Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae
2 de março de 2009
GFP-fusão proteínas são amplamente utilizados para visualizar organelas por microscopia confocal. No entanto, a triagem para mutações que afetam a morfologia das organelas geralmente requer mutagênese individual e é demorado. Aqui, nós demonstramos um método para incorporar simultaneamente organela-GFP marcadores em quase 5.000 genes não-essenciais no fermento.
Este procedimento começa com o preparo de um arranjo de um CP um GFP, primeiramente cultivando uma linhagem de células e depois repicando o arranjo em uma placa fresca. Ao mesmo tempo, prepare uma cópia fresca de DMA. Em seguida, realizamos o cruzamento do arranjo ACP um GFP com o DMA e selecionamos os diplóides, que são então esporulados em meio de esporulação.
Cinco dias depois, a prole miótica é germinada em meio LRK, no qual apenas os haploides MAT A crescerão. Após duas rodadas adicionais de seleção, recuperamos células haploides que carregam tanto ACP1 GFP quanto um gene interrompido pela canamicina. Finalmente, podemos selecionar cepas individuais diretamente da placa e observar a morfologia das mitocôndrias por microscopia confocal.
Olá, sou Chap T do Laboratório Law, do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências da Vida da Universidade da Colúmbia Britânica. Olá, sou Jesse Chao, também do Laboratório Loan. Hoje vamos mostrar um método de alto rendimento para incorporar marcadores GFP em diversos backgrounds mutantes em levedura, utilizando um sistema robótico.
Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a morfologia de organelas como D, retículo endoplasmático e mitocôndrias. Então, vamos começar. Para este protocolo, utilizamos duas linhagens diferentes de levedura.
Um CP um GFP é uma linhagem com marcação GFP na extremidade C de ACP um, que é gerada por recombinação homóloga mediada por PCR utilizando o plasmídeo PKT 1 28. O background da linhagem é BY 7 0 4 3. Também utilizamos a linhagem DMA ou matriz de mutantes de deleção, que é uma matriz de cerca de 5.000 mutantes de deleção de genes não essenciais.
Todos esses genes não essenciais foram eliminados em G quatro 18. A linhagem genética do arranjo é BY 47 41. Para começar, cultive colônias de células ACP um GFP inoculando cinco mililitros de cultura prévia de ACP um GFP em uma placa com hiss.
Deixe a placa secar suficientemente por meio de chama ou em uma câmara de fluxo biológico. Uma vez seca, incube a placa a 30 graus Celsius durante a noite. Após a incubação, utilize um robô para distribuir a cepa A CP one GFP em 1.536 colônias por placa.
Ao mesmo tempo, prepare uma cópia fresca do DMA por pinagem por réplica em quatro placas YPDG 18. Em seguida, incube as placas a 30 graus Celsius durante a noite após o crescimento das linhagens. Obtenha a linhagem A CP um GFP com o DMA por pinagem por réplica e sobreposição das colônias em placas YPD, e incube as placas a 30 graus Celsius durante a noite.
Após a incubação em placa réplica, as colônias sob as placas SD hiss G quatro 18 visam selecionar células transformadas; incubar as placas a 30 graus Celsius durante a noite. Para iniciar a esporulação e germinação na primeira placa réplica, transferir os diploides para placas YPDG quatro 18, a fim de aumentar a eficiência da esporulação na próxima etapa. Após a incubação a 30 graus Celsius por um dia, fazer uma réplica dos diploides em meio de esporulação aprimorado, que contém níveis reduzidos de fontes de carbono e nitrogênio para induzir a formação de esporos meióticos.
Em seguida, incubar as placas a 25 graus Celsius por um mínimo de cinco dias. Após a incubação, germinar o micélio, uma prole miótica, por meio de plaqueamento de réplica das colônias em meio LRK. Esse meio induzirá a germinação de células tablóides a partir de esporos; incubar as placas a 30 graus Celsius por dois dias para selecionar células que carreguem tanto o alelo GFP quanto o alelo mutante simples.
Células Matt A são replicadas em placas com meio lade G quatro 18, que seleciona células haploides que carregam a deleção gênica; incubar essas placas a 30 graus Celsius durante a noite. Em seguida, replicar em placa a progênie miótica de mat A em meio L-H-R-K-G quatro 18 para selecionar o crescimento de mutantes simples que também abrigam ACP um GFP; incubar durante a noite a 30 graus Celsius.
As placas podem então ser armazenadas a quatro graus Celsius por até três meses. Para visualizar os mutantes desejados expressando uma CP uma GFP diretamente da placa, comece escolhendo as colônias desejadas das placas. Incube as células a 30 graus Celsius em meio YPD ou SD hiss até a fase logarítmica inicial.
Por fim, visualize os mutantes utilizando microscopia confocal com o conjunto de filtros GFP nesta imagem confocal, um mutante e um tipo selvagem com o marcador ACP um GFP foram visualizados por microscopia confocal para estudar a morfologia mitocondrial. Este mutante específico exibe um fenótipo mitocondrial alterado e é, portanto, um bom candidato para investigação adicional. Mostramos a você como incorporar eficientemente um marcador multiclonal, o CP um GFP, na matriz de mutantes de deleção utilizando um sistema robótico.
