Name: Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprenda a visualizar exocitose de vesículas sinápticas em células bipolares da retina de peixe-dourado usando microscopia TIRF. Este método permite estudar dinâmicas de liberação de neurotransmissores em tempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant EY 14.990.

Parte 1: Dissecção e isolamento de células Bipolar <ol><li> Preparar soluções listadas na Tabela 2; O pH de toques &quot;(externa) de soluções deve ser ajustado para 7,4 com NaOH e do pH da solução interna deve ser ajustado para 7,2 com CsOH. Proteger a solução interna da luz com papel alumínio e mantenha-o a 4 ° C até o uso; </li><li> Dark-se adaptar um peixinho dourado, pelo menos, 30 minutos antes da dissecção; </li><li> Enquanto o animal se adapta-escuro, preparar 5 mL de hialuronidase (V tipo hialuronidase, 1100 unidades / mL em baixo Ca 2 + Ringer; Sigma, St. Louis, MO) e 10 mL de L-cisteína (0,5 mg / mL em Ca 2 + baixo) da campainha as soluções e pesar os papaína (pó liofilizado, 40 unidades / mL; Sigma, St. Louis, MO) por 5 mL da solução de digestão; </li><li> Euthanize o goldfish por decapitação rápida com uma tesoura cirúrgica e destruir o cérebro ea medula espinhal com uma lâmina de bisturi # 11; </li><li> Remove os olhos, destruindo os músculos extra-oculares com a ajuda de uma pinça # 7 curvas Dumont e cortar o nervo óptico com tesoura de íris; </li><li> Lugar lâmpada um olho em um pedaço de papel de filtro e punção do limbo escleral com a ponta de uma lâmina de bisturi # 11; </li><li> Introduzir a lâmina de uma tesoura Vannas dentro do todo perfurado e cortar todo o segmento anterior de distância; </li><li> Coloque um pequeno pedaço de papel de filtro em cima do copo restante óptica e exercer alguma pressão, a fim de ter o papel de absorver com humor vítreo; </li><li> Levante o papel de filtro com a retina ligado a ele e cortar o nervo óptico com um par de tesouras Vannas; </li><li> Coloque o papel de filtro contendo a retina em um prato de 35 milímetros de plástico cultura com solução de hialuronidase e descolar a retina do papel de filtro com a ajuda de uma pinça # 7 Dumont; </li><li> Cortar a retina em 4-6 pedaços com metade de uma lâmina de aço carbono industrial único gumes e deixe descansar na solução de hialuronidase por 20 minutos; </li><li> Enquanto espera por hialuronidase para entrar em vigor, adicionar 5 mL da solução de L-cisteína ao papaína e deixe descansar até que o líquido se torna transparente (aproximadamente 5-10 minutos); </li><li> Lave os pedaços de retina 3x de baixa Ca 2 + Ringer e deixá-los sentar-se na solução de papaína por 30-35 minutos; </li><li> Lave os pedaços de retina 3x de baixa Ca 2 + Ringer e armazená-los até o uso a 4 ° C em um prato de cultura 35 milímetros de plástico contendo Ca 2 + baixo de Ringer; </li><li> Dissociar as células, coloque um pedaço de retina em um tubo de microcentrífuga contendo 500 mL de baixo Ca 2 + Ringer e lentamente triturar a retina pipetando cima e para baixo com uma dissociação de vidro pipeta, cuidadosamente para não produzir quaisquer bolhas de ar. Pipetas dissociação são fabricados por aquecimento até a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro com um bico de Bunsen e ligeiramente dobrá-la com a ajuda de uma pinça anatômica; </li><li> A placa de células isoladas, adicionando uma gota da suspensão da retina a um home-made câmara de gravação previamente preenchidos com 2 mL de Ca 2 + baixo Ringer. A câmara consiste na metade inferior de uma placa de cultura de 35 mm de plástico com um todo circular no meio e uma lamela de vidro circular de 1,78 do índice de refração (PlanOptik, Alemanha), colado ao fundo com um elastômero de silicone (Sylgard 184; Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Parte 2: Bipolar Carregando Celular e Wash Out TIRF imagens das vesículas sinápticas é melhor realizado através de um microscópio TIRFM objetivo do tipo com um objetivo NA muito alta e uma câmera sensível. Para nossos experimentos, optamos por usar um 1,65 NA objetivo (x100 Apo O HR, NA 1,65, Olympus, Japão) com um EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). O uso do objectivo NA muito elevado exige a utilização de lamínulas de vidro de alta refração e fluido de imersão (di iodometano com enxofre). Nas nossas condições, luz de excitação está limitado a um campo de decaimento exponencial com um comprimento constante de aproximadamente 50 nm. <ol><li> Adicionar uma gota de líquido de alta índice de refração (série M, índice de refração = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) para a objetiva do microscópio; </li><li> Coloque a câmara de gravação cuidadosamente em cima da objetiva do microscópio e cuidadosamente montagem eletrodo terra e tubo de saída para superfusão câmara; </li><li> Deixe câmara de sentar-se no microscópio por 10-20 minutos para permitir que as células a afundar e aderir ao fundo; </li><li> Nesse meio tempo, preparar 5 mL de uma trolox 1mM ® ácido ((±)- 6-hidroxi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxílico; Sigma, St. Louis, MO solução) em alta K + Ringer . Sonicate até à dissolução; </li><li> Prepare 15 mL de solução ADVASEP-7 lavagem: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) em baixo Ca 2 + Ringer. Note-se que ADVASEP-7 uso é opcional e pode ser omitido, se desejar; </li><li> Purgar o li superfusãones e adicione solução ADVASEP-7 de lavar roupa, Ca 2 + baixo toque e controle de campainha para o sistema superfusão; </li><li> Puxar carga pipetas de paredes finas de vidro de borosilicato (Kwik-Fil ® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Resistências Puffer