Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae
2 de março de 2009
GFP-fusão proteínas são amplamente utilizados para visualizar organelas por microscopia confocal. No entanto, a triagem para mutações que afetam a morfologia das organelas geralmente requer mutagênese individual e é demorado. Aqui, nós demonstramos um método para incorporar simultaneamente organela-GFP marcadores em quase 5.000 genes não-essenciais no fermento.
Este procedimento começa com a preparação de uma matriz de um CP um GFP, primeiro cultivando uma linha de células e, em seguida, fixando a matriz em uma nova placa. Ao mesmo tempo, prepare uma nova cópia do DMA. Em seguida, acoplamos a matriz ACP one GFP ao DMA e selecionamos diplóides, que são então esporulados em meios de esporulação.
Cinco dias depois, a progênie miótica é germinada em meio LRK, no qual apenas MAT A haplos crescerá. Por meio de duas rodadas adicionais de seleção, recuperamos células haplo carregando ACP um GFP e um gene nocauteado na micina da lata. Finalmente, podemos escolher cepas individuais diretamente da placa e observar a morfologia das mitocôndrias por microscopia confocal.
Olá, sou o Chap T do Laboratório de Direito do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências da Vida da Universidade da Colúmbia Britânica. Olá, sou Jesse Chao, também do Loan Lab. Hoje mostraremos um método de alto rendimento para incorporar ou marcadores GFP em vários fundos mutantes em leveduras usando um sistema robótico.
Utilizamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a morfologia de organelas como D, retículo endoplasmático e mitocôndrias. Então vamos começar. Para este protocolo, usamos duas cepas de levedura diferentes.
Uma GFP CP one é uma cepa com uma marcação GFP terminal C de ACP one, que é gerada por uma recombinação homóloga mediada por PCR usando o plasmídeo PKT 1 28. O fundo da tensão é BY 7 0 4 3. Também usamos a cepa DMA ou matriz de mutantes de deleção, que é uma matriz de cerca de 5.000 mutantes de deleção de genes não essenciais.
Todos esses genes não essenciais foram eliminados em G quatro 18. O fundo de deformação da matriz é BY 47 41. Para começar, cultive Alan de células ACP uma GFP, despejando cinco mililitros de cultura ACP uma GFP durante a noite em uma placa sibilante.
Deixe a placa secar o suficiente por uma chama ou em uma capela biológica. Depois de seco, incube a placa a 30 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, use um robô para organizar a cepa A CP one GFP em 1.536 colônias por placa.
Ao mesmo tempo, prepare uma nova cópia do DMA fixando na réplica quatro placas 18 do YPDG. Depois, incube as placas a 30 graus Celsius durante a noite após o crescimento das cepas. Fez a cepa A CP uma GFP com o DMA por réplica fixando e sobrepondo as colônias em placas YPD, incubando as placas a 30 graus Celsius durante a noite.
Após a placa de réplica de incubação, as colônias sob SD assobiam G quatro placas de 18 para selecionar as células implantadas, incubar as placas a 30 graus Celsius durante a noite. A fim de iniciar a esporulação e a germinação da primeira placa de réplica, os diplóides em YPDG quatro placas de 18 para aumentar a eficiência da esporulação na próxima etapa. Depois de incubar a 30 graus Celsius para uma placa de réplica de um dia, os diplóides em meios de esporulação aprimorados, que contêm níveis reduzidos de fontes de carbono e nitrogênio para induzir a formação de esporos mióticos.
Em seguida, incube as placas a 25 graus Celsius por um período mínimo de cinco dias. Após a incubação, germina o tapete, uma progênie miótica por réplica colocando as colônias em meio LRK. Este meio induzirá a germinação de células tablóides a partir de esporos, incubará as placas a 30 graus Celsius por dois dias para selecionar células portadoras do alelo GFP e do alelo mutante único.
As células Matt A são replicadas sob o meio Lade G quatro 18, que seleciona as células haplo que carregam a deleção do gene, incubam essas placas a 30 graus Celsius durante a noite. Próxima placa de réplica, o tapete, uma progênie miótica em L-H-R-K-G quatro 18 meios para selecionar o crescimento de mutantes únicos. Isso também abriga ACP uma GFP incubada durante a noite a 30 graus Celsius.
As placas podem então ser armazenadas a quatro graus Celsius por até três meses. Para visualizar os mutantes desejados expressando um CP um GFP diretamente da placa, comece escolhendo as colônias desejadas das placas. Cultive as células a 30 graus Celsius e YPD ou SD sibile até a fase inicial de log.
Finalmente, visualize um mutante usando microscopia confocal com o conjunto de filtros GFP nesta imagem confocal, um mutante e um tipo selvagem com o marcador ACP um GFP foram visualizados por microscopia confocal para estudar a morfologia mitocondrial. Este mutante em particular exibe fenótipo mitocondrial interrompido e, portanto, é um bom candidato para uma investigação mais aprofundada. Temos que ter mostrado a você como incorporar eficientemente um marcador multiclonal, um CP um GFP na matriz mutante de deleção usando um sistema robótico.
