Name: 焦距钙 2 + /sup瞬态检测平滑肌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: 学习高分辨率钙离子成像技术用于平滑肌功能研究，采用离体器官制备和共聚焦显微镜方法。该方案可分析神经递质对平滑肌活动的影响，为生理学研究人员提供详细实验流程。

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惠康基金会（Wellcome Trust）提供了资金支持（J.S.Y. 获得 VIP 奖项，K.L.B. 获得 074128 研究奖学金）。R.J.A. 获得医学研究理事会学生奖学金。
Leica_SP2_Stacker 是一种用于将 TIFF 文件导入并“重建”为序列的算法，该算法基于 Tony Collins 开发的 ImageJ 插件 Leica_tiff_sequence，用于读取 Leica SP2 的 TIFF 文件，此处使用已获得其许可。
（<a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a>）StackReg 和 TurboReg 是用于校正组织移动的算法，基于 Thévenaz 及其同事（1998）的研究9。
Excel_writer.jar 由 Kurt De Vos 编写（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html）。
JNCT0.08JoVE.ijm 是一种粒子检测算法，该算法基于 K.L. Brain 编写的算法，此前已有详细描述5。

第1部分：Ca2+指示剂（Oregon Green 488 BAPTA-1 AM）的配制
<ol>
<li>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM 以小瓶装形式提供，每瓶 500 μl，内含少量粉末（50 μg）。向粉末中加入 40 μl Pluronic F-127 溶液，轻轻振荡 30 秒，然后加入 460 μl PSS，再轻轻振荡 30 秒。最终得到 10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM 溶液，可分装为 4 份，每份 125 μl。避光保存于 -20 °C。</li>
</ol>
第二部分：Ca2+ 负载
<ol>
<li>从（-20 °C）冰箱中取出Ca2+指示剂（Oregon Green 488 BAPTA-1 AM），置于室温下解冻。</li>
<li>取1 ml PSS放入试管中，并置于水浴中。以约每秒1个气泡的速度通入95% O2 / 5% CO2混合气体。需将通气装置固定于试管中，例如使用橡胶塞或Parafilm密封。</li>
<li>从动物体内分离组织，在铺有Sylgard的培养皿中仔细去除结缔组织。无论平滑肌器官类型如何，每10分钟应更换一次PSS，并在解剖后充分洗涤组织（例如，更换PSS三次）。对于输精管：可考虑沿纵轴切开，制成片状组织。对于膀胱：从膀胱颈（后部）沿纵行切开至穹顶顶部（前部）。沿逼尿肌背侧表面制备四条组织条，每条长6–8 mm，宽1–2 mm，切割方向应与主要肌束走向一致。</li>
<li>将解剖好的组织置于“预温并持续通气”的PSS中。</li>
<li>向试管中加入125 μl的10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM溶液，用手轻轻振荡混匀。</li>
<li>恢复通气，并用铝箔覆盖避光孵育。组织充分摄取Ca2+指示剂所需时间因组织大小和平滑肌层厚度而异。例如：小鼠逼尿肌、大鼠肛尾肌约需70分钟，大鼠逼尿肌、小鼠输精管则需120分钟。</li>
</ol>
第3部分：为显微镜检查准备“Ca2+ 负载”的组织
必须仔细固定组织，以尽量减少组织的自发运动（这是对相对完整组织中的平滑肌细胞进行成像时的一个特性），并有助于定位合适的成像位置（因为平整的组织样本可在二维而非三维范围内进行观察）。
<ol>
<li>用持续通气的PSS溶液冲洗组织至少5分钟。</li>
<li>将组织展平并固定于涂有Sylgard的制备皿中，轻微拉伸组织使其形成平整的薄片。避免使用过长的“针”以免划伤物镜；建议使用短段直径为25-50 μm的银丝作为“针”，并以一定角度插入。</li>
