Name: Imagens de células vivas de F-actina Dynamics via Microscopia fluorescente Speckle (FSM) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: Aprenda microscopia de speckle fluorescente para estudar dinâmica de F-actina em células vivas usando microinjeção. Este método permite medições quantitativas de cinética de turnover de proteínas citoesqueléticas em tempo real.

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O desenvolvimento de qFSM é financiado pelo NIH a concessão U01 GM06230.

Seção 1: Obtenção do seu actina fluorescente etiquetado para FSM Materiais necessários: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga <ol><li> Um componente chave para a aquisição de filmes FSM boa exige a rotulagem adequada de actina (ou outras proteínas do citoesqueleto) com o fluoróforo de sua escolha. Recomendamos o uso de fluoróforos Alexa (488, 568 comprimentos de onda) e X-rodamina derivados de éster succinimidyl que a meta exposta resíduos de lisina sobre a superfície da actina. </li><li> Ao escolher o seu fluoróforo e seu comprimento de onda adequado, assegurar que sua configuração de microscópio tem os filtros adequados (excitação e emissão) e iluminadores (de vapor de mercúrio da lâmpada e / ou lasers) para acomodar sua etiqueta fluorescente. Recomendamos selecionar comprimentos de onda na laranja para comprimentos de onda vermelho (560-630 nm) para minimizar os efeitos da auto-fluorescência e foto danos e garantir a sua compatibilidade com GFP-conjugados. </li><li> Actina pura pode ser extraído de tecido muscular pertencente a Rat ou frango, mas requer um longo procedimento de extração do pó de acetona muscular. Pó de acetona muscular pode ser comprado de Invitrogen. O procedimento de rotulagem não é discutido neste protocolo, mas pode ser encontrada aqui [1] </li><li> Alternativamente, você pode comprar as proteínas actina marcada por vários fabricantes, incluindo Citoesqueleto Inc., e Invitrogen. Serviços de rotulagem personalizadas também estão disponíveis através Invitrogen. Purificada, não-rotulados de actina (actina músculo e nonmuscle) pode ser comprado de Citoesqueleto Inc. </li><li> Se você decidir comprar ou preparar o seu próprio rótulo de actina, que pretende assegurar que o rácio de rotulagem é algo em torno de 0,3-0,7 por corantes monômero de actina. Muito alto índice de rotulagem podem afetar a cinética de volume de negócios (e ligação às proteínas associadas) do filamento de actina, enquanto uma proporção muito baixa rotulagem vai levar a manchas pobres procurando (baixo sinal de ruído) e pode causar problemas microinjeção (veja abaixo). Este é um fator crítico para conseguir boas imagens speckle. </li><li> Antes do armazenamento a longo prazo, a solução de actina rotulados devem ser esclarecidas por girando a 75.000 - 80.000 xg por 20 minutos a 4 graus Celsius. Actina rotulado deve ser armazenado em G-buffer solução e mantidos -80 graus Celsius. Preparando-se alíquotas de 2 uL é altamente recomendado para reduzir os efeitos prejudiciais de congelamentos e descongelamentos repetidos (leva a agregados insolúveis). Abster-se de expor a solução actina marcados à luz direta (será fotobranqueamento de fluoróforos). Recomendamos a utilização de tubos de microcentrífuga opaco para armazenamento a longo prazo. </li></ol> Seção 2: Preparação de Células e microinjeção de actina rotulados Materiais necessários: agulhas microinjeção, micro, microloaders, a mídia celular pré-aquecida, buffer de injeção, balde de gelo, microscópio (anel fase, o objetivo de contraste de fase 40X, transjector, agulha extrator, micromanipulador) <ol><li> Muitos tipos de células são passíveis de FSM, mas ficando bom speckle imagens é diretamente dependente do sucesso do procedimento microinjeção. Ao selecionar células para FSM, as células devem ser grandes (&gt; 50 um de diâmetro), deve se espalhar quando banhado, e ser naturalmente aderente sobre substratos (ou placas de cultura de tecido de plástico). Também ajuda se citosol da célula ocupa uma área maior do que o seu núcleo. Os critérios acima referidos assegurar que as células são passíveis de microinjeção. Linhagens de células bem sucedidos candidatos incluem (mas não limitado a) PtK1 [2,3], as células do pulmão newt [4], neurônios e Aplysia [3]. </li><li> As células devem ser semeadas em lamínulas quadrados (22 x 22 mm;. 