Name: Preparação das Culturas cérebro de um rato Aggregate para Neuron Glia e Estudos de Desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a preparar culturas de agregados cerebrais de rato para estudar o desenvolvimento de neurônios e células gliais. Este método permite observar a diferenciação de progenitores multipotentes em tipos celulares maduros do SNC.

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Este estudo foi financiado em parte por fundos start-up da Universidade Texas A &amp; M

Preparação antes da dissecação Instrumentos cirúrgicos: esterilizar todas as tesouras e pinças de dissecção por autoclave Lamela de limpeza: <ol><li> Mergulhe todos lamínulas (15mm de diâmetro por 24 bem-placa) em 1L copo de grama em 33% HCl durante pelo menos 24 h </li><li> Lavar com água corrente durante 10 min com agitação ocasional para remover todos os HCl residual </li><li> Enxágüe com água Millipore </li><li> Drenar a água fora </li><li> Mergulhe lamínulas em etanol 95-98% </li><li> Lamínulas transferência para um tecido limpo em uma placa plana e ar seco as lamelas </li><li> Transferência de lamínulas para um copo de vidro, cubra com papel alumínio e autoclave Nota: Lamelas podem ser armazenados nesta fase </li><li> Lugar lamela individual em placas de cultura. Pronto para revestimento </li></ol> Lamela revestimento: <ol><li> Diluir 100 x estoque de poli-D-lisina (PDL, 10 mg / ml em 0,5% de soro albumina bovina em PBS, armazenado como alíquotas a -20 ° C) com PBS e filtro-esterilize (0,22 mm) </li><li> Lamínulas revestimento com uma solução PDL x (~ 0,15 ml / cm 2) por 2 horas a 37 ° C em uma incubadora </li><li> Remoção da solução PDL e lavar 3 vezes com estéril DDH 2 O e lamínulas secar completamente </li></ol> Nota: Brasão suficiente lamínulas / placas para cada dissecção. PDL revestido lamelas podem ser armazenadas por algumas semanas a 4 ° C. Mídia e soluções Dissecção médio (DM): Use soro fisiológico gelado de Hank salina balanceada (w / o Ca 2 +, Mg 2 +) (HBSS, Invitrogen 14175) suplementado com 10 mM HEPES (Invitrogen 15.630). Agregada meios de cultura: O meio DMEM/NBB27 contém DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM piruvato de sódio, 0,75 mm Glutamax, 60μg/ml N-acetilcisteína, 5 mg / ml insulina, 10nM d-Biotina e 1% de penicilina / estreptomicina. Para fazer 100 ml do meio de cultura agregada, misture 50 ml DMEM (w / o piruvato / glutamina, Invitrogen 11.960), 50 ml de meio de Neurobasal (Invitrogen 211.034), 375 Glutamax mL (100 x, Invitrogen 35.050), 5,5 mg de sódio piruvato (Sigma P2256), 2 ml B27 (17504 Invitrogen), 6,3 mg N-acetilcisteína (Sigma A8199), 1 ml de Sato ações (stock x 100, veja abaixo), 25 mL de d-Biotina estoque (4000 x estoque, 40 M em PBS armazenados como alíquotas a -20 ° C. Sigma B4639), 100 ml de insulina (1000 x estoque, 5 mg / ml em HCl 0.01N armazenados como alíquotas a -20 ° C, Sigma 16.634), e 1 ml de penicilina / estreptomicina (100 x estoque, Invitrogen 15140), filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. Sato 100 x solução estoque: Para fazer 40 ml do estoque: misturar 40 ml Neurobasal com 400 mg apo-transferrina (Sigma T2252), 400 mg BSA (Sigma A9647), 10 ml de progesterona (25 mg de etanol / ml, armazenado como alíquotas a -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescina (Sigma P7505), e 40 mL de selenito de sódio (30 mM em PBS, armazenado como alíquotas a -20 ° C, Sigma S5261). Filtro de esterilizar a solução estoque Sato, e armazenar como alíquotas a -20 ° C. Neurônio médio chapeamento (PM): Médio Neurobasal, 2% B27, 2mM de glutamina (stock 100x, alíquotas armazenadas a -20 ° C, Invitrogen 25030), 25μM de ácido glutâmico (100 ações, alíquotas armazenadas a -20 ° C) e 1% penicilina estreptomicina /. Neurônio meio de cultura (CM): Médio Neurobasal, 2% B27, 2mM de glutamina (stock 100x, alíquotas armazenadas a -20 ° C) e 1% de penicilina / estreptomicina. 5 FDU estoque: estoque 100x, 1mM 5-fluoro-2&#39;-deoxiuridina (Sigma F0503) and1mM uridina (Sigma U3003) em meio Neurobasal. Esterilizado por filtração e armazenado como alíquotas a -20 ° C. Papaína solução digestão (fazer logo antes do dissecção): <ol><li> Dissolver 3,2 mg L-Cisteína (Sigma C-7352) em 4ml DM </li><li> Ajustar o pH a cerca de 7,4 com NaOH 1N (teste em tiras de teste pH) e coloque em banho-maria a 37 ° C Nota: Execute o próximo passo direito, antes da digestão dos tecidos (veja abaixo). </li><li> Adicionar papaína para uma concentração final de 20 unidades / ml </li><li> Filtro de esterilizar (0,22 milímetros), e colocar em banho-maria a 37 ° C </li></ol> Tripsina solução inibidora (fazer logo antes do