Name: Preparação das Culturas cérebro de um rato Aggregate para Neuron Glia e Estudos de Desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a preparar culturas de agregados cerebrais de rato para estudar o desenvolvimento de neurônios e células gliais. Este método permite observar a diferenciação de progenitores multipotentes em tipos celulares maduros do SNC.

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Este estudo foi financiado em parte por fundos start-up da Universidade Texas A &amp; M

Preparação antes da dissecação Instrumentos cirúrgicos: esterilizar todas as tesouras e pinças de dissecção por autoclave Lamela de limpeza: <ol><li> Mergulhe todos lamínulas (15mm de diâmetro por 24 bem-placa) em 1L copo de grama em 33% HCl durante pelo menos 24 h </li><li> Lavar com água corrente durante 10 min com agitação ocasional para remover todos os HCl residual </li><li> Enxágüe com água Millipore </li><li> Drenar a água fora </li><li> Mergulhe lamínulas em etanol 95-98% </li><li> Lamínulas transferência para um tecido limpo em uma placa plana e ar seco as lamelas </li><li> Transferência de lamínulas para um copo de vidro, cubra com papel alumínio e autoclave Nota: Lamelas podem ser armazenados nesta fase </li><li> Lugar lamela individual em placas de cultura. Pronto para revestimento </li></ol> Lamela revestimento: <ol><li> Diluir 100 x estoque de poli-D-lisina (PDL, 10 mg / ml em 0,5% de soro albumina bovina em PBS, armazenado como alíquotas a -20 ° C) com PBS e filtro-esterilize (0,22 mm) </li><li> Lamínulas revestimento com uma solução PDL x (~ 0,15 ml / cm 2) por 2 horas a 37 ° C em uma incubadora </li><li> Remoção da solução PDL e lavar 3 vezes com estéril DDH 2 O e lamínulas secar completamente </li></ol> Nota: Brasão suficiente lamínulas / placas para cada dissecção. PDL revestido lamelas podem ser armazenadas por algumas semanas a 4 ° C. Mídia e soluções Dissecção médio (DM): Use soro fisiológico gelado de Hank salina balanceada (w / o Ca 2 +, Mg 2 +) (HBSS, Invitrogen 14175) suplementado com 10 mM HEPES (Invitrogen 15.630). Agregada meios de cultura: O meio DMEM/NBB27 contém DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM piruvato de sódio, 0,75 mm Glutamax, 60μg/ml N-acetilcisteína, 5 mg / ml insulina, 10nM d-Biotina e 1% de penicilina / estreptomicina. Para fazer 100 ml do meio de cultura agregada, misture 50 ml DMEM (w / o piruvato / glutamina, Invitrogen 11.960), 50 ml de meio de Neurobasal (Invitrogen 211.034), 375 Glutamax mL (100 x, Invitrogen 35.050), 5,5 mg de sódio piruvato (Sigma P2256), 2 ml B27 (17504 Invitrogen), 6,3 mg N-acetilcisteína (Sigma A8199), 1 ml de Sato ações (stock x 100, veja abaixo), 25 mL de d-Biotina estoque (4000 x estoque, 40 M em PBS armazenados como alíquotas a -20 ° C. Sigma B4639), 100 ml de insulina (1000 x estoque, 5 mg / ml em HCl 0.01N armazenados como alíquotas a -20 ° C, Sigma 16.634), e 1 ml de penicilina / estreptomicina (100 x estoque, Invitrogen 15140), filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C. Sato 100 x solução estoque: Para fazer 40 ml do estoque: misturar 40 ml Neurobasal com 400 mg apo-transferrina (Sigma T2252), 400 mg BSA (Sigma A9647), 10 ml de progesterona (25 mg de etanol / ml, armazenado como alíquotas a -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescina (Sigma P7505), e 40 mL de selenito de sódio (30 mM em PBS, armazenado como alíquotas a -20 ° C, Sigma S5261). Filtro de esterilizar a solução estoque Sato, e armazenar como alíquotas a -20 ° C. Neurônio médio chapeamento (PM): Médio Neurobasal, 2% B27, 2mM de glutamina (stock 100x, alíquotas armazenadas a -20 ° C, Invitrogen 25030), 25μM de ácido glutâmico (100 ações, alíquotas armazenadas a -20 ° C) e 1% penicilina estreptomicina /. Neurônio meio de cultura (CM): Médio Neurobasal, 2% B27, 2mM de glutamina (stock 100x, alíquotas armazenadas a -20 ° C) e 1% de penicilina / estreptomicina. 