1-1/2 não) que tenham sido lavada com ácido. Revestimento de substrato padrão pode ser aplicado para as lamelas e não afetará microinjeção. </li><li> A correta seleção de agulhas microinjeção é dependente do tamanho da abertura da ponta. Normalmente, o tamanho buraco pode muito em tamanho de 0,5 UM para tão grande como 3 um. No entanto, recomendamos que a injeção de actina requer um tamanho de abertura ideal entre 0,5-1 um. Se os problemas de entupimento são encontradas de forma consistente, tamanhos maiores podem acomodar buraco para a entrega de monomérica, bem como indesejados filamentos de actina polimerizada. Microinjeção agulhas podem ser adquiridos através de vários fornecedores, incluindo sistemas de Eppendorf que fazem agulhas microinjeção femtotip. Alternativamente, se um extrator de agulhas comercial está disponível, tubos de vidro pode microinjeção comprado de Sutter, e puxou a especificação. Para os iniciantes, é recomendável ter puxado 20/10 agulhas na mão antes de iniciar o procedimento de injeção. </li><li> &quot;Concentração de injecção&quot; ideal (concentração final de actina carregado em sua agulha) de actina é entre 0,5-1,0 ug / ul baseado em uma relação de rotulagem de 40% de corante para monômero de actina. Uma baixa relação de rotulagem de seu actina pode ser compensada pela injeção em concentrações mais elevadas (1-3 ug / ul). No entanto, a freqüência do seu entupimento da agulhaser aumentado. Isto pode ser parcialmente aliviado pelo uso de agulhas com aberturas maiores. Concentração de ações de actina pode ser diluído adicionando gelada buffer de injeção. Gelada ddH2O também pode ser usado para diluir para injectáveis ​​rápido. Neste ponto todas as soluções de trabalho devem ser mantidos em gelo. </li><li> Carga 0,5-1,0 uL da solução de actina, utilizando uma micro (de bitola estreita - Hamilton), ou, alternativamente, usando um microloader ponta da pipeta. </li><li> Cuidadosamente dispensar a solução de actina, liberando suavemente a solução. Bolhas devem ser evitadas, mas podem ser facilmente removidas, tomando-se o excesso de líquido ao redor da bolha. </li><li> Garantir que a solução de actina está descansando completamente na ponta da agulha. Excesso de solução em qualquer lugar ao longo do capilar da agulha pode interromper o fluxo de injeção. </li><li> Agora, coloque a agulha com cuidado, evitando contato com a ponta da agulha, ao titular do injetor. Posição do suporte, de modo que a agulha faz um ângulo de 35-50 para a base do palco microscópio. Ângulos inferiores são preferidas. </li><li> Abaixe a ponta da agulha até que mal rompe a superfície da mídia banhos suas células. </li><li> Agora posicione a ponta da agulha (sem baixar) para que ela repousa diretamente acima do centro do objetivo. Se a ponta da agulha está alinhada com o objetivo, você deve ver um halo luminoso através da ocular. Este é o fim da ponta da agulha. Se movendo lentamente para o lado da agulha para o lado (usando o manipulador) pode ajudar a localizar o melhor halo. </li><li> Ajustar o foco z-on do microscópio até as suas células estão em visão clara. Agora, abaixe lentamente a ponta até o halo constricts gradualmente até que finalmente convergindo para a ponta da agulha - você terá que controlar o foco (z-posição) simultaneamente. Uma característica adicional é a olhar para o eixo da agulha, que vai lançar sombras linear. Abaixando a agulha irá gradualmente define o eixo da agulha. Quando feito corretamente a ponta da agulha e suas células devem ser ambos na visão clara. Ligeiro ajuste do anel de fase pode ser necessária para melhorar o contraste. </li><li> Quando estiver navegando, certifique-se da ponta da agulha está bem acima de suas células para impedir a quebra da ponta da agulha. </li><li> Ao selecionar células para injetar, as células com bordas livres deve estar voltado para a ponta da agulha. Isso irá garantir inclinação declínio da célula (do ponto mais espesso, onde reside o núcleo, para o ponto mais fino da borda) se reunirá na ponta da agulha, ao invés de correr paralela a ele. </li><li> A pressão da agulha deve ser fixada em 0,3-0,8 psi. A constante pressão aplicada resultará em um fluxo constante de solução de actina. </li><li> Depois de decidir sobre uma célula para injetar, a posição de sua agulha para a ponta fica ao lado do núcleo (região perinuclear, parte mais grossa da célula onde o núcleo não está diretamente abaixo). </li><li> Abaixe lentamente, e reajustar a posição da agulha até que a ponta é deprimente a membrana, agora um pouco mais baixa até a ponta da agulha perfurou a membrana. Se a agulha estiver completamente perfurado a membrana, a célula irá aparecer mais brilhante, assim como você vê essa diferença levantar a agulha até que não é mais tocar no celular. O piercing reais e processo de injeção terá 0,5-2 