Detecção de Ubiquitinação Protein
19 de agosto de 2009
Ubiquitinação é uma modificação fundamental posttranslational realizado por um conjunto de três enzimas. Mutações dos genes envolvidos nesta modificação estão associadas com diferentes tipos de doenças humanas. Aqui, descrevemos os protocolos para detectar ubiquitinação de proteínas em células cultivadas In vivo e testar In vitro.
Olá, sou Chu do laboratório de Jo no Instituto de Pesquisa Médica de Birmingham. Hoje vamos mostrar um procedimento para detectar a nova uação proteica. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o parkin ou os ligantes UBI três e seu substrato.
Então vamos começar. Para iniciar este protocolo, transfecte as células com plasmídeos expressando tanto a proteína-alvo quanto uma versão da ubiquitina marcada com um epítopo. Deixe as células crescerem por aproximadamente 40 horas, depois leve-as para a bancada do laboratório; na bancada, aspire o meio líquido e lave as células duas vezes com PBS.
Em seguida, lise as células adicionando 100 microlitros de tampão de lise celular, que contém 2% de SDS por placa de seis centímetros. Agite suavemente cada placa para que o tampão cubra completamente as células. Em seguida, use um espátula celular para coletar as células lisadas e transfira-as para um tubo eppendorf de 1,5 mililitro.
Coloque imediatamente o tubo em um bloco térmico e aqueça as células lisadas por 10 minutos para desnaturar e dissolver ainda mais as proteínas. Após a fervura, utilize um dispositivo de sonicação para fragmentar as células e seu DNA. Este passo torna os lisados celulares menos viscosos.
Após a sonicação, adicione 900 microlitros de tampão de diluição e deixe as amostras em rotação a quatro graus Celsius por 30 a 60 minutos. Após a incubação, centrifugue as amostras diluídas a 20.000 Gs por 30 minutos a quatro graus Celsius para obter as proteínas solúveis. Em seguida, tomando cuidado para não perturbar o precipitado, transfira o sobrenadante para um novo einor.
Por último, meça a concentração de proteína no sobrenadante por um método como o ensaio de Lowry modificado que estamos utilizando aqui. Agora você está pronto para usar uma imunoprecipitação para isolar sua proteína de interesse das demais no sobrenadante. O primeiro passo na imunoprecipitação é preparar as microesferas conjugadas com anticorpos contra a sua proteína de interesse.
Você pode usar esferas conjugadas com anticorpos disponíveis comercialmente ou preparar seu próprio anticorpo imobilizado utilizando ligantes cruzados. Como fizemos aqui, prepare o anticorpo imobilizado em um tampão compatível para obter uma suspensão a 50% para montar a reação de precipitação de aminoácidos. Corte a extremidade fina de uma ponteira de pipeta P200 e transfira de 14 a 20 microlitros de resina para 500 a 1500 microgramas de lisados celulares preparados.
Ajuste a quantidade de lisado celular utilizada de acordo com a eficiência de transfeção das suas células. Deixe a mistura de lisado celular e microesferas girando a quatro graus Celsius durante a noite. Durante esse período, o anticorpo conjugado à microesfera ligar-se-á especificamente à sua proteína alvo.
No dia seguinte, centrifugue as esferas a 5.000 Gs durante cinco minutos a quatro graus Celsius para obter o pellet da sua proteína. Agora ligada às esferas, aspire o sobrenadante e lave a resina duas vezes com o tampão de lavagem de alta salinidade, centrifugando a 5.000 Gs durante cinco minutos. A quatro graus Celsius, centrifugue as esferas pela última vez a 20.000 GS durante 30 segundos e aspire o tampão de lavagem residual.
Agora que você purificou sua proteína de interesse, é hora de realizar a eletroforese em gel de SDS-PAGE. Primeiro, aqueça em banho-maria o resina com duas vezes o volume de tampão de carga SDS para desnaturar as proteínas e conferir-lhes uma carga negativa. Carregue as amostras preparadas em um gel de SDS-PAGE.
Transfira as proteínas do gel para uma membrana utilizando o protocolo do seu laboratório para western blotting. Em seguida, revele o blot com anticorpos contra ubiquitina ou contra a proteína alvo e desenvolva a membrana em filme para visualizar as proteínas ubiquitinadas. Acabamos de mostrar como detectar a ubiquitinação de proteínas em células cultivadas.
Este mesmo experimento pode ser realizado in vitro em um tubo de ensaio. Esta reação tem um volume total de 40 e pode ser realizada em um tubo de PCR. Prepare cada reação da seguinte maneira.
Primeiro, adicione cinco vezes o tampão de UBIQUITINAÇÃO, que contém um TP e o agente redutor DIO três etol, DTT. Em seguida, adicione as enzimas de ubiquitinação E1 e E2. Adicione os substratos, ubiquitina e proteína alvo.
Complete o volume total da reação até 40 microlitros com água como controles. Prepare reações semelhantes na ausência de ubiquitina, E1, E2 ou da proteína alvo. Incube a mistura a 37 graus Celsius por uma hora ou mais.
Interrompa a reação adicionando tampão de amostra para eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS. Ferva a amostra por 10 minutos. Carregue as amostras em um gel de poliacrilamida-SDS e prossiga com a análise por blotting imunológico como feito para o experimento in vivo.
