Preparação das Culturas cérebro de um rato Aggregate para Neuron Glia e Estudos de Desenvolvimento
30 de setembro de 2009
A protocolos para um sistema cerebral de ratos embrionários cultura agregada é descrita. Progenitores multipotentes nos agregados podem se desenvolver e se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.
Apresentamos um sistema para o cultivo de progenitores neurais do SNC enquanto eles se desenvolvem e se diferenciam em neurônios e glia maduros. O procedimento começa com o isolamento de quatro cérebros de fetos de rato E16 e sua digestão com propano. Os tecidos são dissociados em uma suspensão de células únicas, filtrados, contados e distribuídos em um seis.
As células da placa de cultura são suavemente ressuspendidas uma vez ao dia durante dois a três dias para permitir a formação de agregados. Em seguida, os agregados são coletados e filtrados por uma malha de 200 micrômetros, e os pequenos aglomerados e debris celulares são removidos por lavagem. Por fim, os agregados são contados e semeados em lamínulas revestidas com Matrigel.
Olá, sou Coto do laboratório do Dr. John L do Departamento de Ciências Biomédicas Veterinárias Integradas da Universidade Texas A&M. Hoje vamos mostrar um procedimento para culturas de agregados cerebrais. Utilizamos este procedimento em nosso nível três para estudar linhagem de endócitos, desenvolvimento celular e interações aceleradas.
Então vamos começar. Antes de iniciar, tenha prontos na bancada instrumentos esterilizados, etanol a 70%, uma almofada para apoiar o material e placas de Petri de 10 centímetros para dissecação. Meio de cultura em gelo.
No capuz, prepare um microscópio estereoscópico com uma plataforma de gelo e várias placas de 10 centímetros contendo meio de dissecação, também mantidas em gelo. Por fim, prepare as soluções que irá utilizar e aqueça o meio de plaqueamento a 37 graus em banho-maria. Inicie este protocolo colhendo embriões do dia 16 embrionário (E16) de uma rata Sprague dawley.
Primeiro, eutanazie uma fêmea grávida de acordo com um procedimento aprovado pelo comitê institucional de cuidado e uso de animais. Coloque a rata eutanaziada sobre uma fralda descartável e pulverize o abdômen com álcool para limpá-lo. Em seguida, use pinças para pinçar a pele abdominal e, com a outra mão, use tesoura para cortar apenas a pele, afaste a pele e use outro par de pinças e tesoura esterilizadas para cortar a camada muscular.
Em seguida, remova o útero e transfira-o para uma placa de 10 centímetros contendo meio de dissecação gelado. O próximo passo é realizado na câmara de segurança utilizando tesoura de dissecação microcirúrgica. Remova cuidadosamente cada embrião do útero.
Agora é hora de colher e começar. Trabalhe com os cérebros embrionários. Retire o cérebro de cada embrião e coloque os cérebros isolados em uma placa limpa de 10 centímetros contendo meio de dissecação sobre uma plataforma de gelo. Sob o microscópio estereoscópico, finalize a dissecação dos cérebros.
Remova as seções do mesencéfalo e do rombencéfalo. Use pinças finas para remover as meninges e transfira o que restar do prosencéfalo para um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio de dissecação. Agora, o tecido está pronto para o próximo passo.
Dissociação de células por digestão enzimática. Pouco antes de começar a digestão, prepare soluções frescas de inibidor de tripsina e propano. Esterilize-as e aqueça-as a 37 graus Celsius em banho-maria.
Remova o meio em excesso dos cérebros dissecados. Em seguida, adicione quatro mililitros da solução digestiva de propano preparada ao seu tubo de 50 mililitros. Incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por exatamente cinco minutos.
Quando o tempo terminar, use uma pipeta para remover a solução de propano. Em seguida, adicione cinco mililitros de solução recém-preparada de inibidor de tripsina e coloque o tubo novamente no banho-maria a 37 graus Celsius por mais dois a três minutos. Quando o tempo terminar, remova a solução de inibidor de tripsina.
Repita a incubação com a solução de inibidor de tripsina mais três vezes. Após remover a solução de inibidor de tripsina pela última vez, adicione 20 mililitros. Adicione o meio de placa aquecido pm ao seu tubo.
Agora é a hora de realizar a iteração e lavar suas células. Realize a iteração das células com uma pipeta de 10 mililitros até que todos os agregados tenham desaparecido, aproximadamente 20 a 30 vezes. Em seguida, centrifugue a cem ×g durante sete minutos.
Neste momento, suas células devem estar bem separadas umas das outras. Após sete minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de plaqueamento para lavar as células.