<li>将制备皿置于显微镜载物台上，注意确保PSS不会溢出Sylgard涂层区域（否则在开始灌流时可能导致大面积被PSS覆盖）。</li>
<li>启动泵以对组织进行PSS灌流。通常采用的流速为每小时100 ml。</li>
<li>打开加热装置。</li>
<li>将进液管、出液管和温度探头放置在制备皿上（通过其底部的磁铁将各部件固定在金属条上）。出液管管口的高度将决定PSS的液面深度。需注意确认出液管确实在排出PSS（因有时初始阶段可能未有效排出）。</li>
<li>调节加热装置的温度设定至所需温度，例如33–35 °C。</li>
<li>让组织至少平衡10分钟。</li>
</ol>
第4部分：成像位点的选择
暴露于激发光照会使指示剂发生光漂白，因此应避免每次使用超过几秒钟。
<ol>
<li>使用低倍物镜（10x 或 20x），在落射荧光下用蓝光激发，观察平滑肌并确定一个合适的监测区域。选择成像位点时需考虑以下因素：运动程度（应尽可能小）以及视野中平滑肌细胞的数量。明亮的“结构”可能会在图像检测算法中产生大量“假阳性”信号，因此应避免选择含有大量（例如）散在的上皮细胞或成纤维细胞的区域。</li>
<li>切换至高倍物镜（40x）。</li>
<li>旋转载物台或光轴，使平滑肌细胞呈水平方向（即与快速扫描轴平行）。</li>
</ol>
第5部分：共聚焦显微镜
共聚焦显微镜的“设置”细节因显微镜类型而异，但关键考虑因素包括：速度（大多数Ca2+瞬变信号的检测至少需要5 Hz的采集速度）；分辨率和视场大小（这两者通常与速度相互权衡）。以下部分操作步骤针对Leica SP2直立式共聚焦显微镜。典型的操作方案为：以5 Hz采集100帧图像（256 × 256像素；约100 × 100 μm）或以13.5 Hz采集（256 × 64像素；约100 × 25 μm）。扫描头设置为双向扫描（以最大化采集速度），每行扫描速率为1000 Hz。
<ol>
<li>将针孔关闭至一个“艾里斑”大小。</li>
<li>在声光可调滤波器（AOTF）上将激光（488 nm）功率设置在25%至35%之间；该数值需在亮度与光漂白之间进行权衡（后者在长时间记录过程中尤为显著）。</li>
<li>每个位点采集六组序列，每种“处理”条件包含四至六个位点。通常需在给药前（即“对照”）和给药后监测相同的六个位点，但若发生显著的光漂白，实验人员可能无法严格遵循此方案。</li>
<li>进行Ca2+成像时，必须设置“时间对照”实验。</li>
</ol>
第6部分：分析前准备
<ol>
<li>从以下网址下载并安装 Image J：http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html。下载适用于您操作系统的版本，然后通过从 http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar 下载最新的 imageJ.jar 文件并替换原有文件，将软件更新至最新版本。苹果 Mac 用户：如果运行速度较慢，请确保使用 Apple 提供的最新版本 Java 虚拟机（JVM）（http://www.apple.com/macosx/features/java/）。</li>
<li>从以下网址下载 Excel_writer.jar：http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html，并将其安装到 Plugins [目录] > jar 目录中。</li>
<li>将以下文件复制到 Plugins 目录中：Leica_SP2_Stacker.class；JNCT0.08Release.ijm。使用 ImageJ 的 Plugins [菜单] > Macros > Install… 功能安装每个脚本。</li>
<li>我们使用徕卡SP2共聚焦显微镜，其配套软件（Leica LCS）可在软件内将每一系列生成为单个可观看的“视频”，但以单独的帧形式保存。要将帧重新构建成序列，请执行以下步骤：（i）确保所有需重建的“帧”均位于同一文件夹中（例如“DataFolder > Tiffs”）。（ii）选择插件[菜单] > 宏 > Leica_SP2_Stacker。选择根目录（例如“DataFolder”）。从下拉列表中选择目标文件夹（例如“Tiffs/”）。选择输出目录或创建新目录（例如“DataFolder > Stacks”）。随后，该脚本将从单个帧重建序列。</li>
