Name: Banking cérebro: Fazer oa maioria de espécimes sua Pesquisa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a preparar amostras cerebrais para corte em criostato com amostragem sistemática em banco de cérebro. Este método preserva antígenos para imuno-histoquímica e análise estereológica imparcial em pesquisas neurocientíficas.

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Os autores gostariam de agradecer Ikiel Ptito por seu contínuo apoio técnico.

Parte 1: Pré-processamento de tecido <ol><li> Tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeído, glutaraldeído ou formalina. Isto pode ser conseguido através de perfusão transcardial padrão normalmente utilizado para a colheita de outros órgãos. No presente estudo o assunto estava profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente sangrar. Isso é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro). </li><li> O cérebro deve ser stereotaxically bloqueado, retirados do crânio, pesado, e volume determinado 2. O tecido deve então ser cryoprotected em soluções de sacarose classificados com uma concentração final de sacarose 30% em tampão fosfato. Blocos de tecido deve então ser congelados em isopentano a -65 ° C e armazenadas a -80 ° C até que esteja pronto para cortar. </li></ol> Parte 2: Amostragem Sistemática <ol><li> Amostragem sistemática depende de um bom plano antes do corte. Toda a região de interesse, tanto as extensões rostral-caudal e dorso-ventral devem ser bem definidos. Um atlas estereotáxico das espécies em uso é útil para definir a região de interesse e para determinar o comprimento da região de interesse. Uma vez que o comprimento da região de interesse é determinado, é necessário estabelecer o intervalo de amostragem. Por exemplo, desde o atlas estereotáxico-lo a determinar que a extensão rostro-caudal total da região de interesse é de aproximadamente 3 milímetros de comprimento quando o corte no plano coronal. Você, então, decidir o criostato a seção de 50 ìm, a este ritmo, terá 60 seções que cobrem a extensão rostral-caudal da região de interesse. Para um estudo imparcial típico estereológica 10/06 seções sistematicamente amostradas são necessários para obter resultados confiáveis. Neste exemplo, 10 seções igualmente espaçados ao longo do resultado extensão rostro-caudal em um intervalo de amostragem de 1 / 6 seções. </li></ol> Parte 3: Criação do banco de cérebros <ol><li> Uma vez que a frequência de amostragem foi determinada seção, o próximo passo é determinar quais as manchas serão realizados imediatamente. Por exemplo, se você estiver com coloração violeta cresil você irá capturar 06/01 seções em um slide. Esta será uma série. Se você sabe que há talvez vários anticorpos potencial que você gostaria de correr, mas tanto quer ver os dados que o seu principal fornece mancha ou simplesmente não têm o tempo para realizar a imuno-histoquímica, coloque o restante da série 5 seções na ordem em que eles foram cortados em poços preservar antígeno contendo (1 polivinil pirrolidona%, etileno glicol 50% em o.1M PBS, pH 7,4). A tabela abaixo fornece um sistema de amostragem composta por uma lâmina e uma placa (placa de 48 bem-padrão) de seções como parte de um banco de cérebros (Tabela 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. A freqüência de amostragem seção aqui é 06/01. A primeira seção é colocado sobre uma lâmina para coloração violeta cresil e os próximos 5 seções são colocados em antígeno preservar. Número da seção 7 é então capturado no slide e seções 9-12 são colocados em antígeno preservar. Este ciclo é repetido até que a região de interesse ou bloco de tecido é exaustivamente seccionado. </li><li> O próximo passo é exaustivamente seção do bloco de tecido. Coloque uma pequena quantidade de incorporação de média no mandril e deixá-lo congelar. Coloque o chuck na cabeça micrótomo e raspar o suficiente do meio de congelados para ter uma superfície plana. Remova o mandril da cabeça do micrótomo e local plano dentro do criostato. Despeje sobre a incorporação de médio chuck e firmemente colocar o bloco do cérebro com o lado stereotaxically corte posicionado categoricamente sobre o mandril. Lentamente e completamente incorporar o cérebro no meio de montagem. Coloque o chuck com o cérebro na cabeça do micrótomo e seção usando os parâmetros pré-determinados para a frequência de amostragem seção. </li><li> Assim que o bloco de tecido tem sido exaustivamente seccionados e as secções são colocadas em poços, cobrir a placa com a tampa, envolva a tampa com parafilme, e colocar em um freezer -20 C °. Registrar o número total de seções tomadas para cada série, o intervalo de seção de amostragem, eo número de série para cada animal. Este log será vital para manter o controle de posterior remoção de seções do banco de cérebros para imunohistoquímica futuro. </li></ol> Parte 4: Resultados Representante: Amostragem sistemática desta maneira tem sido uma prática comum em nosso laboratório durante os últimos três anos. Tivemos um grande sucesso da imuno-histoquímica desempenho no material que foi armazenado em antígeno preservar três anos depois que foi cortada, sem deterioração do sinal (Figura 1). Além disso, como parte do nosso banco de cérebros, temos registrados cerca de 20.000 seções sistemática da não-humanosprimata cérebro (Figura 2) como parte de nossos planos de investigação a longo prazo. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> Figura 1. Esta é uma seção do pólo occipital do primata não-humano histoquímica para NeuN mostrando tanto a camada VI e intersticial neurônios da substância branca. Esta seção especial foi armazenado em antígeno preservar a -20 ° C por um período de dois anos. Barra de escala = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Nosso banco de cérebros vervet agora consiste de cerca de 20 mil seções sistemática de mais de 30 macacos.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Amostragem sistemática é um método barato pretende maximizar material de pesquisa. Esta estratégia de amostragem foi desenvolvido em conformidade com a legislação de estereologia imparcial que requer amostragem sistemática em toda a região. É fundamental que a ordem das secções para cada série é mantida. Em nosso laboratório temos utilizado com sucesso este método para operações bancárias tanto hamster e não-humanos seções cérebro dos primatas. Até agora, nós coletamos seções cérebro perto de 20 mil macacos vervet (...