5 FDU estoque: estoque 100x, 1mM 5-fluoro-2&#39;-deoxiuridina (Sigma F0503) and1mM uridina (Sigma U3003) em meio Neurobasal. Esterilizado por filtração e armazenado como alíquotas a -20 ° C. Papaína solução digestão (fazer logo antes do dissecção): <ol><li> Dissolver 3,2 mg L-Cisteína (Sigma C-7352) em 4ml DM </li><li> Ajustar o pH a cerca de 7,4 com NaOH 1N (teste em tiras de teste pH) e coloque em banho-maria a 37 ° C Nota: Execute o próximo passo direito, antes da digestão dos tecidos (veja abaixo). </li><li> Adicionar papaína para uma concentração final de 20 unidades / ml </li><li> Filtro de esterilizar (0,22 milímetros), e colocar em banho-maria a 37 ° C </li></ol> Tripsina solução inibidora (fazer logo antes do dissecção): <ol><li> Dissolver 0,2 g inibidor de tripsina (Sigma T7295) no DM 20ml </li><li> Verificar o pH e ajustar o pH a 7,4 com 1 ~ N NaOH </li><li> Filtro de esterilizar e colocar em banho-maria a 37 ° C </li></ol> Dissecação cérebro Configuração: <ul><li> Pinça esterilizada e tesoura </li><li> Etanol 70% </li><li> Lenço de papel limpo e DIAPer almofada no banco </li><li> Placas de Petri com 10 centímetros gelada DM para o útero eo feto no banco </li><li> Plataforma de gelo em microscópio de dissecção </li><li> 2-3 pratos seis centímetros com DM no gelo </li><li> PM quente no banho-maria a 37 ° C </li></ul><ol><li> Euthanize uma grávida de ratos Sprague-Dawley (E16) de acordo com o procedimento aprovado pelo Institutional Animal Care and Us Committee (IACUC) </li><li> Coloque o rato sobre o bloco de fralda e álcool spay na região abdominal </li><li> Use uma pinça para segurar a pele abdominal e um par de tesouras para fazer uma incisão forma de V cortando apenas a pele </li><li> Afastados da pele e usar um outro pinças esterilizadas e tesouras para cortar a camada muscular </li><li> Extrato da cadeia dos sacos embrião e transferi-los para um prato contendo 10 centímetros gelada DM </li><li> Usando uma tesoura de microdissecção, remova cuidadosamente cada embrião a partir do saco eo cérebro de cada embrião, e colocar o cérebro livre em um prato limpo, com 10 centímetros DM em uma plataforma de gelo </li><li> Em uma capa Laminar e sob um microscópio de dissecção, remova mesencéfalo / rombencéfalo seções, e utilize uma pinça fina para remover meninges, e transferir os córtices limpos / hipocampo para um novo prato com seis centímetros DM em um bloco de gelo Nota: nesta fase, o tecido está pronto para a digestão enzimática. </li><li> Faça papaína e tripsina solução inibidora e filtro de esterilizar </li><li> Remover o excesso de córtices DM / hipocampos </li><li> Adicionar 4ml da solução preparada papaína digestão </li><li> Transferência de todo o conteúdo para um tubo de 50ml e colocar o tubo Falcon em banho-maria a 37 ° C por exatamente 5 minutos </li><li> Remoção da solução de papaína com pipeta </li><li> Adicionar solução inibidora de tripsina 5ml, redemoinho do tubo, e coloque em banho-maria a 37 ° C por 2-3 min </li><li> Remover solução inibidora de tripsina </li><li> Repita o passo 13 e 14 três vezes </li><li> Adicionar PM morna 20ml </li><li> Triturar até que todos os grumos desapareceram (~ 20-30 vezes) </li><li> Centrifugar a 100xg para 7min </li><li> Ressuspender o sedimento em 10ml PM e lavar duas vezes por centrifugação </li><li> Ressuspender o sedimento em 10ml PM para as culturas de neurônios regular ou em NBB27/DMEM para culturas agregadas </li><li> Passe as células através de uma peneira 70μm celular </li><li> Contagem de células vivas </li><li> Proceder às culturas agregadas, como descrito abaixo ou a placa de células para as culturas de neurônios regulares Nota: Nesta etapa, as culturas de neurônios altamente enriquecido pode ser alcançado por plaqueamento das células dissociadas em PDL revestimento de placas a densidade de 200-640 células / mm 2, dependendo da finalidade de experimentos. Depois que as células tenham aderido (~ 2-4h), substituir média com PM quente. Se cultivo por longos períodos de tempo, no dia 4, substitua a metade da média com CM quente. Para culturas altamente purificada neuronal, inibidor mitótico 5 FDU (concentração final 10 mM) podem ser adicionados a div2 para inibir a não-proliferação de células neuronais (ie, durante div2-3). Após a recuperação no CM por 2 dias, as células são tratadas de pulso novamente com 5-FDU por mais 2 dias (DIV 6-7) seguido por uma mudança médio completo. Depois, substituir metade do meio com frescos, CM morna a cada 3-4 dias. Neurônios são viáveis ​​por até quatro semanas. </li></ol> Agregados