Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização
25 de março de 2009
Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.
Este procedimento permite determinar padrões de expressão gênica em embriões de peixe-zebra com alta resolução, em que uma sonda de riboprobes antisense é hibridizada ao mRNA alvo complementar. O riboprobe marcado é reconhecido por um anticorpo conjugado a uma enzima peroxidase; um composto fluoro four conjugado à aramida é adicionado aos embriões e a peroxidase converte o IDE em um composto altamente reativo. Isso leva à deposição estável do fluoro four; o IDE não ligado é removido por lavagem, revelando o detalhado padrão subcelular de distribuição de mRNA.
A expressão de um segundo gene pode ser observada usando uma sonda marcada de forma distinta e um fluoróforo diferente, permitindo a comparação detalhada da expressão. Olá, sou Tim Brent do laboratório de Scott Holly, do Departamento de Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento da Universidade de Yale. Hoje vamos mostrar um procedimento para hibridização in situ fluorescente dupla de alta resolução em preparação inteira de embriões de peixe-zebra em todo o laboratório.
Utilizamos este procedimento para estudar a segmentação em peixe-zebra. Vamos então começar. Inicie o procedimento com embriões que foram fixados durante a noite em temperatura fria em paraformaldeído.
Usar um estoque recém-descongelado de paraformaldeído para essa fixação é essencial para uma coloração bem-sucedida. Remova a solução fixadora e lave os embriões à temperatura ambiente duas vezes, por cinco minutos cada vez, em PBS. Em seguida, remova o córion dos embriões.
Os embriões são colocados em placas de vidro com depressões. Usando pinças de relojoeiro, remova o Corian a partir de agora. Utilize uma pipeta de Pasteur de vidro polida ao fogo para transferir os embriões.
Do contrário, os embriões aderirão às pontas regulares de polipropileno. Os embriões desclorinados são transferidos através de uma série de lavagens com concentrações crescentes de metanol. A última lavagem é feita em metanol a 100%.
Por fim, os embriões são colocados em metanol fresco e armazenados a menos 20 graus durante a noite. No dia seguinte, transfira os embriões por meio de uma série de lavagens com concentração decrescente de metanol e duas lavagens com tampão PBST de cinco minutos cada. Em seguida, fixe os embriões com paraformaldeído por 20 minutos.
Finalize a fixação curta com duas lavagens de cinco minutos em PBST. Agora estamos prontos para permeabilizar os embriões. Os embriões fixados tornam-se permeáveis pela incubação com a proteína ACE K. Certifique-se de colocar o tubo de microcentrífuga de lado.
A duração da etapa de digestão depende da idade do embrião. Por exemplo, embriões na fase de agênese somática são incubados por três a quatro minutos. Enxágue brevemente em PBST e lave uma vez em PBST por cinco minutos.
Fixe os embriões em paraformaldeído. Por fim, lave os embriões duas vezes em PBST durante cinco minutos. Os embriões estão agora prontos para hibridização com as sondas de RNA.
Agora que fixamos e tornamos permeáveis os embriões, iniciamos o processo de hibridização com uma incubação de cinco minutos em alta menos a 65 graus Celsius. Lembre-se de pré-aquecer a solução HIIN antes do uso. Em seguida, incubar os embriões em alta mais por uma hora.
Lembre-se novamente de pré-aquecer a solução high plus. Agora, remova a maior parte da solução hip plus, mas deixe 50 microlitros, garantindo que os embriões permaneçam completamente submersos. Adicione um microlitro de cada sonda e misture suavemente batendo levemente no tubo.
Cubra os tubos com papel alumínio a partir de agora. Como a fluoresceína é sensível à luz, incube durante a noite a 65 graus Celsius; assim, a hibridização é concluída. Portanto, vamos remover as sondas em excesso a partir de agora.
O detergente é eliminado para melhorar a coloração. No entanto, observe que os embriões tornam-se pegajosos na ausência de detergente. Lave duas vezes com solução de 50% de formamida em XSSC 2X, durante 30 minutos cada vez.
Lave uma vez com solução XSSC 2 por 15 minutos. Finalmente, lave duas vezes com SSC 0,2 vezes por 30 minutos cada vez. Em seguida, visualizaremos cada sonda.
Agora podemos iniciar a detecção das sondas hibridizadas. Detecte primeiro a sonda marcada com fluoresceína, pois é menos estável e mais fraca do que a sonda marcada com digoxigenina. Primeiro, realize o bloqueio com 500 microlitros de reagente bloqueador a 2% em tampão de ácido málico durante uma hora à temperatura ambiente.
