Name: Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprenda um método de alto rendimento para incorporar marcadores GFP em organelas de S. cerevisiae usando cruzamento genético e microscopia confocal. Esta abordagem permite rastrear mutações que afetam a morfologia mitocondrial de forma eficiente.

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Este trabalho foi financiado pela Biotecnologia e Ciências Biológicas Research Council (concessão 31/C15982), os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, a Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento, a Fundação Michael Smith para Pesquisa em Saúde (conceder a CJR Loewen) e Luta em Prol da Visão.

Materiais e métodos: <ol><li> Cepas de leveduras: <ul><li> ACP1-GFP (GFP:: Seu): C-terminal GFP-tagging de ACP1 foi gerado por uma PCR mediada por recombinação homóloga usando pKT128 plasmídeo (contém GFP e HIS5). Transformantes positivos foram confirmados por microscopia confocal e colônia PCR. O pano de fundo a tensão foi BY7043 (MAT alfa can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) de Boone laboratório (Tong e Boone, 2006). </li><li> Exclusão da Matriz Mutant (DMA) (xxx:: KanR): é um conjunto de cerca de 5.000 mutantes de deleção de genes não-essenciais. Todos estes genes não-essenciais foram eliminados na G418. O pano de fundo a tensão da matriz é BY4741 (MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Nosso DMA era originalmente de Boone laboratório. </li></ul></li><li> Incorporando ACP1 GFP-no DMA: O seguinte protocolo para fazer uma série GFP é uma adaptação da Análise genético sintético (SGA) tecnologia (Tong e Boone, 2006) com modificações. Todas as etapas são feitas réplicas pinagem usando um ROTOR Cantor de alta densidade arraying sistema robótico. Alternativamente, manual pinagem ou um líquido baseado em robô arraying de alta densidade podem ser usados. Siglas: YPD, extrair-peptona-dextrose levedura; SD, sintéticos abandono; LRK, Lue / Arg / Lys abandono media; LHRK, Lue / His / Arg / Lys abandono media Preparação <ol><li> Crescer um gramado de ACP1-GFP células derramando um de 5 ml da cultura ACP1 GFP-noite em uma placa YPD. Permitem que o prato para secar suficientemente por uma chama ou um capuz biológica de fumos. </li><li> Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite. </li><li> Usando um robô array, ACP1 GFP-tensão em 1.536 colônias por placa. Ao mesmo tempo, preparar uma nova cópia da DMA pela réplica pinagem para placas YPD + G418. </li><li> Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite. Acasalamento e seleção de diplóides </li><li> Companheiro da estirpe ACP1 GFP com o DMA pela réplica pinagem e mais-que estabelece as colônias em placas YPD. </li><li> Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite. </li><li> Réplica da placa-colônias para SD - Seu placas G418 + para selecionar células diplóides (MATA / MATalpha). </li><li> Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite. Sporulationg e germinação </li><li> Réplica da placa-colônias diplóides em mídia esporulação melhorada, que contém níveis reduzidos de fontes de carbono e nitrogênio para induzir a formação de esporos meióticos. </li><li> Incubar as placas a 25 ˚ C durante um mínimo de 5 dias. </li><li> Germinar as progênies MATA meiótica por replica-plating as colônias em LRK media e incubar as placas a 30 ˚ C por dois dias. </li><li> Esta mídia vai induzir a germinação das células haplóides a partir de esporos. Uma vez que um quadro de leitura LUE2 abertura (ORF) está integrado no promotor STE2 MATA-específica, todos os haplóides serão germinadas Mata. Seleção de ambos os alelos </li><li> Agora é necessário selecionar ambos os alelos do GFP eo único alelo mutante. Para conseguir isso, as células Mata são réplicas banhados em LRK G418 + media, que seleciona para as células haplóides que carregam a deleção do gene (xxx:: kanR). </li><li> Incubar as placas a 30 ˚ C durante a noite. </li><li> Finalmente, as progênies MATA meiótica são réplicas banhados em LHRK G418 + media para selecionar para o crescimento de mutantes simples (xxx:: kanR) também abrigar ACP1-GFP (GFP:: His). Estas placas podem ser armazenadas a 4 ˚ C por até 3 meses. </li></ol> O seguinte protocolo para fazer uma série GFP é uma adaptação da Análise genético sintético (SGA) tecnologia (Tong e Boone, 2006) com modificações. Todas as etapas são feitas réplicas pinagem usando um ROTOR Cantor de alta densidade arraying sistema robótico. Alternativamente, manual pinagem ou um líquido baseado em robô arraying de alta densidade podem ser usados. Siglas: YPD, extrair-peptona-dextrose levedura; SD, sintéticos abandono; LRK, Lue / Arg / Lys abandono media; LHRK, Lue / His / Arg / Lys abandono media Preparação </li><li> Microscopia: <ol><li> Escolha o mutante desejado (s) expressando GFP-ACP1 diretamente do prato. </li><li> Cultivar células a 30 ° C em YPD ou SD - Sua mídia a fase log cedo. </li><li> Visualize por microscopia confocal usando o filterset GFP. Um exemplo de resultado esperado é mostrado na Figura 1. </li></ol></li></ol> SGA mídia: A mídia de crescimento (YPD) e meios de comunicação selecionando (SD) utilizado neste protocolo é utilizado rotineiramente em biologia molecular de leveduras. Por favor, consulte Métodos de levedura (Amberg et al., 2005) para descrições detalhadas. LRK, LHRK mídia (para 400 total de ml) <table border="0"><tbody><tr><td> Adicionar a fim </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Base de levedura nitrogenadas com sulfato de amônio </td><td> 2,7 g </td></tr><tr><td> Aminoácidomistura </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> Dextrose 20% </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Arrefecer a 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml canavanina </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Misture, despeje 50 ml por placa </td></tr></tbody></table> LRK, LHRK G418 + media (para 400 total de ml) <table border="0"><tbody><tr><td> Adicionar a fim </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Base de levedura nitrogenados, sem sulfato de amônio </td><td> 0,7 g </td></tr><tr><td> Mix de aminoácidos </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> O glutamato monossódico </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> Dextrose 20% </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Arrefecer a 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml canavanina </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 200 mg / ml G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Misture, despeje 50 ml por placa </td></tr></tbody></table> Enriquecido esporulação de mídia (para 400 total de ml) <table border="0"><tbody><tr><td> Adicionar a fim </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Acetato de potássio </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> Extrato de levedura </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> 0,2 g </td></tr><tr><td> Esporulação mix de aminoácidos </td><td> 0,04 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 mL </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Arrefecer a 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 200 mg / ml G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Misture, despeje 50 ml por placa </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

