Name: Cell-ES derivadas Neuroepiteliais culturas de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprenda a derivar precursores neuroepiteliais de células ES usando atividade indutora derivada de células estromais. Este método avança a engenharia de tecido neural e a compreensão do desenvolvimento cerebral.

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Passo 1 <ol><li> Placa de mitomicina-C ggrowth inibido (10 mcg / ml para 2,5 horas) MS5 células a uma densidade de 70 mil / cm2 em gelatina-revestido (0,01% por 30 minutos) 6 pratos bem em α-MEM mídia. </li><li> Quando as células são inscritos e formaram uma monocamada (sobre o crescimento noite), mude para SRM. </li><li> Manualmente isolar colônias de células ES de culturas de células ES usando uma seringa com uma agulha de 27 ½ G. </li><li> Tritrurate as colônias cuidadosamente com uma ponta de 1 ml azul e placa em baixa densidade na MS5 células (geralmente 2-3 colônias por 6 placa bem). </li></ol> Nota: As células-tronco embrionárias também podem ser tomadas a partir de propagação enzimática utilizando colagenase ou tripsina. Passo 2 <ol><li> Cultivar as células ES na MS5 alimentadores de 14-21 dias até roseta contendo formam colônias. </li></ol> Nota: Alterar mídia com freqüência. O rosetas são geralmente nas bordas exteriores das colônias e sua formação pode ser muito maior se Noggin 300-500 ng / ml é adicionado ao SRM (3). Em alguns protocolos de diferenciação, SRM podem ser trocados com N2-A mídia e completada com o crescimento ou outros fatores para promover a especificação de células (2-5). Passo 3 <ol><li> Isolar e escolher o rosetas com uma agulha de 27 ½ G sob um microscópio. </li></ol> Nota: Evite cortar e escolher o MS5 células do estroma. Se colônias são embalados com rosetas, também se pode isolar a colônia inteira. Passo 4 <ol><li> Aspirar os clusters de rosetas, tritrurate-los cuidadosamente com uma ponta de 1 ml azul, e placa-los em poli-L-ornitina (0,001%) e fibronectina (1 mg / ml) ou laminina (1 mg / ml) revestido 6 poços em N2-A mídia geralmente suplementado com bFGF (20 ng / ml). O rosetas vai reformar e expandir. </li></ol> Nota: Para aumentar a sobrevivência da célula, pode-se a placa de pequenos grupos em forma de gotas para aumentar a densidade de células. Esta etapa também pode ser modificada, completando o N2-A mídia com crescimento adicional ou outros fatores para promover a especificação de células (2-5).

<ol>
	<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).</li><li>Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+and+methods+for+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+cell+populations.">Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations.</a> Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).</li><li>Sonntag, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yield+of+neuroepithelial+precursors+and+midbrain-like+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+using+the+bone+morphogenic+protein+antagonist+noggin.">Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin.</a> Stem Cells. 25, 411-418 (2007).</li><li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopaminergic+neurons+and+pigmented+epithelia+from+primate+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).</li><li>Ko, J. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+as+a+continuous,+stable,+and+on-demand+source+for+human+dopamine+neurons.">Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons.</a> J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).</li><li>Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+precursors+derived+from+human+embryonic+stem+cells+maintain+long-term+proliferation+without+losing+the+potential+to+differentiate+into+all+three+neural+lineages,+including+dopaminergic+neurons.">Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons.</a> J Neurochem. , (2007).</li><li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+subtype+specification+from+embryonic+stem+cells.">Neural subtype specification from embryonic stem cells.</a> Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).</li><li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage.">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+neural+rosettes+from+cloned+bovine+blastocysts:+a+model+of+early+neurulation+events+and+neural+crest+specification+in+vitro.">Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro.</a> Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).</li><li>Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+peripheral+sensory+and+sympathetic+neurons+and+neural+crest+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 923-930 (2005).</li></ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Este protocolo demonstra as diferentes etapas na geração e isolamento de células gliais a partir de células embrionárias humanas usando SDIA. A aplicação deste método é múltiplo e tem sido usado em muitos protocolos para a produção de neurônios especificado (por exemplo, 1, 2, 5-9). O rosetas são pensadas para se parecer com as células do tubo neural com um fenótipo anterior (2, 5, 10) e também contêm progenitores da crista neural (11, 12). Além disso, eles mantêm um certo nível de plasticidade, uma vez que podem ser modelado por fatores es...