Em seguida, adicione o anticorpo anti-fluoresceína conjugado à peroxidase numa diluição de um para 500 na solução bloqueadora. Incube durante a noite a quatro graus Celsius. Certifique-se de colocar o tubo de microcentrífuga deitado de lado.
Em seguida, inicie a detecção utilizando o sistema de amplificação de sinal tyrom ou TSA. O TYROM IDE é conjugado a um fluoro four. A peroxidase do rábano-forrageiro no anticorpo converte o TY IDE em um intermediário altamente reativo. O TY IDE reativo forma uma ligação covalente com resíduos próximos ao anticorpo, resultando na deposição localizada do fluoro four.
Inicie com quatro lavagens de 20 minutos cada com tampão de ácido málico 1x à temperatura ambiente, lavado duas vezes em PBS. O TY IDE de fluoresceína foi previamente dissolvido em DMSO para armazenamento. Gire brevemente este substrato de TSA por centrifugação.
Em seguida, dilua o substrato TSA na proporção de um para 50 no tampão diluidor de amplificação. Adicione a solução aos embriões e incube por 45 minutos. Coloque o tubo de microcentrífuga deitado de lado.
Durante esta etapa de incubação, transfira os embriões por meio de uma série de lavagens de 10 minutos com concentração crescente de metanol. A última lavagem é de 10 minutos em metanol a 100%, seguida de incubação por 30 minutos em uma solução de 1% de peróxido de hidrogênio para inativar a peroxidase no anticorpo. Caso contrário, ela poderá interferir na detecção do oxigênio dig.
Transfira os embriões através de uma série de lavagens com concentração decrescente de metanol e com duas lavagens de 10 minutos com tampão PBS. Isso garante que todo o metanol seja removido. A marcação com anticorpo da dig xigenina e sonda começa com bloqueio, como no anticorpo anterior.
Em seguida, adicione o anticorpo anti-digoxigenina em uma diluição de um para 1000. Coloque o tubo de microcentrífuga de lado e incube durante a noite no frio até o dia seguinte. Lave com tampão de ácido málico à temperatura ambiente.
Em seguida, com PBS quickpin, o substrato de tirosina SCI cinco. Dilua-o na proporção de um para 50 e adicione aos embriões. Incube por 45 minutos mantendo o tubo deitado de lado.
Por fim, lave três vezes em PBST. Um passo final de coloração com iodeto de propídio marca os núcleos. Inicie com duas lavagens de cinco minutos em XSSC 2x.
Em seguida, trate com RNAses por 30 minutos a 37 graus. Lave seis vezes em 2 XSSC à temperatura ambiente e, agora, adicione a solução de iodeto de propídio e corante por oito minutos. Lave seis vezes em 2 XSSC.
Fixe os embriões em paraformaldeído por 20 minutos. E, finalmente, duas lavagens de cinco minutos em PBST. O preparo dos embriões para visualização começa com duas incubações de 10 minutos em glicerol 25% e 50%.
Em seguida, coloque as amostras em glicerol 75% e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius. Esta etapa de clareamento durante a noite facilita a dissecação dos embriões. Por fim, dissecar e remover a gema dos embriões.
Para reduzir a fluorescência de fundo, monte os embriões em lâmina de microscópio e examine-os ao microscópio. Essas imagens mostram uma única seção confocal através da extremidade posterior de um embrião de peixe-zebra no estágio de 10 somitos. A coloração vermelha mostra o mRNA da delta C detectado com uma sonda marcada com digoxigenina e o reagente TSA sci-fi.
A coloração verde representa seu mRNA detectado com uma sonda marcada com fluoresceína. E os núcleos corados com o reagente TSA fluoresceína e iodeto de propídio são coloridos de azul em um embrião duplamente corado.
Pode-se determinar inequivocamente regiões de expressão distinta ou sobreposta. E este procedimento revela a localização subcelular do mRNA, conforme visto nestas vistas ampliadas da coloração de her-1. A transcrição ativa do gene é revelada por pontos de coloração no núcleo.
Outras células exibem localização citoplasmática do RNA mensageiro. No embrião duplamente corado, podemos observar células que transcrevem ambos os genes ou apenas um deles.
Separadamente, acabamos de mostrar como realizar uma hibridização fluorescente dupla in situ com montagem inteira e alta resolução em embriões de peixe-zebra. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que primeiro testamos nossas sondas utilizando sondas de coloração mediadas por fosfatase alcalina padrão; sondas que fornecem um sinal nítido e forte funcionarão bem na técnica fluorescente in situ.
