de Amônio (APS)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina Trifosfato (ATP)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>reagente de Bradford</td><td>Reagente</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Commassie R-250</td><td>Reagente</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Reagente</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Etileno Glicol Tetraacético (EGTA)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutatião Sepharose 4B</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Meios Luria-Bertani (LB)</td><td>Reagente</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio (MgSO₄)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio (NaCl)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio (NaF)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Vanadato de Sódio (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Reagente</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonilfluoreto (PMSF)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido de inibidor de protease</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de proteína </td><td>Reagente</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Reagente</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>Frasco com tampa rosqueável</td><td>Ferramenta</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO&amp;#174; Corante para gel de proteínas Ruby</td><td>Reagente</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,&amp;rsquo;-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Reagente</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td>Reagente</td><td>Burdick &amp;& Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>espectrômetro de massas tandem LTQ-Orbitrap</td><td>Ferramenta</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Cromatografia Líquida em Nanoescala</td><td>Ferramenta</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

proteômica para identificar proteínas interagindo com p2x2 canais ligand-gated cation

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Canais de íon-ligante gated subjacentes comunicação sináptica no sistema nervoso 1. Nos mamíferos existem três famílias de ligante-gated canais: o laço cys, o glutamato-gated e os canais do receptor P2X 2. Em cada caso de ligação do transmissor leva à abertura de um poro através do qual os íons fluem seus gradientes eletroquímicos. Muitos ligand-gated canais também são permeáveis ​​aos íons de cálcio 3, 4, que têm a jusante de sinalização papéis 5 (por exemplo, regulação de genes) que podem exceder a duração da abertura do canal. Assim ligand-gated canais pode sinalizar em escalas de tempo amplo que vão desde alguns milissegundos até dias. Tendo em conta estes papéis importantes é necessário entender como ligante-gated canais iônicos em si são regulados por proteínas, e como essas proteínas podem sintonizar sinalização. Estudos recentes sugerem que muitos, senão todos, os canais podem ser parte de complexos de proteínas de sinalização 6. Neste artigo vamos explicar como identificar as proteínas que se ligam aos aspectos C-terminal do domínio receptor P2X2 citosólica. Receptores P2X são canais ATP-gated educação e composto por sete subunidades (P2X1-P2X7). Receptores P2X são amplamente expressa no cérebro, onde eles medeiam a transmissão sináptica excitatória e facilitação pré-sináptica da liberação de neurotransmissores 7. Receptores P2X são encontrados em células excitáveis ​​e não excitáveis ​​e mediar papéis-chave na sinalização neuronal, inflamação e função cardiovascular 8. P2X2 receptores são abundantes no sistema nervoso 9 e são o foco deste estudo. Cada subunidade P2X é pensado para dois segmentos possuem membrana estendida (TM1 e TM2) separados por uma região extracelular 7 e N intracelular e C termini (Fig 1a) 7. Subunidades P2X 10 (P2X1-P2X7) mostram homologia de seqüência de 30-50% no nível de aminoácidos 11. Receptores P2X conter somente três subunidades, que é o mais simples estequiometria entre os receptores ionotrópicos. O P2X2 C-terminal consiste de 120 aminoácidos (Fig 1b) e contém várias proteínas sites de consenso docking, apoiando a hipótese de que P2X2 receptor pode ser parte de complexos de sinalização. No entanto, embora várias funções foram atribuídas ao C-terminal de receptores P2X2 9 nenhum estudo descreveu os parceiros molecular que o casal para o lado intracelular desta proteína através do comprimento total C-terminal. Neste trabalho métodos que descrevem uma abordagem proteômica para identificar as proteínas que interagem com o comprimento total C-terminal de P2X2 receptores.

Nós descrevemos um protocolo simples para identificar proteínas cerebrais que se ligam ao terminal de todo o comprimento C da ATP-gated P2X2 receptores. A extensão e aplicação sistemática desta abordagem para todos os receptores P2X deverá levar a uma melhor compreensão da sinalização do receptor P2X.

Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation

Canais iônicos dependentes de ligante fundamentam a comunicação sináptica no sistema nervoso1. Em mamíferos, existem três famílias de canais dependentes de ligante: os cys ...

Este procedimento começa com a superexpressão da extremidade C recombinante do receptor Puric P dois X ou P dois X dois, produzido como uma proteína de fusão GST após a lise bacteriana. A proteína purificada é incubada com perlas de glutationa seros quatro B, e sua concentração é determinada pelo método de Bradford. Em seguida, proteínas provenientes de lisado de cérebro de rato purificado são incubadas com a extremidade C dos receptores P dois X dois ligada à glutationa, perlas seros, e os complexos proteicos ligados à extremidade C dos receptores P dois X dois são isolados por meio de eletroforese em gel SDS-PAGE, excisão do gel, e identificados por espectrometria de massas.Olá, sou Harpring do laboratório do Departamento de Fisiologia JIT K da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Olá, sou Sarah Walburn do laboratório de Tom Vka do Departamento de Anestesiologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Hoje vamos mostrar o procedimento para isolar e purificar os CTS dos receptores P dois X dois.Utilizamos essas proteínas para identificar o in a partir do cérebro vermelho e, em nosso laboratório, utilizamos essas proteínas para estudar as consequências funcionais nos receptores P dois X dois. Então, vamos começar. O domínio citosólico do receptor P dois X dois consiste nas extremidades N e C.A extremidade C do receptor P2X2 será usada como isca no ensaio de co-imunoprecipitação, conforme também mostrado na sequência da extremidade C do receptor P2X2 utilizada para este estudo de interação. Para expressar a extremidade C completa dos receptores P2X2, utilize técnicas convencionais de biologia molecular para integrar a sequência codificadora da extremidade C do receptor, resíduos 353 a 472, em um plasmídeo pGE-X4-NT1.O plasmídeo recombinante é então transformado em cepa de e coli BBL 21 para expressão. As bactérias contendo o plasmídeo recombinante são cultivadas em LB a 37 graus Celsius. Quando a densidade óptica do cultivo em 600 nanômetros estiver entre 0,6 e 0,8.Induza o cultivo com um milimolar de IPTG e incube por três horas a 37 graus Celsius. Quando a incubação de três horas terminar, retire uma alíquota de um mililitro do cultivo e guarde para análise posterior. Centrifugue o restante do cultivo a 5.000 Gs por 15 minutos a quatro graus Celsius, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 20 mililitros de tampão salino tris EDTA. Transfira o pellet ressuspenso para um tubo cônico de 50 mililitros.A suspensão deve agora ser centrifugada a 5.000 Gs durante 15 minutos para coletar o pellet semisseco, que é congelado a menos 70 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, re-suspenda o pellet congelado em 40 mililitros de tampão de lise gelado e coloque no gelo por 30 minutos enquanto o pellet re-suspenso permanece no gelo. Prepare três mililitros de perlas de glutatião S-sefarose 4B.Primeiro, lave as esferas com 20 mililitros de PBS e 20 mililitros de TPBS. Em seguida, lave as esferas com PBS puro e re-suspenda-as em um mililitro de PBS. A suspensão bacteriana no tampão de lise é agora congelada e descongelada com nitrogênio líquido.A amostra congelada foi incubada em gelo para descongelar e novamente purgada em nitrogênio líquido. Este passo foi repetido três vezes. Em seguida, sonique a suspensão de congelamento-descongelamento em gelo.Após a sonicação, incubar a suspensão bacteriana com uma solução contendo 4% Triton X-100, sulfato de magnésio 110 milimolar e ATP 2 milimolar durante 30 minutos em gelo. Em seguida, centrifugar o lisado a 20.000 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius e guardar o sobrenadante. Antes de descartar o pellet, coletar uma pequena amostra do pellet com sobrenadante para analisar as proteínas no citosol e nas