pipeta estão na faixa de 1,5-2,5 mohms; </li><li> Prepare o FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutylamino) styryl) pyridinium dibrometo &quot;, embalagens especiais&quot;; Invitrogen, Carlsbad, CA) soluções. Primeiro, faça um estoque de 1 mm, adicionando 160 mL de água destilada para um frasco (100 mg) de FM1-43 ®. Este estoque pode ser mantido a 4 ° C por até uma semana. Em seguida, adicionar 5 mL de FM1-43 ® a 1 mL de alto K + + Ringer 1mM trolox ®. Proteger a solução da luz com papel alumínio e mantenha-o a 4 ° C até o uso; </li><li> Ligue o microscópio de luz brilhante em campo e procurar células intactas bipolar. Ligeiramente toque no microscópio para se certificar de que os neurônios estão firmemente ligado ao fundo da câmara; </li><li> Posição da caneta superfusão próximo à célula de interesse e de forma contínua perfundir a preparação com baixo Ca 2 + Ringer; </li><li> Desligue as luzes da sala e adicionar um longo vermelho filtro passa (isto é, RG630, Schott, Alemanha) para o caminho óptico para minimizar a excitação do corante FM; </li><li> Preencha uma pipeta de carga com 10 mL da solução corante FM, montar a pipeta na micromanipulador e inferior da pipeta sobre o preparo, sem sobrepressão até que esteja no mesmo plano focal como a célula bipolar você deseja carregar. Certifique-se de ter pelo menos dois titulares eletrodo: o utilizado para o corante FM não pode ser usado para patch clamping, ou então ele pode contaminar a solução intracelular; </li><li> Posição da abertura do soprador a uma distância de cerca de 10 mM do terminal axônio, por sua vez o sistema superfusão off e puff a solução corante por 10 segundos girando a sobrepressão pipeta sobre; </li><li> Vire a sobrepressão fora e, sem mover a pipeta, aguarde 30 segundos; </li><li> Vire o superfusão e tomar banho na câmara em ADVASEP-7 solução por 5 minutos. Nesse meio tempo, retire a pipeta puffer do banho; </li><li> Depois de cinco minutos, mude para baixo Ca 2 + campainha e perfundir a câmara por 25-30 minutos para permitir a remoção de corante em excesso. </li></ol> Parte 3: Patch de fixação e TIRFM Imagem <ol><li> Enquanto a preparação é lavar para fora, puxe pipetas patch da espessura de paredes de vidro de borosilicato (B150-86-10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Resistências remendo pipeta estão na faixa de 80-10 mohms; </li><li> Depois de lavar estiver concluída, coloque o axônio terminal no centro do campo de visão; </li><li> Preencha uma pipeta patch com 7μL de solução interna, toque a pipeta para se livrar de bolhas de ar, revestimento da pipeta com cera dental fundido (cera pegajosa; Kerr Corporation, Orange, CA) e montá-la na micromanipulador; </li><li> Vire a sobrepressão pipeta sobre e inferior a pipeta lentamente sobre a preparação. Verifique a resistência da pipeta no amplificador e deslocamentos pipeta correto e capacitância com os controles do amplificador respectivos; </li><li> Mudar o superfusão para controlar Ringer. Para criar um gigaseal entre a pipeta ea célula, ligeiramente tocar a ponta do eletrodo contra o corpo da célula e ligue a sobrepressão pipeta off, enquanto gentilmente a aplicação de pressão negativa para o eletrodo; </li><li> Enquanto fechado, escolha &quot;toda célula&quot; modo no amplificador e definir a cela potencial de -60 mV; </li><li> Escolha uma região de interesse com o software de imagem que engloba o axônio terminal inteiro, ligar a luz de campo claro off e, por breves instantes, expondo (30 ms) do terminal para o laser nm 488, encontrar o plano certo para TIRF focal de imagem; </li><li> Invadir a célula usando o &quot;zap&quot; comando do amplificador ao aplicar pressão ligeiramente negativa para a pipeta; </li><li> Correto para capacitância da célula e resistência em série, e depois aplicar o protocolo de tensão de interesse, enquanto movimento de imagens de vesículas sinápticas. É nesta fase importante ter o protocolo de tensão sincronizada com a taxa de quadros da câmera. No nosso caso, cada quadro é de 30 ms de comprimento, de modo a variações de tensão ocorrem em múltiplos desse valor (ou seja, a cada 300 ms ou 10 quadros); </li><li> Espere pelo menos 40 segundos entre ensaios para permitir a recuperação; </li><li> Para verificar a posição de fitas sinápticas, tirar fotos ao girar o laser nm em 561. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1: A configuração experimental. Um laser de 488 nm (azul) é voltado para a periferia do plano focal posterior da objetiva e sofre reflexão interna total quando ele atinge o vidro aquoso interface de médio porte. O campo eletromagnético gerado pelo feixe refletido excita o fluoróforo carregado no vesículas sinápticas mais próximo do bottom da câmara de vidro, que então fluorescência (verde). A luz fluorescente é então guiado ao olho do observador (representado) ou a uma câmera CCD. O potencial de membrana das células imaged é controlado simultaneamente por patch-aperto-los. Esta abordagem permite o estudo da relação entre os sinais de entrada (a tensão de membrana) ea saída neuronal (exocitose). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2: Resultados típicos. Esquerda: Imagem de campo claro de uma célula isolada goldfish bipolar. Superior direito: image TIRF das vesículas sinápticas no terminal axonal célula bipolar carregado com FM 1-43 ® e fotografada com o laser de 488 nm (FM corante). Parte inferior direita: imagem do terminal mesmo depois remendar o celular e as imagens do terminal axonal com o laser nm 561. Fitas sinápticas são rotulados pela rodamina baseado em peptídeo de ligação de olho de lombo (Rpep_rhod). Tabela 1: Reagentes e equipamentos específicos. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Fabricante </td><td> Catálogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> - </td><td> Air Tabela </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Microscópio invertido </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> Equipado com uma lâmpada de tungstênio para campo claro e uma porta de abertura lateral para TIRF </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Fonte de energia da lâmpada </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Dichroic Filtro </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Filtro de emissão </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> X100 Apo O HR </td><td> Objetivo </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> NA 1,65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Red Filtro de Vidro </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Laser 488 nm </td><td> Coerente </td><td> - </td><td> Use o mínimo de energia </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Driver de obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Laser 561 nm </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Driver de obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Kit de pressão de perfusão </td><td> Sistema superfusão </td><td> Automatizar Scientific </td><td> 04/09 </td><td> - </td></tr><tr><td> Pen perfusão </td><td> Sistema superfusão </td><td> Automatizar Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ValveLink 8 </td><td> Controlador do Sistema superfusão </td><td> Automatizar Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascade 512B </td><td> EM CCD Camera </td><td> Roper Scientific </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7,1 </td><td> Software de imagem </td><td> Os dispositivos moleculares </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Amplificador de patch clamp </td><td> Heka Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Pulso </td><td> Software amplificador </td><td> Heka Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Micromanipulador </td><td> Instrumento Sutter </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Titular eletrodo </td><td> Heka Elektronik </td><td> - </td><td> Por 1,5 mm de diâmetro externo de vidro, 2 unidades </td></tr><tr><td> Kwik-Fil ® TW150-3 </td><td> Capilar de vidro de borosilicato </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Sem filamento </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Capilar de vidro de borosilicato </td><td> Instrumento Sutter </td><td> - </td><td> Com filamento </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Puller microeletrodo </td><td> Instrumento Sutter </td><td> - </td><td> Equipado com filamento caixa 3x3 e câmara ambiental </td></tr><tr><td> - </td><td> Pressão da bomba de ar de vácuo </td><td> Thomas Scientific </td><td> 7893B05 </td><td> Cria vácuo para remover líquidos de câmara e sobrepressão para pipetas </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Software de análise </td><td> MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> 35 milímetros de plástico Pratos Cultura </td><td> Falcão </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Vidro alto índice de refração </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Índice de refração 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Série M </td><td> Líquido de elevado índice de refração </td><td> Cargille Labs </td><td> - </td><td> Índice de refração = 1,78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Kit de silicone elastômero </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutationa </td><td> Tripeptídeo </td><td> Merck Química </td><td></td><td> Radica livrescavenger l </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> Enzima </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Tipo V </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Aminoácidos </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Ativa papaína </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Enzima </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> De Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Vitamina E solúvel </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Scavenger de radicais livres </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Sulfonado B-Ciclodextrina Derivativos </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Reduz FM 1-43 ® fluorescência de fundo </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Corante fluorescente </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Embalagem Especial&quot; </td></tr><tr><td> Cera pegajosa </td><td> Pipeta agente de revestimento </td><td> Kerr Corporação </td><td> - </td><td> Diminui a capacitância pipeta </td></tr></tbody></table> Tabela 2: soluções fisiológicas utilizadas neste estudo. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Substância </td><td> Ca 2 + baixo Ringer </td><td> Controle de Ringer </td><td> Alto K + Ringer </td><td> Solução interna </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mM </td><td> 120 mM </td><td> 97,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 25 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutationa </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> * CH 3 CSO 3 S </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Rpep-Rhod ** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volume </td><td> 200 mL </td><td> 100 mL </td><td> 5 mL </td><td> 100 L </td></tr></tbody></table> * Metanossulfonato Césio. ** Peptídeo de olho de lombo de ligação: rodamina + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

