Name: Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a preparar embriões de Drosophila para imagem em tempo real usando o protocolo de gota suspensa. Este método simples e econômico protege contra desidratação e hipóxia, evitando compressão dos embriões durante sessões prolongadas de microscopia de fluorescência.

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Agradecemos o apoio de HB através de um Grant Descoberta, bem como um instrumentos de pesquisa e Grant Instrumento das Ciências Naturais e Engenharia pesquisas Council of Canada (NSERC). Reconhecemos também H. Oda eo Bloomington Drosophila ações Centro para a prestação de estoques genéticos que foram usadas no exemplo sequências de imagens ao vivo.

Preparação <ol><li> Coletar embriões em placas padrão suco de uva-agar 4. É conveniente usar um sistema automatizado de Drosophila Egg Collector (Flymax Scientific Equipment Ltd.). Usando síncrona encenado coleções embrião irá reduzir o número de dechorionations que devem ser executadas de modo a obter um número suficiente de embriões no estágio de desenvolvimento desejado. </li><li> Prepare um slide dechorionation anexando um pedaço de fita dupla face a uma lâmina de microscópio; remover a proteção da fita adesiva. </li><li> Prepare a câmara de imagens ao vivo, cortando um pedaço de tecido para caber no poço da câmara. Coloque o tecido no bem e molhe-a com água destilada. </li><li> Mix halocarbono óleo (Halocarbon Products Corp) série 700 viscosidade e série 56 na proporção de 1:1. A mistura pode ser armazenada e usada indefinidamente. </li><li> Coloque várias pequenas gotas de óleo de halocarbonos na superfície de uma lamela (22 X 40 mm, n º 2). O volume não é crítica mas deve ser da ordem de mL 20-40. </li></ol> Procedimento <ol><li> Com o auxílio de um estereomicroscópio, coletar embriões a partir do suco de uva-ágar placas usando um par de fórceps joalheiro (n º 5) ou um pincel muito fino. Embriões tendem a ficar uns aos outros e às pontas do fórceps &quot;, pois eles são facilmente reunidas em grupos. </li><li> Com o auxílio de um estereomicroscópio, delicadamente abaixar a aglomerados de embriões que tenham aderido às pontas do fórceps na superfície da fita sobre o slide dechorionation. </li><li> Novamente usando o estereomicroscópio, delicadamente nudge ou acidente vascular cerebral os embriões com o lado da pinça, a fim de romper o córion exterior waxy sem ruptura da membrana vitelina interna (o embrião vai estourar se a membrana vitelina é rompido). </li><li> Uma vez que o córion exterior foi rompido, burlar o embrião a partir do córion; o embrião dechorionated tende a aderir à superfície do fórceps. Tome cuidado para evitar tocar o embrião dechorionated para a superfície da fita. </li><li> Assim que um embrião é dechorionated, rapidamente transferi-lo para a queda previamente preparado de óleo de halocarbonos na lamela. Toque a ponta da pinça carregando o embrião dechorionated à superfície da gota de óleo halocarbono - este desaloja o embrião do fórceps no óleo. </li><li> Confirmar a transferência do embrião para a queda do petróleo. Isto pode ser feito a olho nu, desde que você trabalha sobre um fundo preto e usar uma fonte de iluminação de fibra óptica fixado em um ângulo oblíquo. </li><li> Antes de tentar dechorionate outro embrião, limpar todo o óleo do fórceps. Fórceps revestido em óleo têm menos compra na superfície córion, tornando dechorionation mais difícil. </li><li> Embriões são Dechorionated flutuante no óleo halocarbonos. Utilizando uma pinça ou um pincel e durante a visualização através de um microscópio estereoscópico, empurre o embrião para o fundo da gota de óleo e organizá-lo na posição desejada. </li><li> Rapidamente inverter a lamínula sobre o poço da câmara de imagens ao vivo. Confirmar que os embriões estão descansando contra a lamínula na orientação desejada. Devido à sua flutuabilidade no óleo, os embriões serão agora flutuar contra a superfície inferior da lamela. Fixar a lamínula para a câmara de imagens ao vivo com fita adesiva. Ventilar a câmara cortando buracos na fita na área onde a fita mede o intervalo entre a extremidade da lamela eo fim do poço da câmara de imagens ao vivo. </li><li> Um microscópio de fluorescência na vertical ou um estereomicroscópio fluorescência agora pode ser usado para a imagem dos embriões. </li></ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

Descrevemos um novo método de preparação de embriões Drosophila para análise de imagens ao vivo, que chamamos de protocolo de gota em suspensão. Infelizmente, não é possível usar o protocolo de gota em suspensão se trabalhar com um microscópio invertido. Neste caso, a técnica de sanduíche (como descrito acima no abstract) deve ser utilizado e compressão dos embriões permanece uma preocupação. Em experimentos onde a forma da célula e tamanho são medidos para calcular forças associadas com o m...