membranas.Incube o sobrenatante com as microesferas por uma hora ou durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, centrifugue as microesferas a 500 Gs por cinco minutos. Descarte a maior parte do sobrenatante, mas conserve uma pequena amostra para representar a fração de proteínas não ligadas. Lave as microesferas sedimentadas cinco vezes com 25 mililitros de TPBS, conservando um pouco de cada lavagem para os controles de lavagem.Por fim, ressuspenda as microesferas em PBS para obter uma suspensão de 50% peso por volume e armazene a quatro graus Celsius. A concentração proteica pode ser estimada utilizando o ensaio de Bradford conforme as instruções do fabricante e espera-se que seja de 500 microgramas por mililitro. Para identificar os parceiros de ligação de P dois X dois CT GST a partir de lisados totais de cérebro, realiza-se um ensaio de precipitação usando CT GST imobilizada em microesferas revestidas com glutationa como isca, utilizando um controle.Use GST isolado ligado a perlas como isca, doravante referido como o GST Knoll Rat Brainin em lisado. Para o ensaio de ligação de proteína de fusão GST, foi utilizado um protocolo padrão com tampão de lise, e a concentração proteica foi estimada em 15 miligramas por mililitro pelo ensaio de Bradford. Antes de iniciar o ensaio.Pré-limpe o lisado de cérebro descongelado incubando-o com 30 microlitros de perlas GST por uma hora a quatro graus Celsius após o lisado ter sido incubado com as perlas GST. Centrifugue as perlas a 1000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Guarde o sobrenadante e mantenha um pequeno volume dele como controle.Agora, calcule o volume do lisado que deve conter 100 microgramas da proteína solubilizada pré-limpa e combine esse volume de lisado com 10 microgramas de perlas ligadas ao GST e 10 microgramas de perlas ligadas ao GST P2X2CT. Complete o volume até 200 microlitros utilizando tampão de lise. Incube o lisado com as perlas durante a noite em um rotador a quatro graus Celsius.No dia seguinte, centrifugue as esferas a 1000 Gs durante cinco minutos e descarte o sobrenadante. Lave as esferas três vezes com um mililitro de tampão de lise. Em seguida, adicione 50 microlitros do tampão lely modificado às esferas e ferva as esferas neste tampão por cinco minutos.Centrifugue as amostras fervidas a 5.000 ×g por cinco minutos e carregue o sobrenadante duvidoso em um gel de SDS-PAGE 10%. Compare as proteínas associadas ao P2X2CT com aquelas recuperadas utilizando a isca GST Nola. O passo final e crítico da análise é remover as proteínas separadas do gel para identificação por espectrometria de massas a partir deste ponto.A ausência de poeira durante todo o processo é essencial para reduzir a contaminação por queratina. Comece cortando as bandas do gel com uma lâmina de barbear limpa. Em seguida, pique as bandas em três seções menores e coloque cada banda em um tubo de microcentrífuga rotulado, correspondendo às regiões do gel na GST.Uma faixa sem marcação também deve ser removida da mesma maneira, sem considerar a coloração da banda. Para garantir que proteínas abaixo do limite de sensibilidade da coloração não sejam perdidas, misture os pedaços de gel com 200 microlitros de bicarbonato de amônio 50 milimolar e acetonitrila a 50% volume por volume, em seguida vortexe os tubos por 15 minutos à temperatura ambiente.Após vórtex, remova a solução de lavagem e repita. Remova a última solução de lavagem e desidrate os pedaços de gel adicionando 200 microlitros de acetonitrila. Os pedaços de gel devem encolher e tornar-se opacos na cor.Em até dois minutos, remova a acetonitrila e seque os fragmentos de gel. Em seguida, usando uma centrífuga a vácuo por 10 minutos, os fragmentos de gel secos são incubados em uma solução recém-preparada de DTT 10 milimolar e TEP 10 milimolar. O volume da solução, geralmente cerca de 30 microlitros, deve ser suficiente para imergir completamente os fragmentos de gel.Deixe os fragmentos de gel serem reduzidos na solução por 30 minutos