As vantagens do objectivo do tipo de microscopia TIRF são que 1) ele fornece seccionamento óptico excelente restringindo luz de excitação a uma estreita região dentro do plano focal da objetiva, minimizando assim o fora-de-foco de luz, 2) já que a luz cai exponencialmente com a distância , o movimento em uma direção vertical pode ser monitorado como uma mudança na intensidade de fluorescência, 3) a coleta de luz eficiente através do objectivo de alta abertura numérica 1,5. A principal desvantagem da técnica é que ela está...

exocitose imagem em células da retina com bipolar microscopia tirf

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Refletância interna total de fluorescência microscopia (TIRF) é uma técnica que permite o estudo dos eventos que acontecem na membrana celular, pela imagem seletiva de moléculas fluorescentes que são mais próximos a uma substância de alto índice de refração, como vidro<sup&gt; 1</sup&gt;. Neste artigo, nós aplicamos essa técnica para exocitose imagem de vesículas sinápticas em células da retina bipolar isolado da retina goldfish. Esses neurônios são muito adequados para esse tipo de estudo, devido à sua terminais dos axônios de grande porte. Ao mesmo tempo patch clamping as células bipolares, é possível investigar a relação entre pré-sináptica de tensão e liberação sináptica<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Vesículas sinápticas no interior da célula bipolar terminais são carregados com um corante fluorescente (FM 1-43 ®) por co-puffing o corante e uma solução contendo um toque de alto K<sup&gt; +</sup&gt; Concentração para os terminais sinápticos. Este despolariza as células e estimula a endocitose e conseqüente captação de corante em vesículas glutamatérgica. Depois de lavar o excesso de corante afastado por cerca de 30 minutos, as células estão prontos para ser pinçada e correção representados simultaneamente com um laser nm 488. A solução da pipeta patch contém um peptídeo rodamina-base que se liga seletivamente ao olho de lombo sináptica fita de proteína<sup&gt; 4</sup&gt;, Assim, a rotulagem fitas especificamente quando os terminais são gravadas com um laser nm 561. Isso permite que a localização precisa das zonas de ativos e da separação dos sináptica de extra-sináptica eventos.