<table><tbody><tr><td>Glicol etileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Poli(vinilpirrolidona)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Meio de inclusão Thermal Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

banking cérebro: fazer oa maioria de espécimes sua pesquisa

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Estereologia imparcial é um método para estimar com precisão e eficiência o número de neurônios total (ou outro tipo de célula) em uma determinada área de interesse<sup&gt; 1</sup&gt;. Para atingir este objetivo 6-10 seções sistemática deve ser sondado cobrindo toda a estrutura. Normalmente, isso envolve o processamento 05/01 seções que deixa uma quantidade significativa de matérias não transformadas. A fim de maximizar o material, propomos um método barato para a preservação do tecido fixado no âmbito de um plano de pesquisa de longo prazo de armazenamento. Como o tecido é cortado e processado para a desejada mancha ou anticorpos, seções alternadas devem ser sistematicamente colocado em antígeno preservar a -20 ° C para processamento futuro. Usando placas de 24 poços, seções podem ser colocados em ordem para recuperação futura. Usando este método, o tecido pode ser armazenada e processada para imuno-histoquímica ao longo de anos.

Bancário cérebro e amostragem sistemática de material biológico fornece a base para estereologia imparcial e maximiza o potencial de dados obtidos de cada espécime.

Banking cérebro: Fazer oa maioria de espécimes sua Pesquisa

A estereologia não enviesada é um método para estimar de forma precisa e eficiente o número total de neurônios (ou outro tipo celular) em uma determinada área de interesse1. Para ...