</ol>
第7部分：校正运动伪影
尽管通过良好的固定和均匀拉伸组织可以尽量减少成像部位的移动，但某些平滑肌器官会表现出自发性收缩，仅靠仔细固定无法完全消除。本文介绍了如何使用一种 freely available 算法，对图像序列中的各帧进行对齐或匹配。
<ol>
<li>下载“StackReg”（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）和“TurboReg”（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）。</li>
<li>使用“插件 > 宏 > 安装…”将每个插件安装到Plugins目录中。</li>
<li>加载待处理的图像序列（文件 > 打开…），然后切换到一个能清晰显示目标区域的帧。其他帧将以此参考帧为基准进行对齐。</li>
<li>插件 > 图像序列 > StackReg。尝试不同的“变换”方式（即平移、刚体、缩放旋转、仿射），以确定哪种方法最有效。（更多详情：http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）</li>
</ol>
第8部分：粒子检测算法
对于每个成像的“位点”，影响Ca2+瞬变信号检测的因素各不相同。通过测量每个位点的某些特性（“颗粒参数”，详见下文），可促进检测过程。因此，针对每个位点，需计算“差值阈值”、“比值阈值”和“细胞边缘阈值”。
<ol>
<li>插件 [菜单] > 宏 > 安装…，然后选择‘JNCT0.08Release.ijm’。</li>
<li>插件 [菜单] > 宏 > 加载堆栈（快捷键：l）。选择一个序列并计算粒子参数：<ol style="list-style:none;">
<li>a. 用于减去的阈值（= 背景）</li>
</ol></li>
<li>在您认为是“背景”的区域上选择一个矩形感兴趣区域（ROI）。</li>
<li>测量（快捷键：m）。记录下平均值（MEAN）。<ol style="list-style:none;">
<li>b. 计算比值的阈值</li>
</ol></li>
<li>在细胞的光学平坦区域周围选择一个矩形感兴趣区域（ROI）。</li>
<li>测量（快捷键：m）。记录下平均值（MEAN）和标准差（STANDARD DEVIATION）。</li>
<li>再重复两次，或者您可以通过按住‘shift’键一次性绘制三个框。</li>
<li>计算并记录比值的阈值 = (1 + 标准差/平均值) × 32，并对三次重复/位点的数值取平均。<ol style="list-style:none">
<li>c. 细胞边缘阈值</li>
</ol></li>
<li>图像 > 堆栈 > Z 投影… 选择投影类型：“平均强度”</li>
<li>图像 > 调整 > 阈值。</li>
<li>选择黑白模式。</li>
<li>定义“下限”（上方滑块），并记录对应的数值（滑块右侧）。仅在黑色区域中发生的事件将被计数。</li>
<li>点击“重置”。</li>
<li>分析堆栈（快捷键：2）</li>
<li>此阶段仅选择一个序列，即“第一个文件”和“最后一个文件”应相同。</li>
<li>输入“用于减去的阈值”、“比值阈值”和“细胞边缘阈值”。其余设置保持默认值。</li>
<li>算法将生成一个双窗格窗口，左侧显示处理后的序列，右侧显示原始图像。请仔细检查，评估假阳性事件的数量，以及肉眼可见但未被检测到的事件情况。为了更准确地检测Ca2+瞬变，可能需要轻微调整某些“粒子参数”。虽然初次尝试时该过程可能略显“试错”，但您会很快掌握哪些参数是关键的。</li>
<li>对于每个序列，算法将生成一个Excel文件，详细列出所检测事件的特征（如幅度、面积和位置）。通过回顾算法输出的图像文件（例如步骤8.17）识别出的“假阳性”事件，可手动从该Excel文件中删除。</li>
</ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