preparação e revestimento <ol><li> Suspender células dissociadas em meio NBB27/DMEM contendo 1x Sato, 10ng/ml CNTF e 10μM forskolin a uma densidade de 2x10 6 células / ml </li><li> Transferência de 2 ml de suspensão de células em cada poço de uma placa não revestidos 6-bem </li><li> Cultura para 3 noites. Cada dia, gentilmente ressuspender as células, uma vez usando um Pipetman P1000 Nota: As células começam a formar agregados (Figura 1). </li><li> No dia antes do plaqueamento agregado, casaco placa / lamínulas com Matrigel: <ul><li> Diluir estoque Matrigel (fator de crescimento reduzido, BD Biosciences 354230) 1:20 com DMEM frio no gelo Nota: alíquotas Matrigel deve ser preparado por protocolo fabricante. Todas as dicas, os tubos de Eppendorf e soluções para a tomada de alíquotas do estoque deve ser frio para evitar a polimerização Matrigel. Alíquotas de Matrigel são mantidos a -80 ° C e descongeladas a 4 ° C. </li><li> Brasão anteriormente PDL revestido com lamínulas 300μl/well da solução diluída Matrigel durante a noite em uma incubadora de 37 ° C </li><li> Lavar com PBS quente, em seguida, lave com água morna estéril placa DDH 2 O e deixar as placas na incubadora. </li></ul></li><li> 3 dias após a formação de agregados, delicadamente ressuspender as células novamente e peneirar a suspensão através de uma malha 200μm em um tubo Falcon de 50ml. Permitir agregados para resolver para o fundo do tubo por gravidade (~ 3-5min) </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante </li><li> Adicionar médio, delicadamente ressuspender os agregados e deixá-los resolver novamente. Repita este procedimento várias vezes para remover as células mortas, as células individuais e detritos. Uso de microscópio para verificar se o sobrenadante ainda conter não agregados células e debris </li><li> Delicadamente ressuspender os agregados no meio NBB27/DMEM mesmos (Figura 1) e contagem de agregados </li><li> Ajustar a densidade de agregados para cerca de 25-30 aggreggats/50ul </li><li> Alíquotas de transferência (500-1000μl) da suspensão total para tubos Eppendorf de 2 ml para revestimento Nota: Como agregados tendem a estabelecer-se no fundo dos tubos, é crucial para fazer tubos múltiplos da suspensão agregado para revestimento. Delicadamente ressuspender os agregados muitas vezes antes da semeadura-los em lamínulas revestidos ou placas de cultura para garantir número similar de agregados banhado em cada lamela. </li><li> Retire a placa de cultura contendo Matrigel revestido lamínulas de incubadora. Remoção da solução de cada bem, lavar as lamelas com PBS quente e 2 DDH O, e, em seguida, uma breve e seco. Eles estão agora prontos para a semeadura agregado </li><li> Inverter um tubo contendo a suspensão total, que lhes permitam ser distribuídos uniformemente antes da semeadura. 50μl de suspensão de carga agregada no centro de cada lamela, e gentilmente colocou a placa de volta à incubadora, sem qualquer perturbação adicional para permitir agregados para anexar uniformemente para a lamela Nota: A densidade dos agregados é crucial. Se agregados são semeadas muito próximos uns dos outros ou se a densidade de semeadura é alta, eles tendem a se fundem à medida que crescem. </li><li> Adicionar DMEM/NBB27medium adicionais (500 mL) a cada 4-6 h bem mais tarde ou cedo na manhã seguinte </li><li> Para manter a cultura agregado, metade mudança do meio a cada 3-4 dias. Quando a mudança médio, ter cuidado para não perturbar os agregados e isso é feito por meio suavemente adicionando ao longo da parede lateral do poço. Nota: Poucas horas depois de agregados ligados à placa, crescimento de neuritos dos agregados pode ser observada. Axônios crescem rapidamente nas primeiras duas semanas e formar conexões abundantes entre os agregados (Figura 2). Progenitores gliais migram radialmente para fora dos agregados e diferenciar ao longo do tempo em astrócitos e oligodendrócitos maduros. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Imagens de contraste de fase de células formando agregados em dias diferentes e agregados após a lavagem. <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Phase imagens de contraste de uma cultura agregada 2 e 12 dias após semeado em Matrigel revestido lamínulas.