Neste vídeo, demonstramos como rotular e visualizar exocitose das vesículas sinápticas única e tráfico de células da retina goldfish bipolar usando reflexão interna total de fluorescência microscopia (TIRF).

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

A microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) é uma técnica que permite o estudo de eventos que ocorrem na membrana celular, por meio da seleção...

Este procedimento começa com a dissecação da retina neural de peixe-dourado adulto, que é o tecido nervoso localizado na parte posterior do olho. As retinas são colocadas em uma solução enzimática por 35 minutos, lavadas e trituradas com uma pipeta de vidro polida a chama para dissociar as células. As células são então semeadas em lamínulas de vidro de alto índice de refração e montadas em placas plásticas de cultura de tecidos.As células bipolares isoladas são identificadas por sua morfologia distinta para carregar os terminais. Aplicamos sobre elas, por 10 segundos, uma solução contendo FM 1-43 e aguardamos 30 segundos antes de lavar o corante. Após uma lavagem de 30 minutos, as células são submetidas ao registro por patch clamp e imagens são obtidas por microscopia TIRF.Olá, meu nome é Christina Jovi do Laboratório ZEC do Departamento de Fisiologia Celular e Molecular da Escola de Medicina da Universidade de Yale. Hoje vamos mostrar um procedimento para estudar a exocitose em células bipolares retinianas vivas utilizando microscopia turf. Utilizamos este procedimento no laboratório para investigar os mecanismos de liberação sináptica.Então vamos começar. Para iniciar, escureça a adaptação de um peixe dourado por pelo menos 30 minutos antes da dissecação. Após a decapitação e remoção do olho, coloque um bulbo ocular sobre um pedaço de papel de filtro e use a ponta de uma lâmina de bisturi número 11 para perfurar o limbo escleral. Dentro do orifício perfurado.Use um par de tesoura bonna para cortar todo o segmento anterior. Em seguida, coloque um pequeno pedaço de papel de filtro sobre a cúpula óptica restante e exerça alguma pressão para fazê-lo absorver o humor vítreo. Levante o papel de filtro com a retina aderida e, usando um par de tesoura VNA, corte o nervo óptico.Coloque o papel filtro contendo a retina em uma placa de cultura plástica de 35 milímetros contendo solução de alta alur e use pinças Dumont número sete para destacar a retina do papel filtro. Em seguida, utilizando metade de uma lâmina industrial de aço carbono com corte simples, corte a retina em quatro a seis pedaços e deixe-os em repouso na solução de hialuronidase por 20 minutos. Enquanto espera a ação da hialuronidase, adicione cinco mililitros de solução de L-cisteína à papaína e deixe em repouso por aproximadamente cinco a 10 minutos, até que o líquido fique transparente. Lave os pedaços de retina três vezes com solução de Ringer com baixo teor de cálcio e deixe-os em repouso na solução de papaína por 30 a 35 minutos.Após 35 minutos de incubação na solução de papaína, lave os fragmentos retinianos três vezes. Transfira os fragmentos para uma placa de cultura plástica de 35 milímetros contendo ringers com baixo teor de cálcio e armazene a placa a 12 a 14 graus Celsius até que esteja pronto para iniciar a dissociação das células.Primeiro, fabrique uma pipeta de dissociação utilizando um bico de Bunsen para aquecer a ponta de uma pipeta de vidro PE ou pipeta e, em seguida, use pinças anatômicas para dobrá-la levemente. Coloque um pedaço de retina em um tubo de microcentrífuga contendo solução de Ringer com baixo teor de cálcio e dissocie lentamente a retina pipetando cuidadosamente para cima e para baixo com a pipeta de dissociação fabricada. Tendo o cuidado de não produzir bolhas de ar, plaque as células isoladas adicionando uma gota da suspensão retiniana a uma câmara de gravação caseira preenchida com solução de Ringer com baixo teor de cálcio.A câmara consiste na metade inferior de uma placa de cultura plástica de 35 milímetros com um orifício circular no centro e uma lamínula circular feita de vidro com índice de refração 1,78 colada na base. Com o dissecção e o isolamento das células bipolares concluídos, estamos prontos para iniciar a carga e a lavagem das células bipolares. Neste experimento, é preferível utilizar um microscópio de fluorescência por reflexão interna total do tipo objetiva, com uma objetiva de alta abertura numérica e uma câmera sensível.Neste vídeo, utilizaremos uma objetiva com abertura numérica de 1,65 e um dispositivo acoplado à carga com multiplicação eletrônica. Para