Aqui está um exemplo de resultado deste protocolo. Parkinson. Uma proteína associada à doença de Parkinson é a proteína de interesse neste caso. E a faixa quatro mostra parina ubiquitinada.
As manchas fortes típicas ou escadas são mostradas acima do peso molecular da parina não modificada para comparar várias condições experimentais, os níveis celulares de expressão da proteína-alvo não modificada, parina e ubiquitina, que também devem ser considerados para cada condição. Este é um exemplo de ubiquitinação in vitro de parina: a parina purificada por afinidade foi ensaiada para ubiquitinação in vitro na presença de E1 recombinante, E2 e ubiquitina marcada com biotina; a parina ubiquitinada com biotina foi detectada por estreptavidina HRP. A parina ubiquitinada aparece como escadas acima do peso molecular da parina não modificada; as linhas um, dois e quatro são controles que não contêm ubiquitina, E1, E2 e parina, respectivamente.
Nós acabamos de mostrar como detectar proteínas de nova vacinação em células cultivadas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar o lisado celular em condições altamente tamponadas e de diluir o lisado celular antes de adicionar os anticorpos mobilizados. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.
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Visão Geral
Este artigo discute o processo de detecção da ubiquitinação de proteínas, uma modificação pós-traducional crucial associada a diversas doenças. Os protocolos descritos são aplicáveis tanto em células cultivadas quanto em condições in vitro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Bioquímica
Antecedentes
- A ubiquitinação é realizada por um conjunto de três enzimas.
- Mutações em genes relacionados à ubiquitinação estão associadas a diversas doenças humanas.
- Compreender a ubiquitinação pode fornecer insights sobre os mecanismos das doenças.
- Protocolos para detectar ubiquitinação são essenciais para a pesquisa nesta área.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer métodos confiáveis para detectar a ubiquitinação de proteínas.
- Facilitar a pesquisa sobre o papel da ubiquitinação nas doenças.
- Fornecer uma estrutura para estudar ligases de ubiquitina e seus substratos.
Métodos Utilizados
- Transfecção de células com plasmídeos expressando proteínas-alvo e ubiquitina marcada.
- Crescimento celular por aproximadamente 40 horas antes da lise.
- Lavagem das células com PBS para preparação à análise.
- Utilização de técnicas in vivo e in vitro para detecção.
Resultados Principais
- Detecção bem-sucedida da ubiquitinação de proteínas em células cultivadas.
- Os protocolos demonstraram eficácia tanto em ambientes in vivo quanto in vitro.
- Conhecimentos adquiridos sobre os mecanismos das ligases de ubiquitina.
- Implicações potenciais para a compreensão dos processos de doenças associadas à ubiquitinação.
Conclusões
- Protocolos para detectar ubiquitinação são cruciais para o avanço da pesquisa.
- Compreender a ubiquitinação pode levar a melhores insights sobre várias doenças.
- Estudos futuros podem se basear nestes métodos para explorar novas abordagens terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção robusta da ubiquitinação de proteínas é essencial para elucidar mecanismos regulatórios pós-traducionais que sustentam vias relevantes para doenças em oncologia, neurodegeneração e distúrbios metabólicos. Essa capacidade permite que equipes biofarmacêuticas investiguem a estabilidade, localização e atividade de proteínas-alvo, informando diretamente a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas. A integração da detecção de ubiquitinação em fluxos de trabalho de descoberta precoce aumenta a confiança preditiva e apoia decisões de portfólio ajustadas a riscos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a avaliação direta da especificidade de substrato para ligases de ubiquitina E3 em sistemas relevantes para doenças.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao esclarecer o impacto da ubiquitinação na função da proteína-alvo.
- Facilita a identificação de mutações associadas a doenças que afetam as vias de ubiquitinação.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece protocolos validados para detecção de ubiquitinação em sistemas tanto in vivo quanto in vitro.
- Permite saídas quantitativas por imunoblotagem para análise comparativa entre condições experimentais.
- Apóia a reprodutibilidade e padronização de ensaios para triagem de compostos em etapas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a detecção de ubiquitinação com modelos de doenças relevantes para neurodegeneração e câncer.
- Permite a continuidade dos estudos de mecanismos moleculares à exploração de biomarcadores em estágio pré-clínico.
- Apoia a pesquisa translacional ao vincular modificações pós-traducionais a desfechos fenotípicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A detecção da ubiquitinação de proteínas situa-se no cruzamento entre descoberta inicial, validação de alvo e estudos mecanicistas pré-clínicos, oferecendo uma capacidade analítica reutilizável ao longo do continuum de P&D.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre as consequências funcionais da ubiquitinação em proteínas-alvo.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas por immunoblot para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição de formas ubiquitinadas versus não modificadas da proteína para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados moleculares a modelos relevantes para doenças e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Os protocolos são adaptáveis para outras modificações semelhantes à ubiquitina, ampliando a utilidade da plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Protocolos padronizados aumentam a reprodutibilidade e a escalabilidade entre equipes.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao esclarecer o estado de modificações pós-traducionais dos alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e vias para avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, imunoprecipitação e técnicas de imunoblotting.
- Necessita de acesso a instrumentação para lise celular, centrifugação e análise de western blot.
- Exige padronização entre equipes no preparo de amostras e na seleção de anticorpos.
- Os protocolos são adaptáveis a sistemas modelo in vivo e in vitro.
- A seleção cuidadosa de controles é essencial para interpretar sinais específicos de ubiquitinação.
