Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa
13 de março de 2009
Um método simples, barato e eficaz de preparação de embriões de Drosophila live-imaging análise é apresentada. Nosso protocolo fornece umidade e as trocas gasosas e não comprimir o embrião de Drosophila. Este método é adequado para GFP baseada em imagens ao vivo de embriões Drosophila usando um estereomicroscópio ou microscópio composto vertical.
Olá. Meu nome é Bruce Reed. Sou professor assistente no Departamento de Biologia da Universidade de Waterloo em Waterloo, Ontário, Canadá. Estamos criando este arquivo de vídeo hoje para documentar uma nova técnica que desenvolvemos para o preparo de embriões moles para análise por imagemagem vital.
Ao realizar análises de imagem em tempo real utilizando embriões de drosófila, frequentemente usamos aquisição com lapso de tempo, o que pode durar várias horas. Portanto, é importante dispor de uma técnica na qual os embriões sejam protegidos contra desidratação e hipóxia. Além disso, também desejamos desenvolver uma técnica que evite qualquer compressão do embrião.
No montagem, desenvolvemos um método muito simples, barato e eficaz chamado preparação por gota suspensa. A preparação por gota suspensa é adequada para análise por imagemagem vital de embriões utilizando microscopia estereoscópica ou qualquer microscópio composto ereto. Este filme com lapso de tempo mostra oito embriões expressando GFP preparados utilizando o protocolo de gota suspensa e analisados por microscopia de fluorescência com lapso de tempo.
Esta sequência de imagens representa mais de quatro horas de tempo decorrido. O início do movimento indica que esses embriões estão em condição viável. Agora vamos apresentar uma descrição detalhada, passo a passo, de como realizar o protocolo de gota suspensa.
Os embriões são coletados em placas padrão com suco de uva, ovo ou meio de cultura. Utilizando um coletor automático de ovos dsof FLA da Fly max scientific equipment, o coletor automático fornece coletas sincronizadas de embriões em um estágio de desenvolvimento predeterminado. Em preparação para a manipulação manual dos embriões, um pedaço de fita adesiva dupla face é fixado em uma lâmina de microscópio e o revestimento protetor da fita é removido.
O protocolo de gota suspensa requer uma câmara personalizada feita a partir de uma folha de plástico de policarbonato com cinco milímetros de espessura. A folha é cortada nas dimensões de uma lâmina de microscópio, e uma depressão com três milímetros de profundidade é feita com um rotor. A umidificação da câmara para imagem em tempo real é obtida usando um pedaço de tecido que é cortado para se ajustar ao poço da câmara e umedecido com água destilada.
O óleo Halo Carbon é ideal para a imagem em tempo real de embriões de drosófila porque é permeável a gases e opticamente claro. A mistura dos óleos Halo Carbon série 700 e série 56 em uma proporção de um para um resulta em uma viscosidade adequada para o trabalho com embriões de Drosophila. Os embriões podem ser coletados das placas de ágar com suco de uva utilizando pinças de ourives ou um pincel muito fino.
Os embriões grudam uns nos outros e nas pontas da pinça. Eles são facilmente reunidos em aglomerados, grupos de embriões. Adere à pinça.
As pontas são suavemente abaixadas sobre a superfície adesiva da fita no lâmina de preparação previamente montada. Enquanto observa os embriões por meio de um microscópio estereoscópico, movimente-os suavemente ou deslize sobre eles com a lateral da pinça. É necessário romper a corone sem romper a membrana interna de vilina.
Isso exige uma mão firme, paciência e alguma prática. Uma vez que a corone externa tenha sido rompida, o embrião desclorado tende a aderir à pinça. Tenha cuidado para não permitir que o embrião desclorado entre em contato com a superfície adesiva da fita.
Pode ser muito difícil recuperá-lo da fita; transfira rapidamente os embriões desclorados para o halo. Coloque gotas de óleo de carbono na lamínula. É recomendável manter isso por perto, tocando a ponta da pinça na superfície da gota de óleo de carbono.
O embrião é desalojado da pinça para o óleo; a transferência do embrião pode ser confirmada a olho nu utilizando um fundo preto e uma fonte de iluminação fibra óptica posicionada em um ângulo oblíquo antes de clorinar o próximo embrião. É útil limpar o óleo das suas pinças devido à sua flutuabilidade no óleo de halo carbono. Os embriões coordenados flutuam na superfície da gota de óleo.
Podemos controlar a posição e a orientação dos embriões empurrando-os para o fundo da gota de óleo e invertendo rapidamente a lamínula no protocolo de gota suspensa. Invertemos a lamínula sobre o poço umidificado da câmara de imagem em tempo real. Quando a lamínula é invertida, os embriões ficarão apoiados na face inferior da lamínula.
As posições de repouso dos embriões podem ser verificadas em um microscópio estereoscópico. Se não forem satisfatórias, o procedimento pode ser repetido. Uma vez que os embriões estejam em uma posição desejada, a lamínula é fixada à câmara de imagem em tempo real com fita adesiva.
A câmara é ventilada cortando orifícios na fita. Os embriões estão agora prontos para serem imageados.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método simples e eficaz para o preparo de embriões de Drosophila para análise por imagemagem vitalícia. O protocolo garante umidade adequada e troca gasosa, ao mesmo tempo que evita a compressão dos embriões, tornando-o adequado para imagemagem baseada em GFP.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Técnicas de Imagem
Contexto
- A análise de imagem em tempo real de embriões de Drosophila é comumente realizada usando aquisição com lapso de tempo.