已尽力减少所用动物数量并减轻其痛苦；所有实验均依照英国《1986年动物（科学程序）法案》及欧洲共同体理事会指令86/09/EEC进行。

荧光 Ca2+ 指示剂的选择
选择Oregon Green 488 BAPTA-1 AM作为Ca2+指示剂，原因如下：（i）与其他指示剂（如Fluo-4和Calcium Green）相比，其荧光亮度更高1；（ii）对细胞内Ca2+浓度[Ca2+]i生理变化敏感，其解离常数Kd与细胞内Ca2+浓度处于相似数量级1（例如输精管组织2）；（iii）可有效加载至大量平滑肌细胞中，便于监测平滑肌细胞间的耦合情况。然而，Oregon Green 488 BAPTA-1 AM是一种非比率型Ca2+指示剂，因此难以用于测定绝对的[Ca2+]i值。此外，当其浓度过高时，可能对Ca2+产生缓冲作用，并在[Ca2+]i发生大幅度变化时出现荧光饱和现象。
抑制自发性收缩活动
平滑肌器官的自发性收缩可通过药物作用而降低，例如通过阻断L型Ca2+通道介导的Ca2+内流（如：硝苯地平3；地尔硫䓬4）。需注意，这些药物将显著降低全细胞Ca2+闪光/瞬变的幅度。
输精管的收缩主要由嘌呤能和去甲肾上腺素能神经传递共同介导。然而，该组织中的局灶性 Ca2+ 瞬变对去甲肾上腺素能受体阻断（例如，通过哌唑嗪阻断 α1 肾上腺素受体5）不敏感，因此可在不影响局灶性 Ca2+ 瞬变的情况下减少组织运动。
或者，可通过抑制肌球蛋白轻链激酶（例如使用渥曼青霉素）在“下游”阻止收缩6。
结论
以亚微米分辨率监测 Ca2+ 荧光是一种强大的技术，可用于研究神经递质释放的突触后效应5,7以及细胞内储存库释放 Ca2+ 的过程（例如“钙火花”8）。与商业化的图像分析软件包相比，采用本文所述方法分析 Ca2+ 瞬变信号具有成本低的优势，并且可通过为 ImageJ 自定义编写的 Java 插件实现个性化分析。

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>二甲基亚砜中的 20% 溶液</td></tr><tr><td>Leica SP2 直立共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气浮台（&amp;#8216;隔振工作台&amp;rsquo;）</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 弹性体</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

平滑肌中局灶性 ca2+ 瞬变的检测

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

平滑肌的 Ca2+ 成像可揭示那些可能不引起膜电位变化的细胞机制，例如细胞内钙库的 Ca2+ 释放，并可同时监测多个细胞，以评估例如合胞体组织中的细胞耦联情况。亚细胞水平的 Ca2+ 瞬变在平滑肌中较为常见，但由于其随机发生、视野通常较广，且器官本身易于收缩，因此难以准确测量。为解决这一问题，我们开发了一系列成像方案和分析流程，能够以自动化方式获取并分析此类事件的频率、位置和幅度。尽管该方法可应用于其他情境，但我们自身的工作主要涉及检测局部嘌呤能性 Ca2+ 瞬变，以亚微米分辨率定位神经递质释放位点。 
ATP 作为共递质从自主神经末梢释放，与膀胱逼尿肌和输精管平滑肌上的 P2X1 受体结合。Ca2+ 进入平滑肌细胞，产生嘌呤能神经效应器 Ca2+ 瞬变（NCTs）。这种局灶性 Ca2+ 瞬变使得能够以光学方式监测神经递质的释放，该方法相较于电生理学具有诸多优势。除了显著提高的空间分辨率外，光学记录的另一优势在于可同时记录来自多个可区分位点的递质释放。此外，在长时间记录过程中，维持或调整光学焦平面比重新定位细胞内锐利微电极更为简便。 
综上所述，本文概述了一种Ca2+荧光成像方法，详细介绍了组织制备、数据采集与分析过程。我们还阐述了多个用于分析此类Ca2+瞬变信号的脚本的使用方法。