começar, adicione uma gota de líquido com alto índice de refração à objetiva do microscópio. Coloque a câmara de gravação sobre a objetiva do microscópio.Monte cuidadosamente o eletrodo de terra e o tubo de saída da superfusão na câmara. Deixe a câmara sobre o microscópio por 10 a 20 minutos, permitindo que as células sedimentem e adiram ao fundo. Em seguida, purgue as linhas de superfusão e adicione a solução de lavagem.Solução ringer com baixo teor de cálcio e solução ringer controle para o sistema de superfusão. Ligue a luz de campo claro do microscópio e procure por células bipolares intactas. Dê leves batidas no microscópio para garantir que os neurônios estejam firmemente aderidos ao fundo da câmara.Posicione a caneta de superfusão próximo a uma célula intacta e perfunda continuamente o preparo com solução de ringer de baixo teor de cálcio. Agora, desligue as luzes do ambiente e adicione um filtro passa-longo vermelho ao trajeto óptico para minimizar a excitação do corante fluorescente. Encha uma pipeta de carregamento com 10 microlitros de solução de corante fluorescente.Monte-o no micromanipulador e, em seguida, abaixe-o sobre o preparo sem usar a opção de pressão excessiva até que esteja no mesmo plano focal da célula bilar selecionada. Posicione a abertura do puffer a uma distância de cerca de 10 micrômetros do terminal axonal. Desligue o sistema de superfusão e aplique a solução do corante por 10 segundos ativando a pressão excessiva na pipeta.Agora desligue a pressão positiva e, sem mover a pipeta, aguarde 30 segundos. Em seguida, ligue o sistema de superfusão e banhe a câmara com solução de lavagem por cinco minutos. Enquanto isso, remova a pipeta de puffer do banho.Após cinco minutos, mude o sistema de SUPERFUSÃO para a solução ringer com baixo teor de cálcio e perfuse por 25 a 30 minutos, permitindo a remoção do corante em excesso após a carga e lavagem das células bipolares. Estamos prontos para iniciar o registro em configuração de patch e a microscopia T-I-R-F-M. Após a conclusão da lavagem, troque os porta-eletrodos para evitar a contaminação de sua pipeta de patch com o corante.Posicione o terminal axonal no centro do campo de visão. Encha uma pipeta de patch com sete microlitros de solução interna. Bata levemente para eliminar bolhas de ar.Cubra-o com cera dental fundida e, em seguida, fixe-o no micromanipulador. Vire a pipeta, aplique pressão e abaixe lentamente a pipeta sobre o preparo. Verifique a resistência da pipeta e faça as correções necessárias.Em seguida, com o sistema de superfusão ajustado para controlar a solução de Ringer, crie um selo gigôhmico entre a pipeta e a célula tocando levemente a ponta do eletrodo contra o corpo celular. Com a pressão sobre a pipeta desativada, aplique suavemente pressão negativa ao eletrodo enquanto estiver selado. Selecione o modo de célula inteira no amplificador e ajuste o potencial de retenção da célula para menos 60 milivolts.Agora, utilize um software de imagem para selecionar uma região de interesse que englobe todo o terminal axonal. Desligue a luz de campo claro e exponha brevemente o terminal ao laser de 488 nanômetros. Encontre o plano focal adequado para a imagem TIRF.A seguir, rompa a membrana celular utilizando o comando "zap" do amplificador enquanto aplica uma pressão ligeiramente negativa à pipeta, corrigindo a capacitância celular e a resistência em série. Em seguida, aplique o protocolo de voltagem enquanto imagina o movimento das vesículas sinápticas. Aguarde pelo menos 40 segundos entre os ensaios para permitir a recuperação.Primeiro, escolhemos uma célula bipolar em microscopia de campo claro. Em seguida, aumentamos o zoom e carregamos seu terminal axonal com o corante fluorescente. Após uma lavagem de 30 minutos, o terminal carregado pode ser observado em microscopia com contraste de interferência diferencial, juntamente com o movimento de vesículas glutamatérgicas fluorescentes.Aqui introduzimos um peptídeo ligante do olho de rib pela pipeta de registro, o que nos permite visualizar a posição das fitas sinápticas quando observadas com um laser de 561 nanômetros. Em seguida, despolarizamos as células e registramos o movimento das vesículas com o laser de 488 nanômetros. Acabamos de mostrar como dissociar placas e carregar células bipolares da retina com um corante fluorescente, além de realizar o registro, o clampagem desses neurônios e imagens simultâneas por microscopia TURF.Ao realizar este procedimento, é importante não expor as células excessivamente ao laser. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