Ao fazer este procedimento, é importante fazer a mídia fresca e permitir que o local tenha tempo suficiente para secar. Se houver condensação muito úmida, aumentará a chance de contaminação. Além disso, você deve verificar se todas as mídias de seleção foram feitas corretamente, pois são essenciais para este protocolo.
Este procedimento também pode ser usado para outros tipos de marcadores. Por exemplo, para visualizar er, usamos rotineiramente o marcador ar 11 e GSP. Então é isso.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para incorporar marcadores de GFP de organelas em quase 5.000 genes não essenciais em levedura, otimizando o processo de visualização da morfologia de organelas. Ao utilizar esta abordagem, os pesquisadores podem analisar com eficiência mutações que afetam a estrutura de organelas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genética
Antecedentes
- As proteínas de fusão GFP são ferramentas essenciais para a visualização de estruturas celulares.
- Os métodos tradicionais para triagem de mutações são intensivos em mão de obra.
- A levedura atua como organismo modelo para estudos genéticos.
- A microscopia confocal permite a obtenção de imagens detalhadas de organelas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a incorporação simultânea de marcadores de organelas.
- Facilitar a triagem de mutações que afetam a morfologia de organelas.
- Ampliar a eficiência de estudos genéticos em leveduras.
Métodos Utilizados
- Preparação de um arranjo CP um GFP a partir de células cultivadas.
- Acasalamento do arranjo GFP com um DMA para selecionar diplóides.
- Esprorulação de diplóides em meios específicos.
- Observação da morfologia mitocondrial utilizando microscopia confocal.
Resultados Principais
- Incorporação bem-sucedida de marcadores de organela-GFP em genes de levedura.
- Recuperação eficiente de células haploides com modificações genéticas desejadas.
- Visualização da morfologia de organelas por meio de microscopia confocal.
- Processo otimizado para triagem de mutações genéticas.
Conclusões
- O método reduz significativamente o tempo necessário para triagem genética.
- Ele fornece uma estrutura robusta para o estudo da função de organelas.
- Essa abordagem pode ser aplicada a diversos estudos genéticos em leveduras.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método de alta produtividade para morfologia de organelas de levedura permite a investigação sistemática da função gênica na biogênese de organelas, apoiando a validação de alvos na fase inicial de descoberta. Ao integrar o manuseio automatizado de matrizes com seleção por dupla marcação, ele fornece dados fenotípicos escaláveis e reprodutíveis para a redução de riscos mecanicistas de acertos genéticos. A abordagem acelera o mapeamento de vias e a priorização de alvos que afetam a função mitocondrial ou do retículo endoplasmático em programas pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a avaliação em todo o genoma de deleções gênicas sobre a morfologia mitocondrial para validar alvos envolvidos na herança de organelas.
- Valor Operacional: Utiliza pinçamento robótico para processar 4.672 mutantes de forma eficiente, reduzindo o trabalho manual e aumentando a produtividade.
- Valor Preditivo: Identifica modificadores genéticos da estrutura de organelas para reduzir riscos de alvos precocemente na fase de descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera parâmetros quantificáveis da morfologia de organelas por meio de microscopia confocal para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Produz linhagens com deleção homozigótica e marcadores GFP integrados, garantindo expressão consistente do repórter em toda a matriz.
- Prontidão do Ensaio: Fornece mutantes haploides organizados em matriz, prontos para triagem de compostos ou mapeamento de interações genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona fenótipos de organelas em leveduras a vias conservadas relevantes para modelos de doenças humanas.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece a função gênica na biogênese de organelas para apoiar a seleção de alvos na validação pré-clínica.
- Elucidação de Vias: Mapeia redes genéticas que regulam a dinâmica mitocondrial para orientar triagens de compostos baseadas em mecanismos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial de descoberta até a identificação de compostos líderes, fornecendo dados sobre a morfologia de organelas que informam a confiança no alvo e a relevância da via antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função gênica na formação de organelas por meio de perfilagem morfológica sistemática.
- Triagem: Permite a obtenção reprodutível de imagens de organelas em formato de matriz para triagem de alto conteúdo de perturbações genéticas ou químicas.
- Análises: Fornece leituras fenotípicas baseadas em imagens que permitem comparar condições mutantes com controles do tipo selvagem.
- Pesquisa Translacional: Relaciona defeitos em organelas de levedura a processos celulares conservados, com possível relevância para modelos pré-clínicos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem fenotípica abrangente de organelas utilizando múltiplos marcadores com GFP marcados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao associar genótipo ao fenótipo de organela em larga escala.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de manipulação robótica padronizada e fluxo de trabalho com dupla seleção.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a avaliação paralela de milhares de contextos genéticos.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização de alvos ajustada ao risco com base em fenótipos de morfologia de organelas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em genética de leveduras, acasalamento, esporulação e microscopia fluorescente.
- Depende de sistemas robóticos de pinning e ambientes de incubação controlados para o manuseio de matrizes.
- Necessita de preparação padronizada de meios e protocolos de seleção para evitar contaminação e garantir a recuperação de mutantes.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a marcadores de diferentes organelas (por exemplo, retículo endoplasmático versus mitocôndrias).
- Limitado a backgrounds de genes não essenciais; genes essenciais requerem abordagens alternativas, como alelos condicionais ou CRISPRi.