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
</ol>

Os primeiros estudos relataram a formação de sinapses e de mielina maduras em rotação mediada livre de culturas agregada flutuante 1. O SNC sistema de cultura agregada descrita aqui combina sem soro crescimento de células progenitoras multipotentes em três agregados dimensional com a conveniência de culturas tradicionais em 2D para facilitar a análise de migração celular, desenvolvimento e diferenciação in vitro. O sistema pode ser modificado e usado para precursoras neurais pesquisas com células e p...

preparação das culturas cérebro de um rato aggregate para neuron glia e estudos de desenvolvimento

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Um sistema in vitro que recapitula o desenvolvimento e diferenciação de progenitores em neurônios maduros e células gliais no sistema nervoso central (SNC) proporcionaria uma plataforma poderosa para os neurocientistas para investigar axo-glial interações, propriedades e diferenciação de células progenitoras multipotentes, ea progressão da oligodendroglial células da linhagem no nível celular e molecular. Descrevemos aqui um sistema de cultura CNS agregado de prosencéfalo embrionárias de ratos, que podem ser mantidos em um meio isento de soro até 3-4 semanas e é usado em nosso laboratório como modelo para estudar a interação neurônio glia e mielinização do SNC. Este vídeo vai demonstrar como isolar e cultivar essas culturas CNS agregado de E16 cérebro de rato. Além disso, a partir da dissecção mesmo cérebro, altamente enriquecido regulares dissociada culturas neuronais podem ser facilmente obtidos e utilizados para vários estudos sobre os neurônios do SNC ou utilizados para co-culturas com outras células.

A protocolos para um sistema cerebral de ratos embrionários cultura agregada é descrita. Progenitores multipotentes nos agregados podem se desenvolver e se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos.

Preparação das Culturas cérebro de um rato Aggregate para Neuron Glia e Estudos de Desenvolvimento

Um sistema in vitro que recapitula o desenvolvimento e a diferenciação de progenitores em neurônios e glia maduros no sistema nervoso central (SNC) ...