segundos. </li><li> Quando feito corretamente, a forma da célula aparecerá inalterado, ao passo que injeções muito vai resultar em retração rápida da borda da célula e, em alguns casos, você vai realmente ver o celular explodir. </li><li> Se você não vê mudanças na célula quando microinjecting (não fica mais brilhante), a ponta da agulha pode ser fechado. Você pode testar isso pressionando o botão &#39;clean&#39; se disponível no seu transjector. Se abrir, isso irá aumentar significativamente o fluxo constante pressão que pode ser visto através da ocular - ele irá aparecer como ondulações e detritos nas proximidades pode ser visto dispersar. </li><li> Se a ponta da agulha está fechado, você pode optar por inserir uma agulha microinjeção novo ou tentar quebrar a ponta da agulha delicadamente abaixar a agulha até que a ponta da agulha pressiona contra a lamela de vidro, causando assim o fim da ponta para quebrar. A área de quebra não deve ser mais do que um dia 05/01 da área da ponta da agulha (a parte da agulha que começa a convergir para um ponto). </li><li> Continue com a injeção, não gastar mais de 20-45 minutos para cada sessão de microinjeção (vai depender do tipo de célula). Como regra geral, as sessões mais curtas são recomendadas para minimizar o estresse nas células. </li><li> Depois de terminar a microinjeção, alterar a mídia celular no prato, adicionando novas mídias pré-aquecido. Em seguida, permitem que as células para recuperar por 30 minutos em uma incubadora antes de imagem. Isso também irá permitir a actina para se integrar na rede de citoesqueleto existente. </li></ol> Seção 3: Montagem da Câmara de imagem Materiais necessários: lamela, fita dupla face, q-dicas, fórceps, valap, kim wipe, oxyrase, mídia de imagem, lâmina de barbear, p200 piPette, etanol puro <ol><li> Comece por pré-aquecimento a mídia de imagens e descongelamento de uma alíquota de 15 uL de Oxyrase. Certifique-se de proteger o oxyrase fotossensíveis da luz. A adição de oxyrase vai reduzir muito os efeitos da fotodegradação. </li><li> Pré-aquecer o valap, definindo a temperatura da placa quente para baixo. Não sobreaquecer / queimar o valap para ela perderá sua eficácia como um selante. </li><li> Limpe uma lamela com uma kimwipe encharcados com etanol puro para limpar e remover detritos de pequeno porte. </li><li> Empilhar duas iguais comprimentos de tamanho (2,5 cm de comprimento) de fita dupla face em cima uns dos outros, usando uma superfície limpa e plana como uma plataforma. Pressione para fora todas as bolhas de ar aprisionadas para criar um avião completamente plana. </li><li> Usando uma lâmina de barbear, cortar duas tiras retas ao longo do eixo, de modo que cada tira medidas 0,5 cm de largura. </li><li> Utilizando uma pinça, coloque cada tira contra a borda longa de sua lamela para que as duas tiras de fita cria uma lacuna no centro de sua lamela. Pressione suavemente a fita para fazer um selo agradável com o vidro. As tiras de fita irá atuar como espaçadores entre a lamínula ea lamela. </li><li> Verifique se o valap completamente liquefeito antes de começar o próximo passo. </li><li> Recuperar sua mídia de imagens pré-aquecida, adicionar 15 ul de oxyrase a cada 500 uL de mídia. </li><li> Kimwipes vezes em triângulos para criar três arestas duras. Isso será usado para criar uma superfície seca para a fita de pau-a. </li><li> Recuperar as células da incubadora. Utilizando uma pinça, pegue um canto da lamela. Rapidamente colocar a lamela numa kimwipe (lado da pilha é virada para cima, sem tocar no tecido), e usar o kimwipe dobrado para limpar dois lados opostos da lamela para criar uma superfície semi-seca (na superfície onde seu descanso células). </li><li> Utilizando uma pinça, pegue um canto a lamela e colocá-lo em seu lamínula de forma que as superfícies secas são alinhados com as duas tiras de fita. Observe agora você tem dois lados fechados e duas fendas abertas. Lentamente pipeta 200 uL de sua solução de imagem-media-oxyrase perto de uma abertura. Importante, sem bolhas de ar deve ser introduzido. A solução deve ser sugado para dentro da câmara recém-montado por forças capilares, mergulhando assim por completo as suas células em solução. </li><li> Usando um dab Q-Tip os quatro cantos da sua lamela com valap derreteu rapidamente apor e estabilizar as lamelas. Você notará que a seca valap instantaneamente (dentro de segundos à temperatura ambiente). </li><li> Começando agora com as laterais abertas (fita não-lateral), coloque uma tira fina de valap usando um Q-Tip e imitando um derrame escovação. Repita o procedimento