dissecção): <ol><li> Dissolver 0,2 g inibidor de tripsina (Sigma T7295) no DM 20ml </li><li> Verificar o pH e ajustar o pH a 7,4 com 1 ~ N NaOH </li><li> Filtro de esterilizar e colocar em banho-maria a 37 ° C </li></ol> Dissecação cérebro Configuração: <ul><li> Pinça esterilizada e tesoura </li><li> Etanol 70% </li><li> Lenço de papel limpo e DIAPer almofada no banco </li><li> Placas de Petri com 10 centímetros gelada DM para o útero eo feto no banco </li><li> Plataforma de gelo em microscópio de dissecção </li><li> 2-3 pratos seis centímetros com DM no gelo </li><li> PM quente no banho-maria a 37 ° C </li></ul><ol><li> Euthanize uma grávida de ratos Sprague-Dawley (E16) de acordo com o procedimento aprovado pelo Institutional Animal Care and Us Committee (IACUC) </li><li> Coloque o rato sobre o bloco de fralda e álcool spay na região abdominal </li><li> Use uma pinça para segurar a pele abdominal e um par de tesouras para fazer uma incisão forma de V cortando apenas a pele </li><li> Afastados da pele e usar um outro pinças esterilizadas e tesouras para cortar a camada muscular </li><li> Extrato da cadeia dos sacos embrião e transferi-los para um prato contendo 10 centímetros gelada DM </li><li> Usando uma tesoura de microdissecção, remova cuidadosamente cada embrião a partir do saco eo cérebro de cada embrião, e colocar o cérebro livre em um prato limpo, com 10 centímetros DM em uma plataforma de gelo </li><li> Em uma capa Laminar e sob um microscópio de dissecção, remova mesencéfalo / rombencéfalo seções, e utilize uma pinça fina para remover meninges, e transferir os córtices limpos / hipocampo para um novo prato com seis centímetros DM em um bloco de gelo Nota: nesta fase, o tecido está pronto para a digestão enzimática. </li><li> Faça papaína e tripsina solução inibidora e filtro de esterilizar </li><li> Remover o excesso de córtices DM / hipocampos </li><li> Adicionar 4ml da solução preparada papaína digestão </li><li> Transferência de todo o conteúdo para um tubo de 50ml e colocar o tubo Falcon em banho-maria a 37 ° C por exatamente 5 minutos </li><li> Remoção da solução de papaína com pipeta </li><li> Adicionar solução inibidora de tripsina 5ml, redemoinho do tubo, e coloque em banho-maria a 37 ° C por 2-3 min </li><li> Remover solução inibidora de tripsina </li><li> Repita o passo 13 e 14 três vezes </li><li> Adicionar PM morna 20ml </li><li> Triturar até que todos os grumos desapareceram (~ 20-30 vezes) </li><li> Centrifugar a 100xg para 7min </li><li> Ressuspender o sedimento em 10ml PM e lavar duas vezes por centrifugação </li><li> Ressuspender o sedimento em 10ml PM para as culturas de neurônios regular ou em NBB27/DMEM para culturas agregadas </li><li> Passe as células através de uma peneira 70μm celular </li><li> Contagem de células vivas </li><li> Proceder às culturas agregadas, como descrito abaixo ou a placa de células para as culturas de neurônios regulares Nota: Nesta etapa, as culturas de neurônios altamente enriquecido pode ser alcançado por plaqueamento das células dissociadas em PDL revestimento de placas a densidade de 200-640 células / mm 2, dependendo da finalidade de experimentos. Depois que as células tenham aderido (~ 2-4h), substituir média com PM quente. Se cultivo por longos períodos de tempo, no dia 4, substitua a metade da média com CM quente. Para culturas altamente purificada neuronal, inibidor mitótico 5 FDU (concentração final 10 mM) podem ser adicionados a div2 para inibir a não-proliferação de células neuronais (ie, durante div2-3). Após a recuperação no CM por 2 dias, as células são tratadas de pulso novamente com 5-FDU por mais 2 dias (DIV 6-7) seguido por uma mudança médio completo. Depois, substituir metade do meio com frescos, CM morna a cada 3-4 dias. Neurônios são viáveis ​​por até quatro semanas. </li></ol> Agregados preparação e revestimento <ol><li> Suspender células dissociadas em meio NBB27/DMEM contendo 1x Sato, 10ng/ml CNTF e 10μM forskolin a uma densidade de 2x10 6 células / ml </li><li> Transferência de 2 ml de suspensão de células em cada poço de uma placa não revestidos 6-bem </li><li> Cultura para 3 noites. Cada dia, gentilmente ressuspender as células, uma vez usando um Pipetman P1000 Nota: As células começam a formar agregados (Figura 1). </li><li> No dia antes do plaqueamento agregado, casaco placa / lamínulas com Matrigel: <ul><li> Diluir estoque Matrigel (fator de crescimento reduzido, BD Biosciences 354230) 1:20 com DMEM frio no gelo Nota: alíquotas Matrigel deve ser preparado por protocolo fabricante. Todas as dicas, os tubos de Eppendorf e soluções para a tomada de alíquotas do estoque deve ser frio para evitar a polimerização