Para iniciar este procedimento, o bloco de cérebro deve ser preparado para o criostato e a frequência de amostragem das seções deve ser determinada. Em seguida, o antígeno preservado e as lâminas devem ser preparados. O bloco de cérebro deve ser colocado sobre o mandril dentro do criostato.Uma vez que o cérebro esteja firmemente embutido na seção do porta-bloco com uma espessura predefinida, devem ser realizados cortes sistemáticos de modo que a série um seja colocada em uma lâmina, e séries adicionais sejam colocadas em poços previamente preenchidos com conservante de antígeno. Após o esgotamento do bloco, coloque a placa em um congelador a menos 20 graus Celsius como parte do seu banco de cérebros. Olá, sou o Dr. Mark Burke do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal.Olá, sou o Dr. Shahin Zur, também do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Olá, sou o Dr. Mo Petto, diretor do Laboratório de Neurociências Visuais da Escola de Optometria da Universidade de Montreal. Hoje vamos mostrar um procedimento para armazenamento sistemático de tecido cerebral com preservação de antígenos.Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para maximizar o material de pesquisa e como base para realizar teologia imparcial. Então, vamos começar. Este protocolo descreve como amostrar sistematicamente tecido cerebral que foi fixado, cortado estereotaxicamente em fatias espessas de um centímetro e congelado.Para visualizar essas etapas iniciais em detalhes, consulte nosso artigo recente no JoVE sobre a dissecação do cérebro de primata não humano no espaço estereotáxico. O primeiro passo na amostragem sistemática é criar seu plano de amostragem, decidir como você seccionará seu tecido, como dividirá essas seções em séries ou amostras, e como organizará e controlará essas amostras. Primeiro, consulte um atlas estereotáxico conforme necessário.Defina claramente sua região de interesse nas dimensões rostral, caudal e dorsal-ventral e escolha o seu plano de secionamento. Em seguida, decida a espessura que dará às suas secções e calcule quantas secções podem ser obtidas a partir da sua região de interesse. Por exemplo, com base no atlas estereotáxico, você determina que a extensão rostro-caudal completa da sua região tem aproximadamente três milímetros de comprimento.Em seguida, você decide ajustar o criostato para cortar em 50 micrômetros, e, nessa taxa, terá 60 cortes coronais cobrindo toda a região. Nesse momento, você pode estabelecer seu intervalo de amostragem. Para um estudo teológico imparcial típico, são necessários seis a dez cortes amostrados sistematicamente para obter resultados confiáveis.Neste exemplo, 10 seções igualmente espaçadas em toda a extensão do Ros coddle resultam em um intervalo de amostragem de uma em cada seis seções. Uma vez determinada essa frequência de amostragem das seções, você deverá decidir em seguida quais colorações deseja realizar. Imediatamente, você montará as seções que deseja corar imediatamente, diretamente sobre lâminas, enquanto secciona seu tecido.Por exemplo, se você estiver corando com, digamos, violeta de genciana, capturará uma das seis seções em uma lâmina. Esta será a série um. Você armazenará as seções restantes em placas contendo conservante de antígeno para imunohistoquímica futura.O esquema de amostragem mostrado aqui consiste em dois lâminas e uma placa-padrão de 24 poços de seções, como parte de um banco de cérebros, perfazendo um total de seis séries para este bloco de tecido. O próximo passo é seccionar exaustivamente o bloco de tecido utilizando o micrótomo criostato. Primeiro, é necessário montar sua amostra de tecido congelado na peça chamada mandril, que se encaixa na cabeça do micrótomo e serve como estágio para sua amostra.Para começar, coloque uma pequena quantidade de meio de inclusão sobre o suporte e deixe congelar. Coloque o suporte na cabeça do micrótomo e retire uma quantidade suficiente do meio congelado para obter uma superfície plana para a sua amostra. Remova o suporte da cabeça do micrótomo e coloque-o plano dentro do criostato.Despeje o meio de inclusão sobre o suporte e pressione firmemente. Coloque lentamente e completamente o bloco cerebral com a face cortada voltada para baixo sobre o suporte. Inclua o fragmento de cérebro no meio de montagem.Coloque o mandril, agora com o cérebro acoplado, na seção da cabeça do micrótomo utilizando a frequência predeterminada de amostragem de cortes. Após obter um corte, coloque-o diretamente em uma lâmina ou adicione-o a uma série específica na placa contendo o conservante antigênico, tomando muito cuidado para manter os cortes em ordem. Você os secciona de forma sistemática para que posteriormente possa retornar ao banco de cérebros e obter outra amostra sistemática.Depois de seccionar exaustivamente o tecido e colocar os cortes nos poços, cubra a placa com a tampa, envolva a tampa com parafina e coloque no congelador a menos 20 graus Celsius. Registre o número total de cortes em cada série, o intervalo de amostragem dos cortes e o número de séries por animal. Esse registro será essencial para acompanhar os cortes ao retirá-los do banco de cérebros para experimentos futuros.Coletar amostras sistematicamente dessa maneira tem sido uma prática padrão em nosso laboratório. Nos últimos três anos, obtivemos grande sucesso ao realizar imunohistoquímica em material armazenado em conservante de antígeno por três anos, sem deterioração do sinal. Além disso, como parte do nosso banco de cérebros, registramos cerca de 20.000 seções sistemáticas do cérebro de primatas não humanos.Como parte dos nossos planos de pesquisa de longo prazo, acabamos de mostrar como amostrar sistematicamente um espécime biológico e preservá-lo como parte dos seus planos de pesquisa de longo prazo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter um registro detalhado do número total de séries obtidas e do número total de seções por série. Além disso, se uma seção for perdida ou danificada, registre o número dessa seção no livro de registro para manter um procedimento de amostragem sistemática.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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