Name: Banking cérebro: Fazer oa maioria de espécimes sua Pesquisa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a preparar amostras cerebrais para corte em criostato com amostragem sistemática em banco de cérebro. Este método preserva antígenos para imuno-histoquímica e análise estereológica imparcial em pesquisas neurocientíficas.

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Os autores gostariam de agradecer Ikiel Ptito por seu contínuo apoio técnico.

Parte 1: Pré-processamento de tecido <ol><li> Tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeído, glutaraldeído ou formalina. Isto pode ser conseguido através de perfusão transcardial padrão normalmente utilizado para a colheita de outros órgãos. No presente estudo o assunto estava profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente sangrar. Isso é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro). </li><li> O cérebro deve ser stereotaxically bloqueado, retirados do crânio, pesado, e volume determinado 2. O tecido deve então ser cryoprotected em soluções de sacarose classificados com uma concentração final de sacarose 30% em tampão fosfato. Blocos de tecido deve então ser congelados em isopentano a -65 ° C e armazenadas a -80 ° C até que esteja pronto para cortar. </li></ol> Parte 2: Amostragem Sistemática <ol><li> Amostragem sistemática depende de um bom plano antes do corte. Toda a região de interesse, tanto as extensões rostral-caudal e dorso-ventral devem ser bem definidos. Um atlas estereotáxico das espécies em uso é útil para definir a região de interesse e para determinar o comprimento da região de interesse. Uma vez que o comprimento da região de interesse é determinado, é necessário estabelecer o intervalo de amostragem. Por exemplo, desde o atlas estereotáxico-lo a determinar que a extensão rostro-caudal total da região de interesse é de aproximadamente 3 milímetros de comprimento quando o corte no plano coronal. Você, então, decidir o criostato a seção de 50 ìm, a este ritmo, terá 60 seções que cobrem a extensão rostral-caudal da região de interesse. Para um estudo imparcial típico estereológica 10/06 seções sistematicamente amostradas são necessários para obter resultados confiáveis. Neste exemplo, 10 seções igualmente espaçados ao longo do resultado extensão rostro-caudal em um intervalo de amostragem de 1 / 6 seções. </li></ol> Parte 3: Criação do banco de cérebros <ol><li> Uma vez que a frequência de amostragem foi determinada seção, o próximo passo é determinar quais as manchas serão realizados imediatamente. Por exemplo, se você estiver com coloração violeta cresil você irá capturar 06/01 seções em um slide. Esta será uma série. Se você sabe que há talvez vários anticorpos potencial que você gostaria de correr, mas tanto quer ver os dados que o seu principal fornece mancha ou simplesmente não têm o tempo para realizar a imuno-histoquímica, coloque o restante da série 5 seções na ordem em que eles foram cortados em poços preservar antígeno contendo (1 polivinil pirrolidona%, etileno glicol 50% em o.1M PBS, pH 7,4). A tabela abaixo fornece um sistema de amostragem composta por uma lâmina e uma placa (placa de 48 bem-padrão) de seções como parte de um banco de cérebros (Tabela 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. A freqüência de amostragem seção aqui é 06/01. A primeira seção é colocado sobre uma lâmina para coloração violeta cresil e os próximos 5 seções são colocados em antígeno preservar. Número da seção 7 é então capturado no slide e seções 9-12 são colocados em antígeno preservar. Este ciclo é repetido até que a região de interesse ou bloco de tecido é exaustivamente seccionado. </li><li> O próximo passo é exaustivamente seção do bloco de tecido. Coloque uma pequena quantidade de incorporação de média no mandril e deixá-lo congelar. Coloque o chuck na cabeça micrótomo e raspar o suficiente do meio de congelados para ter uma superfície plana. Remova o mandril da cabeça do micrótomo e local plano dentro do criostato. Despeje sobre a incorporação de médio chuck e firmemente colocar o bloco do cérebro com o lado stereotaxically corte posicionado categoricamente sobre o mandril. Lentamente e completamente incorporar o cérebro no meio de montagem. Coloque o chuck com o cérebro na cabeça do micrótomo e seção usando os parâmetros pré-determinados para a frequência de amostragem seção. </li><li> Assim que o bloco de tecido tem sido exaustivamente seccionados e as secções são colocadas em poços, cobrir a placa com a tampa, envolva a tampa com parafilme, e colocar em um freezer -20 C °. Registrar o número total de seções tomadas para cada série, o intervalo de seção de amostragem, eo número de série para cada animal. Este log será vital para manter o controle de posterior remoção de seções do banco de cérebros para imunohistoquímica futuro. </li></ol> Parte 4: Resultados Representante: Amostragem sistemática desta maneira tem sido uma prática comum em nosso laboratório durante os últimos três anos. Tivemos um grande sucesso da imuno-histoquímica desempenho no material que foi armazenado em antígeno preservar três anos depois que foi cortada, sem deterioração do sinal (Figura 1). Além disso, como parte do nosso banco de cérebros, temos registrados cerca de 20.000 seções sistemática da não-humanosprimata cérebro (Figura 2) como parte de nossos planos de investigação a longo prazo. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> Figura 1. Esta é uma seção do pólo occipital do primata não-humano histoquímica para NeuN mostrando tanto a camada VI e intersticial neurônios da substância branca. Esta seção especial foi armazenado em antígeno preservar a -20 ° C por um período de dois anos. Barra de escala = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Nosso banco de cérebros vervet agora consiste de cerca de 20 mil seções sistemática de mais de 30 macacos.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Amostragem sistemática é um método barato pretende maximizar material de pesquisa. Esta estratégia de amostragem foi desenvolvido em conformidade com a legislação de estereologia imparcial que requer amostragem sistemática em toda a região. É fundamental que a ordem das secções para cada série é mantida. Em nosso laboratório temos utilizado com sucesso este método para operações bancárias tanto hamster e não-humanos seções cérebro dos primatas. Até agora, nós coletamos seções cérebro perto de 20 mil macacos vervet (...