Em seguida, centrifugue novamente. Remova o sobrenadante e repita a lavagem e a centrifugação. Prossiga após a segunda lavagem.
Resuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de cultura para agregados, passe as células através de uma peneira celular de 70 micrômetros. Finalmente, conte as células viáveis utilizando um hemocitômetro.
E agora você está pronto para permitir que as células cerebrais dissociadas formem agregados. Após a contagem, suspenda as células dissociadas em meio de cultura para agregados na densidade de duas vezes 10 elevado à sexta células por mililitro. Transfira dois mililitros da suspensão celular para cada poço de uma placa de seis poços não revestida.
As células são suavemente ressuspendidas três vezes por noite a cada dia. Após o uso de uma pipeta P1000, as células começarão a formar agregados no dia do plaqueamento dos agregados. Depois que as células tiverem crescido por três noites, ressuspenda-as suavemente novamente e filtre a suspensão através de uma malha de 200 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros.
Deixe os agregados sedimentarem no fundo do tubo por aproximadamente três a cinco minutos. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante, adicione meio, ressuspenda suavemente os agregados e deixe-os sedimentar novamente. Repita este procedimento várias vezes.
Para remover células mortas, células individuais e detritos, use o microscópio para verificar se os sobrenadantes ainda contêm células não agregadas e detritos. Após lavar completamente os agregados, ressuspenda-os suavemente no mesmo meio e conte os agregados para determinar sua concentração. Em seguida, ajuste a densidade dos agregados para cerca de 25 a 30 agregados por 50 microlitros.
Agora é a hora de semear lâminas com agregados. Transfira alíquotas de 1000 microlitros da suspensão de agregados para tubos cónicos de dois mililitros, pois os agregados tendem a sedimentar no fundo dos tubos; é crucial preparar múltiplos tubos da suspensão de agregados para o plaqueamento. As lâminas utilizadas nesta etapa são revestidas com o substrato para cultura celular Matrigel mediante uma incubação noturna a 37 graus Celsius.
Depois de ter preparado Alec watts da suspensão agregada, retire a placa de cultura contendo as lamínulas recobertas com matrigel do incubador. Remova a solução de cada uma. Lave as lamínulas com PBS morno e, em seguida, com H2O DD.
Eles estão agora prontos para a semeadura de agregados, a fim de semear a lamínula com agregados. Inverta o tubo da suspensão de agregados para misturar e distribuir uniformemente os agregados. Em seguida, adicione 50 microlitros da suspensão de agregados no centro de cada lamínula.
Coloque suavemente a placa de volta ao incubador sem qualquer perturbação adicional para permitir que os agregados se fixem uniformemente à lamínula. A densidade dos agregados é crucial, pois se os agregados estiverem muito próximos uns dos outros ou se a densidade de adesão for alta, eles tenderão a se fundir à medida que crescem, quatro a seis horas após a adesão inicial. Adicione 500 microlitros de meio de cultura a cada poço.
Para manter a cultura de agregados, troque metade do meio a cada três a quatro dias. Ao trocar o meio, adicione-o ao longo da parede lateral do poço para evitar perturbar os agregados. Algumas horas após os agregados se fixarem na lamínula, pode-se observar a formação de prolongamentos a partir dos agregados.
Os axónios crescem rapidamente nas duas primeiras semanas e formam conexões abundantes entre os agregados. Os progenitores de Ggl migram radialmente para fora dos agregados e diferenciam-se ao longo do tempo em astrócitos e oligodendrócitos maduros. Acabamos de mostrar como cultivar agregados de CS.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ajustar adequadamente a capacidade e distribuir o agregado de forma uniforme. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para o cultivo de agregados cerebrais de embrião de rato. Os progenitores pluripotentes dentro desses agregados podem se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Cultura Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Antecedentes
- Compreender o desenvolvimento do SNC é fundamental para a pesquisa em neurociência.
- Progenitores multpotentes podem gerar diversos tipos celulares no sistema nervoso.
- Culturas em agregado fornecem um modelo para estudar a diferenciação celular.
- Este método permite a observação do comportamento celular em um ambiente controlado.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um sistema de cultura confiável para neuroprogenitores do SNC.
- Facilitar o estudo da diferenciação em neurônios e gliócitos maduros.
- Fornecer um protocolo que possa ser replicado em outros laboratórios.
Métodos Utilizados
- Isolamento de cérebros de fetos de ratos E16.
- Digestão do tecido cerebral para criar uma suspensão de células únicas.
- Filtração e contagem de células antes da formação de agregados.