- Os embriões são vulneráveis à desidratação e hipóxia durante sessões prolongadas de imageamento.
- Uma técnica que evite a compressão dos embriões é essencial para um imageamento preciso.
- O imageamento baseado em GFP requer condições específicas para resultados ideais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método que proteja embriões de Drosophila contra desidratação.
- Garantir troca gasosa adequada durante a aquisição de imagens.
- Evitar a compressão de embriões durante a aquisição de imagens em tempo real.
Métodos Utilizados
- Preparação de embriões de Drosophila para imagem viva.
- Implementação do controle de umidade durante as sessões de imagem.
- Uso de estereomicroscópio ou microscópio composto ereto para imagem.
- Aplicação de técnicas de imagem baseadas em GFP.
Resultados Principais
- O método mantém efetivamente a umidade e a troca de gases para embriões.
- Os embriões permanecem sem compressão, permitindo uma melhor qualidade de imagem.
- A imagem baseada em GFP produz resultados claros por períodos prolongados.
- A técnica é simples e economicamente viável para pesquisadores.
Conclusões
- Este método melhora a qualidade da microscopia em tempo real de embriões de Drosophila.
- Oferece uma abordagem confiável para pesquisadores da área.
- O protocolo pode ser facilmente adotado em diversos ambientes laboratoriais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagemagem em tempo real de organismos modelo é essencial para a validação de alvos e triagem fenotípica no estágio inicial de descoberta. O protocolo de gota suspensa supera limitações fundamentais relacionadas à desidratação, hipóxia e compressão mecânica, que comprometem a viabilidade de embriões e a qualidade dos dados durante a imagemagem prolongada em lapso de tempo. Ao permitir a imagemagem não comprimida e fisiologicamente relevante de embriões de Drosophila, o método possibilita a eliminação de riscos mecanicistas em intervenções genéticas e farmacológicas, em um formato escalável e economicamente eficiente.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da regulação genética em processos dinâmicos, como a morfogênese tecidual e a adesão celular, sem artefatos mecânicos provocados por compressão.
- Valor Operacional: Mantém a viabilidade do embrião por mais de quatro horas, permitindo a observação longitudinal da função gênica e da dinâmica de vias metabólicas.
- Valor Preditivo: Reduz falsos positivos decorrentes de fenótipos induzidos por estresse, aumentando a confiabilidade dos ensaios de validação de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece uma plataforma padronizada e reproduzível para imagens vivas baseadas em GFP que minimiza a variabilidade ambiental.
- Valor Operacional: Utiliza materiais de baixo custo e de fácil acesso (óleo de halocarboneto, câmara de policarbonato, fita), adequados para adaptação em alto rendimento.
- Prontidão do Ensaio: Aproveita a flutuabilidade embrionária no óleo para manter a estabilidade posicional, reduzindo a deriva e melhorando a consistência do sinal na aquisição de imagens com lapso de tempo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite a visualização de processos desenvolvimentais conservados relevantes para modelos de doenças humanas, facilitando a extrapolação entre espécies.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a observação de comportamentos celulares (por exemplo, morte celular, adesão) sob condições fisiológicas, melhorando a confiabilidade preditiva para modelos pré-clínicos subsequentes.
- Sistema Relevante para Doenças: Embriões de Drosophila que expressam repórteres GFP associados a doenças podem ser utilizados para monitorar a modulação de vias biológicas in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O protocolo de gota suspensa insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, especialmente para ensaios que exigem imagens dinâmicas e não comprimidas de repórteres codificados geneticamente.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a visualização direta dos efeitos do silenciamento gênico ou superexpressão sobre a morfogênese embrionária.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e resolvidas no tempo por fluorescência, essenciais para comparar os efeitos de compostos ou condições genéticas.
- Análises: Gera dados de timelapse estáveis e de alta qualidade, adequados para análise morfométrica e quantificação fenotípica.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas genéticas em Drosophila a vias conservadas, orientando a seleção de alvos para modelos de vertebrados.
- Reutilização Empresarial: A simplicidade e o baixo custo do protocolo permitem sua ampla adoção entre equipes como um método padronizado de preparação para imagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança preditiva ao eliminar artefatos de compressão e manter as condições fisiológicas durante a aquisição de imagens.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio do controle padronizado de umidade, troca gasosa e manipulação de embriões.
- Valor Estratégico: Reduz o ruído biológico em campanhas de triagem, aumentando a sensibilidade do ensaio e diminuindo as taxas de falsos positivos.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões mais confiáveis de avançar/não avançar na validação de alvos ao fornecer dados fenotípicos de maior fidelidade.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em manipulação de embriões de Drosophila e técnicas de descorionização.
- Depende do acesso a óleos de halocarbono e ferramentas básicas de microfabricação para o preparo da câmara.
- Necessita padronização da idade do embrião, genótipo e consistência no montagem entre diferentes usuários.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização da flutuabilidade do óleo e da geometria da câmara.
- Limitação prática: mais adequado para embriões que permanecem flutuantes em óleo de halocarbono; não aplicável a tipos celulares mais densos ou adesivos.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