<table><tbody><tr><td>Glicol etileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Poli(vinilpirrolidona)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Meio de inclusão Thermal Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

banking cérebro: fazer oa maioria de espécimes sua pesquisa

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Estereologia imparcial é um método para estimar com precisão e eficiência o número de neurônios total (ou outro tipo de célula) em uma determinada área de interesse<sup&gt; 1</sup&gt;. Para atingir este objetivo 6-10 seções sistemática deve ser sondado cobrindo toda a estrutura. Normalmente, isso envolve o processamento 05/01 seções que deixa uma quantidade significativa de matérias não transformadas. A fim de maximizar o material, propomos um método barato para a preservação do tecido fixado no âmbito de um plano de pesquisa de longo prazo de armazenamento. Como o tecido é cortado e processado para a desejada mancha ou anticorpos, seções alternadas devem ser sistematicamente colocado em antígeno preservar a -20 ° C para processamento futuro. Usando placas de 24 poços, seções podem ser colocados em ordem para recuperação futura. Usando este método, o tecido pode ser armazenada e processada para imuno-histoquímica ao longo de anos.

Bancário cérebro e amostragem sistemática de material biológico fornece a base para estereologia imparcial e maximiza o potencial de dados obtidos de cada espécime.

Banking cérebro: Fazer oa maioria de espécimes sua Pesquisa

A estereologia não enviesada é um método para estimar de forma precisa e eficiente o número total de neurônios (ou outro tipo celular) em uma determinada área de interesse1. Para ...

Para iniciar este procedimento, o bloco de cérebro deve ser preparado para o criostato e a frequência de amostragem das seções deve ser determinada. Em seguida, o antígeno preservado e as lâminas devem ser preparados. O bloco de cérebro deve ser colocado sobre o mandril dentro do criostato.Uma vez que o cérebro esteja firmemente embutido na seção do porta-bloco com uma espessura predefinida, devem ser realizados cortes sistemáticos de modo que a série um seja colocada em uma lâmina, e séries adicionais sejam colocadas em poços previamente preenchidos com conservante de antígeno. Após o esgotamento do bloco, coloque a placa em um congelador a menos 20 graus Celsius como parte do seu banco de cérebros. Olá, sou o Dr. Mark Burke do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal.Olá, sou o Dr. Shahin Zur, também do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Olá, sou o Dr. Mo Petto, diretor do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Hoje vamos mostrar um procedimento para armazenamento sistemático de tecido cerebral com preservação de antígenos.Utili

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um modelo de rato do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), que revela as alterações persistentes na função neuroendócrina eo atraso de longo prazo, resposta de medo exagerado, característico de pacientes com TEPT. O modelo animal e os métodos descritos aqui são úteis para correlacionar biomarcadores em núcleos do cérebro, que são mecanicista, mas não pode ser medido em pacientes com biomarcadores em células brancas do sangue periférico, os quais podem.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

O vídeo demonstra um procedimento passo a passo para dissecar simetricamente um cérebro humano post-mortem fixo, preparando blocos de tecido menores para análise posterior.

Seccionamento bi-hemisférico simétrico do cérebro humano post-mortem

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

procedimentos de corte do cérebro organizados são necessários para correlacionar fenômenos neuropsiquiátricos específicos com diagnósticos neuropatológicos definitivas. estacas cerebrais são realizados de forma diferente com base em diversas contingências clínico-acadêmico. Este protocolo descreve um procedimento de corte cérebro bihemispheric simétrica para investigar diferenças hemisféricas de patologias do cérebro humano e maximizar as técnicas biomolecular / neuroimagem atuais e futuras.

Symmetric Bihemispheric Postmortem Cérebro de corte para o Estudo de Saúde e Condições Patológicas cerebral em humanos

Aqui, apresentamos um protocolo para congelar e secção de tecido cerebral de vários animais como uma alternativa economiza tempo de processamento único cérebro. Isto reduz a variabilidade de coloração durante a imuno-histoquímica e reduz o tempo cryosectioning e imagens.

Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Este protocolo descreve um método para rastrear trajetórias individuais de envelhecimento cerebral através de um programa de doação cerebral e caracterização adequada de cérebros. Doadores cerebrais estão envolvidos em um estudo longitudinal de longo prazo, incluindo avaliações multidimensionais em série. O protocolo contém uma descrição detalhada do processamento cerebral e uma metodologia de diagnóstico precisa.

Protocolo do Banco Cerebral Abbiategrasso para coleta, processamento e caracterização de cérebros envelhecidos

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis.

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Os biobancos são recursos cruciais para a investigação biomédica e a Unidade Biobank for Translational and Digital Medicine do Instituto Europeu de Oncologia é um modelo neste domínio. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada dos procedimentos operacionais padrão dos biobancos para o manejo de diferentes tipos de amostras biológicas humanas.

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Melhorando a confiabilidade do biobanco de tumores de próstata com técnica de amostragem aprimorada e caracterização histológica

As neurociências modernas precisam explorar as diferenças entre muitas espécies, incluindo roedores de laboratório e humanos. No entanto, surgem dificuldades técnicas quando mamíferos de cérebro grande estão envolvidos. Essa abordagem aborda a variação interespécies das populações neuronais em mamíferos amplamente diferentes, produzindo resultados comparáveis a serem mapeados para revelar padrões evolutivos.

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