详细介绍在离体器官中对平滑肌进行高分辨率 Ca2+ 成像的方法，包括：组织制备、图像采集和数据分析。

平滑肌中局灶性 Ca2+ 瞬变的检测

平滑肌的Ca2+成像可揭示可能不会引起膜电位变化的细胞机制，例如Ca2+的释放……

首先，配制钙负载溶液，并将其加热和通气。取出膀胱，切开后展平并用针固定，取一段逼尿肌。将逼尿肌条放入负载溶液中，孵育并冲洗，然后展平固定。组织内钙信号的荧光通过激光激发，并捕获所产生的发射光。通过比较连续的图像帧来分析由单帧组成的视频。扣除背景信号。细胞边缘阈值决定了事件可能出现的位置，并计算连续大脑图像之间的比值。如果剩余的事件符合预设标准，则会被高亮并标记。您好，我叫 John Young，来自牛津大学药理学系 Keith Brain 和 Tom Kinane 的实验室。我是 Rob Amos，也来自 Brain 与 Canne 实验室，这位是 Keith Brain。今天，John 和 Rob 将向您展示一种在平滑肌中进行钙成像的技术。我们在实验室中使用该技术来研究自主神经末梢神经递质的释放及其对平滑肌的影响。那么我们开始吧。钙离子指示剂Fluo-4 88 BAFTA 1:00 AM为每支500微升的瓶装，内含50微克粉末。配制钙离子指示剂时，先向粉末中加入40微升Onic F1 27溶液，轻轻振荡30秒；随后加入460微升生理盐水溶液（PSS），再轻轻振荡30秒。最终溶液为10微摩尔的Organ Green。4 88 BAFTA 1:00 AM可提供四份等量样品，每份125微升。避免光照，并在解剖目标组织前将溶液置于负20摄氏度保存。将钙离子指示剂从冷冻箱中取出，在室温下解冻，同时保持钙离子指示剂处于避光状态。取1 mL PSS溶液加入试管中，并将试管置于33摄氏度的水浴中。用橡胶塞将通气管固定在试管中，也可使用通气针，然后以每秒约一个气泡的速度通入95%氧气与5%二氧化碳的混合气体。从动物体内解离出平滑肌器官。本实验中为小鼠的膀胱。将器官置于约50毫米的PSS中冲洗。组织清洗后，仔细去除膀胱周围的脂肪组织和结缔组织。按照泌尿膀胱的平滑肌劳里安型进行解剖。从膀胱颈开始，沿纵行方向切开，由尾端至穹顶顶部。在头端背侧表面，沿主要肌束走向制备四条长6至8毫米、宽1至2毫米的组织条。将解剖后的组织与预先加温并通入气体的PSS混合，向试管中的组织加入125微升浓度为10微摩尔的Organ Green 488B，在室温下避光孵育1小时。用手轻轻振荡以混匀。将试管放回水浴槽中，恢复通气，并用铝箔覆盖水浴槽。组织充分摄取钙离子指示剂所需的时间因组织大小和光滑肌层厚度而异。例如，小鼠膀胱逼尿肌和大鼠输精管的孵育时间为70分钟，而大鼠膀胱逼尿肌和小鼠输精管深部组织则需要孵育120分钟。组织加载钙离子指示剂后，即可进行显微镜观察前的准备。首先，用持续通气的PSS溶液冲洗组织10分钟。接着，将组织置于内衬S型护栅的制备皿中。轻轻拉伸以形成平整的薄片。使用较短的金属丝将组织固定，例如直径为25至50微米、长2毫米的银丝，并以一定角度插入固定针。避免使用长度超过几毫米的图钉，因为它们可能会划伤物镜。仔细固定组织对于减少组织的自发移动以及便于定位合适的成像位置至关重要。组织固定完毕后，将样本培养皿置于显微镜载物台上。注意防止PSS从培养皿中硅胶防护线区域溢出，因为这可能导致PSS覆盖较大区域。出于演示目的，当开始灌流时，以下步骤将在光照条件下进行。请注意，这些实验通常在黑暗条件下进行。开启泵以对制备样品进行灌流。使用PSS时，常用流速为100毫升每小时。打开加热装置，将进液管、出液管和温度探头放置于固定装置的培养皿中，并利用其底部的磁铁将各管固定在金属条上。出液管尖端的高度将决定生理盐溶液（PSS）的深度。注意确保出液管确实在排出PSS，因为有时可能并未有效排出。首先将加热装置的温度设定为达到33至35摄氏度之间的目标温度。使用低倍物镜使组织至少平衡10分钟。重复10至20次。使用落射荧光或蓝光激发来观察平滑肌，并确定一个合适的监测区域。由于激发光照会导致指示剂发生光漂白，因此每次观察时间应避免超过几秒钟。避免选择具有明亮结构的区域，因为这些结构可能导致图像检测算法出现大量假阳性结果。应尽量选择运动较少且视野中平滑肌细胞数量较多的区域。选定成像区域后，切换至更高倍率的物镜，例如 40 x。旋转载物台或光轴，使平滑肌细胞呈水平方向，即与快速扫描轴平行。