em um bloco térmico a 56 graus Celsius. Em seguida, remova a solução de DTT TEP e substitua por uma solução de lavagem contendo 100 microlitros de bicarbonato de amônio 500 milimolar em 50% de acetonitrila, vortexie por 10 minutos; após a vortexagem, aspire a solução de lavagem com bicarbonato de amônio e substitua por 200 microlitros de acetonitrila para desidratar os fragmentos de gel. Os fragmentos de gel devem encolher e tornar-se opacos em cor dentro de dois minutos.Próximo à alquilação, quaisquer tióis livres, substitua o acetonitrila por 100 microlitros de solução recém-preparada de 100 milimolar de acetamida IOTO. Incube esta mistura por 25 minutos à temperatura ambiente no escuro. Após a incubação, remova a solução de acetamida IDO e lave os pedaços de gel com 200 microlitros de bicarbonato de amônio 50 milimolar e 50% de acetonitrila, agitando em vórtex por cinco minutos.Este passo de lavagem é repetido uma vez. Remova a última solução de lavagem e incube os fragmentos de gel em 200 microlitros de acetonitrila por 10 minutos. Remova a acetonitrila e seque as amostras no speed vac.Nesta etapa, os fragmentos de gel estão prontos para a digestão com tripsina. Adicione 30 microlitros de solução de tripsina numa concentração de trabalho de aproximadamente 20 nanogramas por microlitro e incube no gelo durante 10 minutos.Os pedaços de gel devem ficar bem inchados. Remova a solução em excesso de tripsina e imerja as partículas de gel reidratadas em 30 microlitros de bicarbonato de amônio 50 milimolar. Deixe a digestão prosseguir por 12 a 16 horas a 37 graus Celsius após a digestão prolongada com cinco microlitros de ácido fórmico 5% para desativar a tripsina e interromper a digestão.Em seguida, vorte as tubos por 15 minutos; após a vortexação, centrifugue brevemente os tubos para levar o líquido ao fundo do tubo e transfira esta solução contendo os peptídeos digeridos para um tubo de meio mililitro limpo e rotulado. A seguir, cubra os pedaços de gel com cerca de 30 microlitros de solução de extração contendo 0,1% de ácido fórmico em 50% de acetonitrila e vorte por 10 a 15 minutos. Adicione esta solução de extração ao novo tubo de meio mililitro.Repita este passo. Transfira a solução de extração para o novo tubo de meio mililitro; reduza no evaporador rotativo (speed vac) o tubo de meio mililitro contendo a solução de digestão noturna e as duas soluções de extração a aproximadamente 30 microlitros. Esta solução peptídica está agora pronta para análise por LC-MS-MS.Se pare os proteínas por cromatografia líquida nano em fase reversa, utilizando uma coluna C18 de fase reversa, adquira espectros em modo dependente de dados com o orbitrap usado para varreduras MS e o LTQ para varreduras MS/MS. Identifique as proteínas pesquisando os dados contra o banco de dados IPI de rato utilizando o algoritmo Sequest integrado ao pacote de software Bioworks, e em seguida inspecione manualmente os espectros apenas das proteínas presentes em cada uma das quatro réplicas de amostra e ausentes durante o controle GST. Nenhum ensaio de precipitação deve ser considerado para análises adicionais.Aqui está o gel da coloração com Cipro mostrando um espectro de proteínas putativas que interagem com a extremidade C-terminal dos receptores P dois X dois. Fundido com GST, indicado pela caixa azul, e controles para GST isolado, indicados pela caixa amarela, e glutationa. Esferas de sepharose isoladas também são mostradas.As setas indicam exemplos de bandas únicas que foram cortadas para análise adicional por espectrometria de massas. Acabamos de mostrar como expressar e purificar os CTOs de receptores P dois X dois. Também mostramos como realizar o ensaio de precipitação com ácido e identificar os interatores proteicos.É importante lembrar, ao realizar este procedimento, que você deve usar luvas e touca para reduzir a contaminação por queratina em suas amostras. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.

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