Este método pode ajudar eficientemente incorporar um marcador mitocondrial, ACP1-GFP em várias formações mutantes. Ele se baseia na utilização de um sistema robótico, e pode facilmente adotado para uso com qualquer sistema robótico. Este procedimento pode ser usado também para incorporar outros tipos de marcadores. Por exemplo, para visualizar ER, que utilizam rotineiramente o marcador Erg11-GFP. No nosso imagens representativas, uma mutante e um tipo selvagem com o fabricante ACP1-GFP foram visualiz ed por microscopia ...

<table><tbody><tr><td>Mídia SGA</td><td></td><td></td><td>A mídia de crescimento (YPD) e as mídias sintéticas de eliminação (SD), incluindo LRK e LHRK, e a mídia enriquecida para esporulação utilizadas neste protocolo são comumente empregadas na biologia molecular de leveduras. Consulte Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) para descrições detalhadas.</td></tr></tbody></table>

um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em s. cerevisiae

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Alto rendimento métodos para examinar localização de proteínas ou morfologia organela é uma ferramenta eficaz para o estudo de interações de proteínas e podem ajudar a alcançar uma compreensão abrangente de vias moleculares. Em Saccharomyces cerevisiae, com o desenvolvimento da matriz de exclusão não essenciais gene, podemos globalmente estudar a morfologia das organelas diferentes, como o retículo endoplasmático (ER) e da mitocôndria utilizando GFP (ou variante) marcadores no gene backgrounds diferentes. No entanto, os marcadores de GFP incorporando em cada mutante único individualmente é um processo trabalhoso. Aqui, descrevemos um procedimento que é utilizado rotineiramente em nosso laboratório. Usando um sistema robótico para lidar com arrays de alta densidade fermento e técnicas de seleção de drogas, podemos reduzir significativamente o tempo necessário e melhorar a reprodutibilidade. Em resumo, nós cruzamos um marcador GFP-tagged mitocondrial (Apc1-GFP) para um conjunto de alta densidade de 4.672 mutantes de deleção do gene não essencial por robótico réplica pinagem. Através da seleção diplóide, esporulação, germinação e seleção marcador dual, nós recuperamos ambos os alelos. Como resultado, cada mutante haplóide única contém Apc1 GFP-incorporados em seu locus genômica. Agora, podemos estudar a morfologia das mitocôndrias em todas fundo não essenciais mutante. Usando essa abordagem de alto rendimento, podemos convenientemente estudar e delinear os caminhos e os genes envolvidos na herança ea formação de organelas em um cenário de todo o genoma.