此时平滑肌细胞已准备好进行共聚焦显微镜成像。在本实验方案中，我们使用 Leica SP 两台直立共聚焦显微镜。将针孔关闭至一个艾里斑大小。在定制光学可调滤光片上，将激光功率设置在 25% 至 35% 之间。该数值在亮度和光漂白之间进行权衡。为准备数据分析，请下载并安装 ImageJ。下载适用于您操作系统的版本，然后通过下载最新的 ImageJ jar 文件替换原有文件，以更新至最新版本。接着，下载 Excel Writer jar 文件，并将其安装到插件 jar 目录中。将这些文件复制到插件目录中。使用插件宏安装每个脚本。通过我们使用的徕卡SP2共聚焦显微镜配套软件Leica的Image J安装功能进行安装。LCS 将每个序列的各个帧保存为单独的文件。要重建该序列，请确保所有需要重建的帧都位于同一个文件夹中。例如，数据文件夹中的 tiffs。然后从插件宏菜单中选择 Leica SP 两个堆栈宏。在此情况下，选择根目录数据文件夹。从下拉列表中选择所需的文件夹。在本例中，tiffs 选择一个输出目录或创建一个新的目录。例如，数据文件夹堆栈。然后，该脚本将通过将单个帧重新组合为序列，以校正运动伪影。我们使用一种 freely available 的算法，对序列下载堆栈中的帧进行配准或匹配，即 rig 和 turbo reg。将各自的文件复制到 stacks 文件夹中。加载一个待处理的图像序列，然后移动到一个能清晰显示目标区域的帧。其他帧将以此参考帧为基准进行对齐。随后，进入插件菜单中的图像序列功能。叠加配准。尝试不同的变换方法，以确定对每个位点最有效的方案。影响钙瞬变检测的成像因素将因各检测位点的特定性质和颗粒参数而异。检测的灵敏度和特异性得到提高。因此，对于每个位点，我们将计算用于比值的减法阈值以及细胞边缘阈值。首先，进入插件，宏，安装，并选择 jn CTO dot oh eight release dot IJM JM。然后进入插件宏加载堆栈。选择一个系列并计算以下颗粒参数。为计算相减图像的阈值，请在您认为是背景的区域上选择一个矩形兴趣区域进行测量，并记录其平均值。为计算比值图像的阈值，请在平滑肌细胞或细胞群中光学平坦的区域周围选择一个矩形兴趣区域。测量并记录均值和标准差。重复该过程两次，或按住 Shift 键一次性绘制三个方框。计算并记录比值的阈值。计算方法为：标准差除以均值后加1，再将结果乘以32。对三个重复样本的数值取平均，乘以32这一系数是为了匹配比值算法，其中相对于前一帧无变化的情况被映射为整数值32。该系数提供了良好的动态范围，以检测比值的升高和降低。对于八位图像，选择图像调整阈值。选择黑白模式。在上限滑块下方进行定义，并记录相应的数值。此区域位于滑块右侧。仅黑色区域内的事件将被计入。单击重置。现在，减去的比值阈值和细胞边缘阈值已经计算完成，我们可以开始分析图像堆栈。确定待分析堆栈的位置。在此阶段仅选择一个系列。这是第一个文件，最后一个文件应与此相同。然后选择数据文件和堆栈的输出位置。例如，选择数据文件夹作为输出目录。输入用于减去比值阈值和设定边缘阈值的阈值数值。其余设置保持默认值。该算法将生成一个双窗格窗口，其中左侧显示处理后的序列，右侧显示原始序列。从输出文件夹中打开此文件，并仔细检查以评估假阳性事件的数量，以及肉眼可见但未被算法检测到的事件情况。对于每个序列，算法会生成一个 Excel 文件，详细列出所检测事件的特征，例如幅值、面积和位置；通过回顾算法输出的图像文件所识别出的假阳性事件，可手动从此 Excel 文件中删除，但应严格把握删除标准。这是一段关于平滑肌中钙瞬变的影像。在此示例中，该影像由以5赫兹采集的100个单独帧组成。在实验中，例如研究某种特定药物对钙瞬变频率的影响时，我们会采集大量此类影像。此处可见平滑肌细胞中存在大量自发性钙瞬变。图中显示了颗粒检测算法的结果。对于每个序列，该算法会生成一个 Excel 文件，详细记录所检测到事件的特征，例如振幅、面积和位置。我们已经展示了一种用于成像平滑肌器官（如膀胱）中钙瞬变的方法，并且展示了如何使用实验室开发的算法来分析这些钙瞬变。需要牢记的关键点是，必须为钙成像做好充分的组织准备。以我们今天所演示的组织为例，这包括去除结缔组织以及可能遮挡视野的任何脂肪组织。将组织固定成平整的片状也很重要。祝您的实验顺利，感谢观看。

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