Ao realizar este procedimento, é importante preparar o meio de cultura recentemente e permitir que o local tenha tempo suficiente para secar. Se houver muita umidade, ocorrerá acúmulo de condensação, aumentando a chance de contaminação. Além disso, você deve verificar cuidadosamente se todos os meios de seleção foram preparados corretamente, pois são essenciais para este protocolo.
Este procedimento também pode ser usado para outros tipos de marcadores. Por exemplo, para visualizar er, utilizamos rotineiramente o marcador air 11 e GSP. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para incorporar marcadores de GFP de organelas em quase 5.000 genes não essenciais em levedura, otimizando o processo de visualização da morfologia de organelas. Ao utilizar esta abordagem, os pesquisadores podem analisar com eficiência mutações que afetam a estrutura de organelas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genética
Antecedentes
- As proteínas de fusão GFP são ferramentas essenciais para a visualização de estruturas celulares.
- Os métodos tradicionais para triagem de mutações são intensivos em mão de obra.
- A levedura atua como organismo modelo para estudos genéticos.
- A microscopia confocal permite a obtenção de imagens detalhadas de organelas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a incorporação simultânea de marcadores de organelas.
- Facilitar a triagem de mutações que afetam a morfologia de organelas.
- Ampliar a eficiência de estudos genéticos em leveduras.
Métodos Utilizados
- Preparação de um arranjo CP um GFP a partir de células cultivadas.
- Acasalamento do arranjo GFP com um DMA para selecionar diplóides.
- Esprorulação de diplóides em meios específicos.
- Observação da morfologia mitocondrial utilizando microscopia confocal.
Resultados Principais
- Incorporação bem-sucedida de marcadores de organela-GFP em genes de levedura.
- Recuperação eficiente de células haploides com modificações genéticas desejadas.
- Visualização da morfologia de organelas por meio de microscopia confocal.
- Processo otimizado para triagem de mutações genéticas.
Conclusões
- O método reduz significativamente o tempo necessário para triagem genética.
- Ele fornece uma estrutura robusta para o estudo da função de organelas.
- Essa abordagem pode ser aplicada a diversos estudos genéticos em leveduras.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método de alta produtividade para morfologia de organelas de levedura permite a investigação sistemática da função gênica na biogênese de organelas, apoiando a validação de alvos na fase inicial de descoberta. Ao integrar o manuseio automatizado de matrizes com seleção por dupla marcação, ele fornece dados fenotípicos escaláveis e reprodutíveis para a redução de riscos mecanicistas de acertos genéticos. A abordagem acelera o mapeamento de vias e a priorização de alvos que afetam a função mitocondrial ou do retículo endoplasmático em programas pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a avaliação em todo o genoma de deleções gênicas sobre a morfologia mitocondrial para validar alvos envolvidos na herança de organelas.
- Valor Operacional: Utiliza pinçamento robótico para processar 4.672 mutantes de forma eficiente, reduzindo o trabalho manual e aumentando a produtividade.
- Valor Preditivo: Identifica modificadores genéticos da estrutura de organelas para reduzir riscos de alvos precocemente na fase de descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera parâmetros quantificáveis da morfologia de organelas por meio de microscopia confocal para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Produz linhagens com deleção homozigótica e marcadores GFP integrados, garantindo expressão consistente do repórter em toda a matriz.
- Prontidão do Ensaio: Fornece mutantes haploides organizados em matriz, prontos para triagem de compostos ou mapeamento de interações genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Relaciona fenótipos de organelas em leveduras a vias conservadas relevantes para modelos de doenças humanas.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece a função gênica na biogênese de organelas para apoiar a seleção de alvos na validação pré-clínica.
- Elucidação de Vias: Mapeia redes genéticas que regulam a dinâmica mitocondrial para orientar triagens de compostos baseadas em mecanismos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase inicial de descoberta até a identificação de compostos líderes, fornecendo dados sobre a morfologia de organelas que informam a confiança no alvo e a relevância da via antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função gênica na formação de organelas por meio de perfilagem morfológica sistemática.
- Triagem: Permite a obtenção reprodutível de imagens de organelas em formato de matriz para triagem de alto conteúdo de perturbações genéticas ou químicas.
- Análises: Fornece leituras fenotípicas baseadas em imagens que permitem comparar condições mutantes com controles do tipo selvagem.
- Pesquisa Translacional: Relaciona defeitos em organelas de levedura a processos celulares conservados, com possível relevância para modelos pré-clínicos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem fenotípica abrangente de organelas utilizando múltiplos marcadores com GFP marcados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao associar genótipo ao fenótipo de organela em larga escala.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de manipulação robótica padronizada e fluxo de trabalho com dupla seleção.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a avaliação paralela de milhares de contextos genéticos.
- Impacto no Portfólio: Facilita a priorização de alvos ajustada ao risco com base em fenótipos de morfologia de organelas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em genética de leveduras, acasalamento, esporulação e microscopia fluorescente.
- Depende de sistemas robóticos de pinning e ambientes de incubação controlados para o manuseio de matrizes.
- Necessita de preparação padronizada de meios e protocolos de seleção para evitar contaminação e garantir a recuperação de mutantes.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a marcadores de diferentes organelas (por exemplo, retículo endoplasmático versus mitocôndrias).
- Limitado a backgrounds de genes não essenciais; genes essenciais requerem abordagens alternativas, como alelos condicionais ou CRISPRi.