Apresentamos um sistema para o cultivo de progenitores neurais do SNC enquanto eles se desenvolvem e se diferenciam em neurônios e glia maduros. O procedimento começa com o isolamento de quatro cérebros de fetos de rato E16 e sua digestão com propano. Os tecidos são dissociados em uma suspensão de células únicas, filtrados, contados e distribuídos em um seis.As células da placa de cultura são suavemente ressuspendidas uma vez ao dia durante dois a três dias para permitir a formação de agregados. Em seguida, os agregados são coletados e filtrados por uma malha de 200 micrômetros, e os pequenos aglomerados e debris celulares são removidos por lavagem. Por fim, os agregados são contados e semeados em lamínulas revestidas com Matrigel.Olá, sou Coto do laboratório do Dr. John L do Departamento de Ciências Biomédicas Veterinárias Integradas da Universidade Texas A&M. Hoje vamos mostrar um procedimento para culturas de agregados cerebrais. Utilizamos este procedimento em nosso nível três para estudar linhagem de endócitos, desenvolvimento celular e interações aceleradas.Então vamos começar. Antes de iniciar, tenha prontos na bancada instrumentos esterilizados, etanol a 70%, uma almofada para apoiar o material e placas de Petri de 10 centímetros para dissecação. Meio de cultura em gelo.No capuz, prepare um microscópio estereoscópico com uma plataforma de gelo e várias placas de 10 centímetros contendo meio de dissecação, também mantidas em gelo. Por fim, prepare as soluções que irá utilizar e aqueça o meio de plaqueamento a 37 graus em banho-maria. Inicie este protocolo colhendo embriões do dia 16 embrionário (E16) de uma rata Sprague dawley.Primeiro, eutanazie uma fêmea grávida de acordo com um procedimento aprovado pelo comitê institucional de cuidado e uso de animais. Coloque a rata eutanaziada sobre uma fralda descartável e pulverize o abdômen com álcool para limpá-lo. Em seguida, use pinças para pinçar a pele abdominal e, com a outra mão, use tesoura para cortar apenas a pele, afaste a pele e use outro par de pinças e tesoura esterilizadas para cortar a camada muscular.Em seguida, remova o útero e transfira-o para uma placa de 10 centímetros contendo meio de dissecação gelado. O próximo passo é realizado na câmara de segurança utilizando tesoura de dissecação microcirúrgica. Remova cuidadosamente cada embrião do útero.Agora é hora de colher e começar. Trabalhe com os cérebros embrionários. Retire o cérebro de cada embrião e coloque os cérebros isolados em uma placa limpa de 10 centímetros contendo meio de dissecação sobre uma plataforma de gelo. Sob o microscópio estereoscópico, finalize a dissecação dos cérebros.Remova as seções do mesencéfalo e do rombencéfalo. Use pinças finas para remover as meninges e transfira o que restar do prosencéfalo para um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio de dissecação. Agora, o tecido está pronto para o próximo passo.Dissociação de células por digestão enzimática. Pouco antes de começar a digestão, prepare soluções frescas de inibidor de tripsina e propano. Esterilize-as e aqueça-as a 37 graus Celsius em banho-maria.Remova o meio em excesso dos cérebros dissecados. Em seguida, adicione quatro mililitros da solução digestiva de propano preparada ao seu tubo de 50 mililitros. Incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por exatamente cinco minutos.Quando o tempo terminar, use uma pipeta para remover a solução de propano. Em seguida, adicione cinco mililitros de solução recém-preparada de inibidor de tripsina e coloque o tubo novamente no banho-maria a 37 graus Celsius por mais dois a três minutos. Quando o tempo terminar, remova a solução de inibidor de tripsina.Repita a incubação com a solução de inibidor de tripsina mais três vezes. Após remover a solução de inibidor de tripsina pela última vez, adicione 20 mililitros. Adicione o meio de placa aquecido pm ao seu tubo.Agora é a hora de realizar a iteração e lavar suas células. Realize a iteração das células com uma pipeta de 10 mililitros até que todos os agregados tenham desaparecido, aproximadamente 20 a 30 vezes. Em seguida, centrifugue a cem ×g durante sete minutos.Neste momento, suas células devem estar bem separadas umas das outras. Após sete minutos, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de plaqueamento para lavar as células.Em seguida, centrifugue novamente. Remova o sobrenadante e repita a lavagem e a centrifugação. Prossiga após a segunda lavagem.Resuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de cultura para agregados, passe as células através de uma peneira celular de 70 micrômetros. Finalmente, conte as células viáveis utilizando um hemocitômetro.E agora você está pronto para permitir que as células cerebrais dissociadas formem agregados. Após a contagem, suspenda as células dissociadas em meio de cultura para agregados na densidade de duas vezes 10 elevado à sexta células por mililitro. Transfira dois mililitros da suspensão celular para cada poço de uma placa de seis poços não revestida.As células são suavemente ressuspendidas três vezes por noite a cada dia. Após o uso de uma pipeta P1000, as células começarão a formar agregados no dia do plaqueamento dos agregados. Depois que as células tiverem crescido por três noites, ressuspenda-as suavemente novamente e filtre a suspensão através de uma malha de 200 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros.Deixe os agregados sedimentarem no fundo do tubo por aproximadamente três a cinco minutos. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante, adicione meio, ressuspenda suavemente os agregados e deixe-os sedimentar novamente. Repita este procedimento várias vezes.Para remover células mortas, células individuais e detritos, use o microscópio para verificar se os sobrenadantes ainda contêm células não agregadas e detritos. Após lavar completamente os agregados, ressuspenda-os suavemente no mesmo meio e conte os agregados para determinar sua concentração. Em seguida, ajuste a densidade dos agregados para cerca de 25 a 30 agregados por 50 microlitros.Agora é a hora de semear lâminas com agregados. Transfira alíquotas de 1000 microlitros da suspensão de agregados para tubos cónicos de dois mililitros, pois os agregados tendem a sedimentar no fundo dos tubos; é crucial preparar múltiplos tubos da suspensão de agregados para o plaqueamento. As lâminas utilizadas nesta etapa são revestidas com o substrato para cultura celular Matrigel mediante uma incubação noturna a 37 graus Celsius.Depois de ter preparado Alec watts da suspensão agregada, retire a placa de cultura contendo as lamínulas recobertas com matrigel do incubador. Remova a solução de cada uma. Lave as lamínulas com PBS morno e, em seguida, com H2O DD.Eles estão agora prontos para a semeadura de agregados, a fim de semear a lamínula com agregados. Inverta o tubo da suspensão de agregados para misturar e distribuir uniformemente os agregados. Em seguida, adicione 50 microlitros da suspensão de agregados no centro de cada lamínula.Coloque suavemente a placa de volta ao incubador sem qualquer perturbação adicional para permitir que os agregados se fixem uniformemente à lamínula. A densidade dos agregados é crucial, pois se os agregados estiverem muito próximos uns dos outros ou se a densidade de adesão for alta, eles tenderão a se fundir à medida que crescem, quatro a seis horas após a adesão inicial. Adicione 500 microlitros de meio de cultura a cada poço.Para manter a cultura de agregados, troque metade do meio a cada três a quatro dias. Ao trocar o meio, adicione-o ao longo da parede lateral do poço para evitar perturbar os agregados. Algumas horas após os agregados se fixarem na lamínula, pode-se observar a formação de prolongamentos a partir dos agregados.Os axónios crescem rapidamente nas duas primeiras semanas e formam conexões abundantes entre os agregados. Os progenitores de Ggl migram radialmente para fora dos agregados e diferenciam-se ao longo do tempo em astrócitos e oligodendrócitos maduros. Acabamos de mostrar como cultivar agregados de CS.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ajustar adequadamente a capacidade e distribuir o agregado de forma uniforme. É isso aí.Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Biologia