Equipamento de série e materiais necessários para preparar embriões para live-imaging usando o protocolo gotas de suspensão incluem os seguintes itens: lâminas de microscópio, lamínulas (22 x 40 mm, n º 2), fita dupla face, fórceps joalheiro (estilo Dumont No. 5 ), óleo de halocarbonos série 56 e série 700 (Halocarbon Products Corp), uma faca ou lâmina de barbear única borda, papel de seda, tesoura, água destilada, fita de propósito geral, e uma pipeta adequada para a entrega mL 20-40. O protocolo de imagens ao vivo também requer uma custom-made câmara de imagens ao vivo. Esta é preparada através do corte de 5 mm acho policarbonato folha de plástico com as dimensões de uma lâmina de microscópio padrão (75 X 25 mm) e usando um rotor para criar uma depressão profunda 3 milímetros no slide (20 X 55 mm). Acesso a um microscópio estereoscópico (microscópio de dissecação) e uma fonte de iluminação de fibra óptica também é necessária.

elaboração de drosophila os embriões para live-imaging usando o protocolo gota suspensa

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Proteína fluorescente verde (GFP) baseado em timelapse ao vivo de imagens é uma técnica poderosa para estudar a regulação genética de processos dinâmicos como a morfogênese do tecido, célula-adesão, ou morte celular. Embriões Drosophila expressando GFP são prontamente fotografada usando um microscópio estereoscópico ou confocal. A meta de qualquer protocolo de live-imaging é minimizar efeitos negativos como a desidratação e hipóxia. Protocolos anteriores para preparar os embriões de Drosophila live-imaging análise envolveram a colocação de embriões dechorionated em óleo halocarbonos e imprensando-los entre um halocarbono gás-permeáveis ​​membrana e uma lamela<sup&gt; 03/01</sup&gt;. A introdução de compressão através de embriões de montagem desta forma representa uma complicação indesejável para qualquer análise biomecânica da morfogênese baseado. Nosso método, que chamamos de o protocolo gotas de suspensão, resulta em excelente viabilidade de embriões durante a imagens ao vivo e não exige que os embriões ser compactado. Resumidamente, o protocolo de gota em suspensão envolve a colocação de embriões em uma gota de óleo halocarbono que está suspensa a partir de uma lamela, que é, por sua vez, fixados em posição através de uma câmara úmida. Além de proporcionar a troca gasosa e impedindo a desidratação, esse arranjo aproveita o empuxo de embriões em óleo halocarbono para impedi-los de drifting fora de posição durante a aquisição timelapse. Este vídeo descreve em detalhes como coletar e preparar Drosophila embriões para geração de imagens ao vivo usando o protocolo de gota em suspensão. Este protocolo é adequado para embriões de imagem dechorionated usando estereomicroscopia ou qualquer microscópio de fluorescência vertical composto.

Um método simples, barato e eficaz de preparação de embriões de Drosophila live-imaging análise é apresentada. Nosso protocolo fornece umidade e as trocas gasosas e não comprimir o embrião de Drosophila. Este método é adequado para GFP baseada em imagens ao vivo de embriões Drosophila usando um estereomicroscópio ou microscópio composto vertical.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

A imagem dinâmica (timelapse) de células vivas baseada na proteína fluorescente verde (GFP) é uma técnica poderosa para estudar a regulação genética de processos dinâmicos, tais como...

Olá. Meu nome é Bruce Reed. Sou professor assistente no Departamento de Biologia da Universidade de Waterloo em Waterloo, Ontário, Canadá. Estamos criando este arquivo de vídeo hoje para documentar uma nova técnica que desenvolvemos para o preparo de embriões moles para análise por imagemagem vital.Ao realizar análises de imagem em tempo real utilizando embriões de drosófila, frequentemente usamos aquisição com lapso de tempo, o que pode durar várias horas. Portanto, é importante dispor de uma técnica na qual os embriões sejam protegidos contra desidratação e hipóxia. Além disso, também desejamos desenvolver uma técnica que evite qualquer compressão do embrião.No montagem, desenvolvemos um método muito simples, barato e eficaz chamado preparação por gota suspensa. A preparação por gota suspensa é adequada para análise por imagemagem vital de embriões utilizando microscopia estereoscópica ou qualquer microscópio composto ereto. Este filme com lapso de tempo mostra oito embriões expressando GFP preparados utilizando o protocolo de gota suspensa e analisados por microscopia de fluorescência com lapso de tempo.Esta sequência de imagens representa mais de quatro horas de tempo decorrido

the-preparation-drosophila-embryos-for-live-imaging-using-hanging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

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O cinetocoro é onde o SAC inicia seu sinal de monitoramento da segregação mitótica das cromátides irmãs. Um método é descrito para visualizar o recrutamento e de rotação de uma das proteínas cinetocoro e pela sua coordenação com o movimento cromossoma...

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

Este vídeo descreve como realizar microinjeções que fornecem reagentes em embriões vivos de Drosophila. Os pesquisadores podem usar esse método para introduzir compostos exógenos como ácidos nucléicos e proteínas durante os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário. O protocolo apresentado demonstra como configurar e realizar o procedimento de injeção de qualquer reagente solúvel - aqui, uma proteína fluorescente para experimentos de imagem ao vivo.

Microinjeção de embriões vivos de Drosophila: entrega precoce de reagentes ao embrião em desenvolvimento

Descrevemos aqui um método eficaz para o estudo da dinâmica de depuração de células...

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Este protocolo apresenta um método eficiente para obter imagens do neuroepitélio do olho pupal de Drosophila vivo. Este método compensa o movimento do tecido e a topologia irregular, melhora a visualização dos limites celulares por meio do uso de várias proteínas de junção marcadas com GFP e usa um equipamento de imagem facilmente montado.

Vivo-imaging da Drosophila Pupal Eye

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Aqui, fornecemos um protocolo de dissecção necessário para a imagem viva da gônada masculina Drosophila . Este protocolo permitirá a observação de processos celulares dinâmicos em condições normais ou após manipulação transgênica ou farmacológica.

Dissecção e Live-Imaging do Drosophila Gonad embrionário tardio

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

Aprenda a preparar embriões de Drosophila para imagem em tempo real usando o protocolo de gota suspensa. Este método simples e econômico protege contra desidratação e hipóxia, evitando compressão dos embriões durante sessões prolongadas de microscopia de fluorescência.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

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