imaging-exocytosis-in-retinal-bipolar-cells-with-tirf-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de agar-embedded fatias da retina que são adequados para eletrofisiologia e Ca2 + imagem. Este método permite que um estudo de fita do tipo sinapses em microcircuitos da retina usando direto de patch-clamp gravações de um único terminais nervosos pré-sinápticos.

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Fonte: Daniele, F., et. al TIRFM e sondas GFP sensíveis ao pH para avaliar a dinâmica da vesícula do neurotransmissor em células de neuroblastoma SH-SY5Y: imagem celular e análise de dados. J. Vis. Exp. (2015). Este vídeo demonstra a imagem de células de neuroblastoma humano usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas com fluoróforo. As células são focadas primeiro no modo de epifluorescência. Os ajustes são então feitos...

Imagem celular usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizando metodologias combinadas para definir o papel da entrega da membrana plasmática durante a ramificação do axônio e a morfogênese neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar eventos exocíticos em neurônios corticais. Um marcador de proteína fluorescente verde (GFP) sensível ao pH fluoresce após a fusão da vesícula, com excitação seletiva de TIRF capturando exocitose...

Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total para Visualização de Eventos Exocíticos 

Baseado na polarização Reflexo Interna Total de microscopia de fluorescência (pTIRFM) permite a detecção em tempo real, a dinâmica da membrana da célula. Este artigo descreve a implementação de pTIRFM para o estudo da remodelação da membrana durante a exocitose regulada. A técnica é generalizável a outros processos em biologia celular que direta ou indiretamente envolvem mudanças na forma de membrana.

Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

endocitose mediada por clatrina, um processo rápido e altamente dinâmico internaliza muitas proteínas, incluindo receptores de sinalização. O protocolo descrito aqui visualiza diretamente a cinética de eventos endocíticos individuais. Isso é essencial para entender como os membros centrais da maquinaria endocítica se coordenam entre si e como a carga de proteínas influencia esse processo.

Visualizando Endocitose clatrina mediada por receptores acoplados à proteína a resolução de evento único através de microscopia TIRF

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Aqui detalhamos um método para a imagem latente de célula viva de exocitose regulada. Este método utiliza FITC-dextrano, que acumula em organelas lisossoma-relacionados, como repórter. Este método simples também permite distinguir entre diferentes modos de exocitose regulada em células que são difíceis de manipular geneticamente.

Imagem latente FITC-dextrano como repórter por exocitose regulada

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Este trabalho apresenta uma preparação alternativa de retina flatmount na qual a remoção de corpos celulares fotorreceptores permite uma difusão mais rápida de anticorpos e um melhor acesso da pipeta de remendo aos neurônios internos da retina para experimentos de imunohistoquímica, hibridização in situ e eletrofisiologia.

Split Retina como uma Preparação Flatmount Melhorada para o Estudo de Neurônios da Camada Nuclear Interna na Retina de Vertebrados

Este artigo demonstra um método para visualizar e quantificar a motilidade e o contato da microglia com pontos pós-sinápticos na retina usando microscopia confocal de disco giratório.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia e interações com sinapses na retina murina doente

Aprenda a visualizar exocitose de vesículas sinápticas em células bipolares da retina de peixe-dourado usando microscopia TIRF. Este método permite estudar dinâmicas de liberação de neurotransmissores em tempo real.

Exocitose imagem em células da retina com Bipolar Microscopia TIRF

Explorar mais vídeos