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Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

Isolar microglia primária a partir da heterogeneidade celular do cérebro é essencial para investigar o seu papel em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo descreve um isolamento mecânico e técnica de cultura mista de células que fornece alto rendimento e elevada pureza, viáveis ​​primárias células microgliais...

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Isolamento e cultivo de células neurais embrionárias de ratos: um protocolo rápido

Este vídeo demonstra uma técnica para estabelecer uma cultura tridimensional de células gliais. As células gliais derivadas do cérebro de rato são encapsuladas em uma matriz polimérica fotoreticulável contendo componentes da matriz extracelular. Ao incubar em um meio de crescimento, as células gliais proliferam dentro da matriz de suporte para criar uma cultura tridimensional.

Estabelecendo uma cultura tridimensional de células gliais derivadas do cérebro de rato

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.

Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Este artigo descreve o protocolo para a cultura de baixa densidade neurónios do hipocampo primárias que crescem em lamelas de vidro invertida sobre uma monocamada de células gliais. As camadas neuronais e gliais são separados por contas de cera de parafina. Os neurónios cultivados por este método são adequados para imagiologia óptica de alta resolução e ensaios funcionais.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

Este artigo descreve o isolamento e a culminação de neurônios simpáticos de ratos embrionários da gânglio cervical superior. Também fornece protocolos detalhados para coloração imunocitoquímica e para preparação de extratos neuronais para análise espectrométrica em massa.

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Aqui, apresentamos uma abordagem simples usando meios de cultura específicos que permitem o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios e astrócitos, ou culturas neuron-glia do córtex embrionário, com alto rendimento e reprodutibilidade.

Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Aprenda a preparar culturas de agregados cerebrais de rato para estudar o desenvolvimento de neurônios e células gliais. Este método permite observar a diferenciação de progenitores multipotentes em tipos celulares maduros do SNC.

Preparação das Culturas cérebro de um rato Aggregate para Neuron Glia e Estudos de Desenvolvimento

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