para as laterais fechadas. Lentamente construir o brasão de valap, reforçando assim o selo repetindo as etapas de revestimento. O valap deve ser confinada às bordas, deixando o centro da lamela claro. </li><li> Limpar delicadamente a parte central da lamela usando um Q-ponta com ddH2O de remover qualquer mídia residual, estar atento para não esmagar as células. Repita o passo de limpeza com etanol puro. </li><li> Você agora terá uma câmara de imagem completamente fechado otimizado para speckle imagem. Ter um gabinete totalmente fechado irá impedir o seu fluoróforos de forma rápida fotodegradação. </li></ol> Seção 4: células de imagem Materiais necessários: microscópio invertido campo amplo, lâmpada Mecury, filtros apropriados, resfriado CCD da câmera com 6,7 micron pixels, abertura numérica de alta, o óleo de imersão plano Apocromático objectivos (60X a 100X fase ou DIC). Mesa de vibração. Software de imagem. <ol><li> Pré-aquecer o palco microscópio para 37 graus. Coloque a sua câmara de imagem recém-concluído, e esperar 10-15 minutos para a temperatura se estabilize antes de imagem. </li><li> Comece por focar suas células no campo-Bright, e depois encontrar o seu células injetadas, alternando as configurações corretas de fluorescência. Tentar minimizar o tempo de exposição de fluorescência para reduzir a fotodegradação. </li><li> Procure por células injetadas que têm curvas saudáveis ​​bordos de ataque. Over-injetaram células (células explodiu) será caracterizado por bordas irregulares e retraído, assemelhando-se filopodia numerosos - evitar imagens dessas células. </li><li> Configurações aquisição vai depender do tipo de célula, a qualidade da actina rotulados, e os componentes do microscópio. No entanto, as configurações de exposição não deve ser superior a 2 segundos, e intervalo de tempo entre os quadros devem ser fixados entre 5 e 10 segundos. Comprimentos típico para uma série de tempo (por célula imaged) pode variar entre 10 a 30 minutos, e está limitada por efeitos de fotodegradação. Ajustes de ganho na câmera pode ser girado para cima para aumentar o sinal ao ruído. </li><li> Ideal speckle características deve ter cada speckle espaçadas por ~ 2 speckle diâmetros para a vizinha próxima speckle. Isto garante amostragem espacial e temporal ideal da estrutura de actina. Para células epiteliais, a rede de actina salpicado aparecerá homogênea, com manchas uniformemente separados. Linhagens de células que apresentam fibras de stress densa ou lamellipodiaserão distinguíveis, mas terá uma aparência pontilhada / salpicada. As configurações de exposição deve ser ajustado para obter as melhores imagens salpicada. </li><li> Over-microinjeção células terão manchas densamente que não parecem ser discretos. Fibras de stress e as lamellipodia perderá sua aparência pontilhada. </li><li> Sub-microinjeção células aparecerá muito fraca através da ocular, contendo manchas que estão distantes (&gt; 10 manchas de intervalo) e aparecendo aleatoriamente dispersos. Fibras de stress e as lamellipodia nessas células serão indistinguíveis. </li><li> Chave para a obtenção de &quot;bom&quot; speckle filmes é manter o foco. Isto é particularmente importante para o pós-análise envolvendo speckle fluxo e medições de volume de negócios. Assim, a qualidade da análise quantitativa dependerá de bloqueio no foco para a duração do lapso de tempo. Isto pode ser particularmente difícil se o plano de imagem é bastante fino. Outros fatores dependerá da estabilidade do sistema microscópio, particularmente a carcaça de palco e da câmara de imagem. Baseado em contraste com foco pode ser usado se comprimentos intervalo de imagem são suficientes para acomodar esse recurso. Outras opções incluem a compra de um infravermelho próximo sistema baseado focando confiável que fornece ajustes em tempo real foco. Você pode encontrar essas ofertas da Nikon, Olympus e ASI. </li></ol> Seção 5: Análise qFSM Esta seção não é discutido em detalhe, mas a informação sobre o software de análise pode ser encontrada aqui [5]. Pedidos de download do software podem ser feitas em nosso site (lccb.scripps.edu). Tópicos abordados: <ul><li> Calibração do ruído </li><li> Speckle detecção </li><li> Rastreamento usando uma abordagem híbrida de monitoramento de imagem de correlação baseado do movimento grosseiros das áreas speckle e rastreamento única partícula do movimento detalhado de manchas individuais. </li><li> Computação da assembléia de polímero e as taxas de desmontagem das flutuações de intensidade durante speckle aparência e eventos desaparecimento. </li></ul>