GFP-fusão proteínas são amplamente utilizados para visualizar organelas por microscopia confocal. No entanto, a triagem para mutações que afetam a morfologia das organelas geralmente requer mutagênese individual e é demorado. Aqui, nós demonstramos um método para incorporar simultaneamente organela-GFP marcadores em quase 5.000 genes não-essenciais no fermento.

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

Métodos de alto rendimento para examinar a localização proteica ou a morfologia de organelas são ferramentas eficazes para estudar interações proteicas e podem ajudar...

Este procedimento começa com o preparo de um arranjo de um CP um GFP, primeiramente cultivando uma linhagem de células e depois repicando o arranjo em uma placa fresca. Ao mesmo tempo, prepare uma cópia fresca de DMA. Em seguida, realizamos o cruzamento do arranjo ACP um GFP com o DMA e selecionamos os diplóides, que são então esporulados em meio de esporulação.Cinco dias depois, a prole miótica é germinada em meio LRK, no qual apenas os haploides MAT A crescerão. Após duas rodadas adicionais de seleção, recuperamos células haploides que carregam tanto ACP1 GFP quanto um gene interrompido pela canamicina. Finalmente, podemos selecionar cepas individuais diretamente da placa e observar a morfologia das mitocôndrias por microscopia confocal.Olá, sou Chap T do Laboratório Law, do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências da Vida da Universidade da Colúmbia Britânica. Olá, sou Jesse Chao, também do Laboratório Loan. Hoje vamos mostrar um método de alto rendimento para incorporar marcadores GFP em diversos backgrounds mutantes em levedura, utilizando um sistema robótico.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a morfologia de or

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Biologia

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em...

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Uma abordagem robusta para monitorar a entrega de organelas para a luz ácida do vacúolo levedura para a degradação e reciclagem é descrito. O método baseia-se na rotulagem específica de organelas-alvo com uma geneticamente codificado fluorescência dupla emissão de pH biosensor, e visualização de células individuais usando a microscopia de fluorescência.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Este protocolo descreve a análise de compartimentos intracelular cDNAs etiquetados no fermento de brotamento usando a microscopia confocal 4D (Time-Lapse 3D) multi-color. Os parâmetros de imagem são escolhidos para capturar sinais adequados, limitando o Fotodano. Os plugins personalizados do ImageJ permitem que as estruturas rotuladas sejam rastreadas e analisadas quantitativamente.

4D microscopia de levedura

Aqui, nós apresentamos a imagem latente da viver-pilha que é um método não-tóxico da microscopia que permita investigadores de estudar o comportamento da proteína e a dinâmica nuclear em pilhas vivas do fermento da fissão durante o mitose e o meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Fenótipos de crescimento de leveduras são precisamente medidos através de imagens de lapso de tempo altamente paralelas de células imobilizadas crescendo em microcolônias. Simultaneamente, a tolerância ao estresse, a expressão proteica e a localização da proteína podem ser monitoradas, gerando conjuntos de dados integrados para estudar como as diferenças ambientais e genéticas, bem como a heterogeneidade de expressão genética entre as células isogênicas, modulam o crescimento.

Imagem ao vivo de alta taxa de microcolônias para medir heterogeneidade no crescimento e expressão genética

Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.

Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta valiosa para estudar a meiose em leveduras em brotamento. Este protocolo descreve um método que combina sincronização do ciclo celular, microscopia de lapso de tempo e depleção condicional de uma proteína-alvo para demonstrar como estudar a função de uma proteína específica durante a segregação cromossômica meiótica.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.

Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Aprenda um método de alto rendimento para incorporar marcadores GFP em organelas de S. cerevisiae usando cruzamento genético e microscopia confocal. Esta abordagem permite rastrear mutações que afetam a morfologia mitocondrial de forma eficiente.

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

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