- Plaqueamento de agregados em lamínulas revestidas com matrigel para análises adicionais.
Resultados Principais
- Formação bem-sucedida de agregados a partir de células progenitoras isoladas.
- Demonstração da diferenciação em neurônios e células gliais.
- Estabelecimento de um protocolo reprodutível para estudos futuros.
- Aplicações potenciais no entendimento do desenvolvimento e distúrbios do SNC.
Conclusões
- O sistema de cultura descrito é eficaz para o estudo de células progenitoras do SNC.
- Os agregados podem servir como modelo para diferenciação neuronal e glial.
- Este método pode aprimorar a pesquisa em neurociência do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo estabelece um modelo in vitro reproduzível de desenvolvimento do SNC que permite a investigação mecanicista das interações neuro-gliais e da progressão da linhagem oligodendroglial. Ao recapitular a diferenciação de progenitores em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos em um sistema livre de soro, ele apoia a validação de alvos e a triagem fenotípica na pesquisa de doenças neurodegenerativas. O sistema fornece uma plataforma escalável para avaliar os efeitos de compostos sobre mielinização e maturação glial, contribuindo para estratégias pré-clínicas de redução de riscos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a validação funcional de alvos no SNC mediante a observação da diferenciação de progenitores multpotentes em fenótipos maduros neuronais e gliais.
- Valor Operacional: Oferece um sistema de cultura livre de soro e relevante para humanos, reduzindo o risco de tradução baseado em espécies em estudos de engajamento de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantificáveis de crescimento axonal, migração glial e formação da bainha de mielina para campanhas de triagem de compostos.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio da densidade definida de agregados (25–30 agregados/50 µL) e trocas programadas de meio a cada 3–4 dias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela as interações axo-glial e a maturação de oligodendrócitos, fornecendo um sistema relevante para a pesquisa de distúrbios desmielinizantes.
- Valor Operacional: Permite o acompanhamento longitudinal da diferenciação celular ao longo de 3 a 4 semanas, apoiando a análise de eficácia e toxicidade dependentes do tempo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, oferecendo uma plataforma com menor risco biológico para avaliação precoce de compostos antes de avançar para modelos pré-clínicos complexos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de sinalização glia-neuronal por meio da diferenciação controlada de progenitores do SNC.
- Triagem: Permite avaliação reprodutível e quantitativa dos efeitos de compostos sobre a integridade de agregados e a expressão de marcadores específicos de linhagem.
- Análises: Gera resultados mensuráveis, incluindo comprimento de axônios, migração radial de células gliais e estágios de maturação de oligodendrócitos, para tomada de decisões baseada em dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao modelar processos de desenvolvimento do SNC e vias relacionadas à mielina relevantes para humanos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e escalonável para produção de agregados, aplicável a múltiplos projetos de neurociência e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva nos mecanismos-alvo ao reduzir a dependência de linhagens celulares superutilizadas e capturar as dinâmicas fisiológicas de diferenciação.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de procedimentos padronizados de dissociação, agregação e semeadura, utilizando densidades celulares definidas e cronogramas de maturação.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao fornecer insights precoces sobre os efeitos do composto em processos críticos do SNC, como mielinização e funções de suporte glial.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base na atividade demonstrada em um sistema de co-cultivo glial-neuronal fisiologicamente relevante.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos embrionários, dissociação enzimática e técnicas de cultura estéril de agregados.
- Depende do acesso a ratas Sprague-Dawley prenhes com tempo controlado, equipamentos de dissecação e incubadoras de CO2 para manutenção da cultura por 3–4 semanas.
- Necessita padronização dos protocolos de lavagem de agregados, densidade de semeadura e troca de meio entre diferentes usuários para garantir consistência fenotípica.
- A adaptação a outras espécies ou estágios de desenvolvimento exigiria reotimização dos tempos de digestão enzimática e das densidades de semeadura.
- Limitado pela ausência de componentes vasculares e imunes, o que pode afetar a modelagem dos aspectos neuroinflamatórios de distúrbios do SNC.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:52
Introduction
0:00
Title
1:27
Preparing for Dissection
2:02
Harvesting the E16 Rat Embryos
3:19
Isolating the Forebrains
4:25
Digesting and Triturating the Forebrain Tissue
6:09
Washing, Filtering, and Counting the Dissociated Cells
7:03
Culturing the Dissociated Cells to Promote Aggregation
7:54
Preparing the Coverslips and Washing the Aggregates
9:15
Seeding the Coverslips with the Aggregates
11:06
Representative Connections Formed Among Aggregates
11:29
Conclusion