Também utilizamos com sucesso a imunolocalização da beta-catenina no lugar da coloração com iodeto de propídio. Quando realizamos essa variação, realizamos as reações de hibridização a 55 graus Celsius em vez de 65. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo de hibridização fluorescente in situ dupla de alta resolução para analisar padrões de expressão gênica em embriões de peixe-zebra. O método permite determinar a sobreposição dos domínios de expressão de dois genes, utilizando uma coloração nuclear de contraste com iodeto de propídio para realçar a visualização da organização tecidual.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do Desenvolvimento
- Análise da Expressão Gênica
- Técnicas de Imagem Fluorescente
Antecedentes
- A hibridização in situ em preparação inteira é amplamente utilizada na biologia do desenvolvimento.
- Esta técnica ajuda a visualizar a expressão gênica em embriões.
- A imagem de alta resolução é fundamental para compreender as interações gênicas.
- Técnicas de contra-coloração melhoram a clareza da organização tecidual.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo detalhado para hibridização fluorescente in situ dupla.
- Analisar os padrões de expressão de genes únicos e sobrepostos.
- Realçar a visualização da distribuição de mRNA em embriões de peixe-zebra.
Métodos Utilizados
- Hibridização de sondas de riboprobes antissenso ao mRNA alvo.
- Uso de anticorpos conjugados à peroxidase para detecção.
- Aplicação de fluoro tetra conjugado à aramida para visualização.
- Remoção por lavagem do IDE não ligado para revelar padrões de mRNA subcelular.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de padrões de expressão gênica em embriões de peixe-zebra.
- Capacidade de comparar a expressão de dois genes utilizando sondas distintas.
- A imagem de alta resolução revela distribuição subcelular detalhada.
- Efetividade comprovada do protocolo em um ambiente laboratorial.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para análise de expressão gênica.
- A imagem de alta resolução é essencial para estudos de biologia do desenvolvimento.
- Aplicações futuras podem incluir estudos comparativos da função gênica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A hibridização fluorescente in situ dupla de alta resolução em peixe-zebra permite o mapeamento espacial preciso da expressão gênica, apoiando a descoberta precoce e a validação de alvos em modelos de desenvolvimento e de doenças. A capacidade do protocolo de resolver domínios de expressão gênica sobrepostos e distintos com resolução subcelular aumenta a confiança preditiva na análise de vias e na redução de riscos mecanicistas. Essa capacidade é fundamental para a triagem de portfólios e o avanço da pesquisa translacional em sistemas de vertebrados.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da sobreposição da expressão gênica e das relações entre vias em embriões intactos.
- Apoia a validação funcional de alvos ao revelar padrões de localização de mRNA em nível subcelular.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas por meio de análise espacial de alta resolução de genes candidatos.
- Aprimora a confiança preditiva para a priorização de alvos em contextos desenvolvimentais complexos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara modelos validados de peixe-zebra para triagem subsequente da função gênica e sua modulação.
- Fornece saídas de imagem reprodutíveis e quantitativas para padronização de ensaios.
- Permite detecção multiplexada da expressão gênica, apoiando fluxos de trabalho escaláveis de triagem.
- Oferece leituras robustas para avaliar os efeitos de compostos em domínios de expressão gênica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a mapeamento da expressão gênica com modelos vertebrais relevantes para doenças, garantindo continuidade translacional.
- Apoia a descoberta de biomarcadores ao correlacionar a localização de mRNA com desfechos funcionais.
- Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco, esclarecendo a função gênica in vivo.
- Amplia o valor preditivo para seleção e validação de modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial de hipóteses até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, aproveitando o peixe-zebra como um sistema relevante para doenças.
- Biologia da Descoberta: Fornece dados espaciais de alta resolução para testes de hipóteses e esclarecimento de vias.
- Triagem: Fornece imagens quantitativas e reprodutíveis prontas para ensaios.
- Análises: Permite a comparação direta de domínios e sobreposições de expressão gênica utilizando microscopia confocal.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas e pesquisas pré-clínicas por meio do mapeamento da expressão gênica em embriões vertebrados inteiros.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e reutilizável para análise de expressão gênica em múltiplos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza a aquisição de imagens e a análise para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção do projeto e melhora a eficiência do capital ao esclarecer riscos biológicos precocemente.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de ativos em estágio de descoberta.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manejo de peixe-zebra, no design de sondas e em microscopia confocal.
- Requer acesso à infraestrutura de microscopia de fluorescência e análise de imagens.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de validação de sondas e de aquisição de imagens.
- A adaptação a outros modelos vertebrados pode exigir otimização do protocolo.
- A especificidade do sinal e a redução do fundo são fundamentais para uma interpretação confiável.