Matrigel. Alíquotas de Matrigel são mantidos a -80 ° C e descongeladas a 4 ° C. </li><li> Brasão anteriormente PDL revestido com lamínulas 300μl/well da solução diluída Matrigel durante a noite em uma incubadora de 37 ° C </li><li> Lavar com PBS quente, em seguida, lave com água morna estéril placa DDH 2 O e deixar as placas na incubadora. </li></ul></li><li> 3 dias após a formação de agregados, delicadamente ressuspender as células novamente e peneirar a suspensão através de uma malha 200μm em um tubo Falcon de 50ml. Permitir agregados para resolver para o fundo do tubo por gravidade (~ 3-5min) </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante </li><li> Adicionar médio, delicadamente ressuspender os agregados e deixá-los resolver novamente. Repita este procedimento várias vezes para remover as células mortas, as células individuais e detritos. Uso de microscópio para verificar se o sobrenadante ainda conter não agregados células e debris </li><li> Delicadamente ressuspender os agregados no meio NBB27/DMEM mesmos (Figura 1) e contagem de agregados </li><li> Ajustar a densidade de agregados para cerca de 25-30 aggreggats/50ul </li><li> Alíquotas de transferência (500-1000μl) da suspensão total para tubos Eppendorf de 2 ml para revestimento Nota: Como agregados tendem a estabelecer-se no fundo dos tubos, é crucial para fazer tubos múltiplos da suspensão agregado para revestimento. Delicadamente ressuspender os agregados muitas vezes antes da semeadura-los em lamínulas revestidos ou placas de cultura para garantir número similar de agregados banhado em cada lamela. </li><li> Retire a placa de cultura contendo Matrigel revestido lamínulas de incubadora. Remoção da solução de cada bem, lavar as lamelas com PBS quente e 2 DDH O, e, em seguida, uma breve e seco. Eles estão agora prontos para a semeadura agregado </li><li> Inverter um tubo contendo a suspensão total, que lhes permitam ser distribuídos uniformemente antes da semeadura. 50μl de suspensão de carga agregada no centro de cada lamela, e gentilmente colocou a placa de volta à incubadora, sem qualquer perturbação adicional para permitir agregados para anexar uniformemente para a lamela Nota: A densidade dos agregados é crucial. Se agregados são semeadas muito próximos uns dos outros ou se a densidade de semeadura é alta, eles tendem a se fundem à medida que crescem. </li><li> Adicionar DMEM/NBB27medium adicionais (500 mL) a cada 4-6 h bem mais tarde ou cedo na manhã seguinte </li><li> Para manter a cultura agregado, metade mudança do meio a cada 3-4 dias. Quando a mudança médio, ter cuidado para não perturbar os agregados e isso é feito por meio suavemente adicionando ao longo da parede lateral do poço. Nota: Poucas horas depois de agregados ligados à placa, crescimento de neuritos dos agregados pode ser observada. Axônios crescem rapidamente nas primeiras duas semanas e formar conexões abundantes entre os agregados (Figura 2). Progenitores gliais migram radialmente para fora dos agregados e diferenciar ao longo do tempo em astrócitos e oligodendrócitos maduros. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Imagens de contraste de fase de células formando agregados em dias diferentes e agregados após a lavagem. <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Phase imagens de contraste de uma cultura agregada 2 e 12 dias após semeado em Matrigel revestido lamínulas.

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
</ol>

Os primeiros estudos relataram a formação de sinapses e de mielina maduras em rotação mediada livre de culturas agregada flutuante 1. O SNC sistema de cultura agregada descrita aqui combina sem soro crescimento de células progenitoras multipotentes em três agregados dimensional com a conveniência de culturas tradicionais em 2D para facilitar a análise de migração celular, desenvolvimento e diferenciação in vitro. O sistema pode ser modificado e usado para precursoras neurais pesquisas com células e p...

preparação das culturas cérebro de um rato aggregate para neuron glia e estudos de desenvolvimento

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A protocolos para um sistema cerebral de ratos embrionários cultura agregada é descrita. Progenitores multipotentes nos agregados podem se desenvolver e se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.

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Um sistema in vitro que recapitula o desenvolvimento e a diferenciação de progenitores em neurônios e glia maduros no sistema nervoso central (SNC) ...

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Biology

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