<table><tbody><tr><td>L-Glutamina</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Knockout-DMEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Substituto de soro Knockout</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>Solução de aminoácidos não essenciais MEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12383</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N2-A</td><td></td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07152</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina-C</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0503</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina tipo-A</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-ornitina</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>solução a 0,01%</td></tr><tr><td>Laminina</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13256</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL com agulha 27 1/2 G</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Meio N2-A</td><td>meio</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12 + 1% suplemento N2-A </td></tr><tr><td>Meio com substituto de soro (SRM)</td><td>meio</td><td></td><td></td><td>Knockout-DMEM + 20% substituto de soro Knockout + 1% solução de aminoácidos não essenciais MEM + 2 mM L-glutamina</td></tr><tr><td>Meio &amp;alpha;-MEM</td><td>meio</td><td></td><td></td><td>&amp;alpha;-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamina + 1% penicilina/estreptomicina</td></tr><tr><td>MS5</td><td>linha celular</td><td></td><td></td><td>células estromais </td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td></td><td></td><td></td><td>para cultura de tecidos</td></tr></tbody></table>

cell-es derivadas neuroepiteliais culturas de células

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

Células-tronco embrionárias têm o potencial de se diferenciar em células de todas as camadas germinativas, o que os torna uma ferramenta atraente para o desenvolvimento de novas terapias. Em geral, a diferenciação de células-tronco embrionárias segue o conceito para a primeira geração de células progenitoras imaturas, que depois podem ser propagadas e diferenciado em fenótipos maduros celular. Isto também se aplica para o ES neurogênese células derivada, em que o desenvolvimento de células neurais segue duas etapas principais: Primeiro, a derivação ea expansão de precursores imaturos neuroepiteliais e, segundo, sua diferenciação em células maduras neural. Um método comum para a produção de progenitores neurais a partir de células ES é baseado em embrióides corpo formação (EB), que revela a diferenciação das células de todas as camadas germinativas incluindo neuroectoderma. Um método alternativo e mais eficiente para induzir o desenvolvimento de células neuroepiteliais usa actividade indutora do estroma de células derivadas (SDIA), que pode ser alcançado pelas células de cultura co-ES com o osso do crânio derivadas da medula células do estroma (1). Tanto, a formação de EB e SDIA, revelam o desenvolvimento de rosette-como estruturas, que são pensados ​​para assemelhar-se do tubo neural e / ou da crista neural, como progenitores. Os precursores neurais podem ser isoladas, expandidas e ainda mais diferenciado em neurônios e células gliais específicos usando condições de cultura definidas. Aqui, descrevemos a produção e isolamento de rosetas como em co-cultura experimentos com a linhagem de células do estroma MS5 (2-5).

Derivação de precursores de neuroepiteliais-tronco embrionárias (ES) utilizando células do estroma atividade induzir células derivadas (SDIA).

Cell-ES derivadas Neuroepiteliais culturas de células

As células ES têm o potencial de se diferenciar em células de todas as camadas germinativas, o que as torna uma ferramenta atraente para o desenvolvimento de novas terapias. Em ...

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Biologia

Aqui nós mostramos o nosso método para isolar do mouse epidérmicas células da crista neural haste (EPI-NCSC). Técnica envolve a micro-dissecando folículos bigode, isolando o bojo e placeing-lo em cultura de tecidos. EPI-NCSC começam a emigrar a partir de explantes saliência para o substrato dentro de 3-4 dias.

Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

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Aprenda a derivar precursores neuroepiteliais de células ES usando atividade indutora derivada de células estromais. Este método avança a engenharia de tecido neural e a compreensão do desenvolvimento cerebral.

Cell-ES derivadas Neuroepiteliais culturas de células

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