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Vários fatores importantes são cruciais para o êxito da obtenção de imagens speckle, manchas no entanto bom começar e terminar com a qualidade do seu actina fluorescente etiquetado. A relação de rotulagem elevado de tintura para actina monômero, situado em torno de 0,4-,7 irá garantir que os salpicos aparecerá brilhante e discreta, enquanto a proteína em si deve ser rotulado solúvel e livre de agregados. Igualmente importante é o procedimento de microinjeção. Para garantir a homeostase celular normal (e sobrevivência), ...

Injeção de buffer (IB) 50 mM glutamato de potássio 0,5 M MgCl2 (ANEXO 2A) Armazenar até 2 anos a -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (Apêndice 2A) 0,2 mM CaCl2 (ANEXO 2A) Adicionar imediatamente antes da utilização: 0,2 mM ATP (ver receita para 100 mM) 0,5 mM 2-mercaptoetanol Armazenar até 1 dia a 4 ° C

imagens de células vivas de f-actina dynamics via microscopia fluorescente speckle (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Neste protocolo, descrevemos o uso de Microscopia fluorescente Speckle (FSM) para capturar imagens de alta resolução de actina na dinâmica PtK1 células. A única vantagem do FSM é sua capacidade de captar o movimento e cinética volume de negócios (montagem / desmontagem) da rede de F-actina dentro de células vivas. Esta técnica é particularmente útil em derivar medidas quantitativas de F-actina dinâmica quando emparelhado com o computador de software de visão (qFSM). Descrevemos a seleção microinjeção, e visualização de sondas fluorescentes de actina em células vivas. Importante, procedimentos semelhantes são aplicáveis ​​a visualizar conjuntos macomolecular outros. FSM tem sido demonstrado por microtúbulos, filamentos intermediários, e os complexos de adesão.

Microinjeção de seleção, e as imagens de fluorescência marcado com F-actina através de microscopia fluorescente speckle (FSM).

Imagens de células vivas de F-actina Dynamics via Microscopia fluorescente Speckle (FSM)

Neste protocolo, descrevemos o uso da Microscopia de Pontos Fluorescentes (FSM) para capturar imagens de alta resolução da dinâmica da actina em células PtK1. Um...

A microscopia de manchas fluorescentes é utilizada para investigar a dinâmica de várias proteínas do citoesqueleto em células vivas. Quando utilizada corretamente, é possível obter medidas quantitativas da velocidade e da cinética de renovação de proteínas do citoesqueleto. Iniciamos este procedimento com a microinjeção de um pequeno volume de actina marcada fluorescentemente em células vivas.Em seguida, montamos a câmara de imagem para reduzir os efeitos do fotobranqueamento. Primeiro, dois pedaços de fita dupla face são colocados em ambos os lados da lâmina microscópica, onde repousará a lamínula com as células. Em seguida, o meio de imagem é pipetado para dentro da câmara, dispensando-se o meio próximo a uma das fendas abertas.Por último, os quatro lados são selados com valet. Olá, meu nome é James Lim e do laboratório de Galden's Deucer do Departamento de Biologia Celular do Instituto de Pesquisa Scripps. Hoje vamos mostrar a você um procedimento sobre microscopia de manchas fluorescentes.Utilizamos este procedimento para investigar a dinâmica da actina em células epiteliais migratórias. Vamos então começar. Um componente fundamental para obter bons filmes de microscopia de manchas fluorescentes é a marcação adequada da actina com o fluoróforo de sua escolha. Recomendamos o uso de fluoróforos da família Alexa e X rodina cin, derivados de ésteres médios que se ligam aos resíduos de lisina expostos na superfície da actina.É importante que a proporção de marcação seja alta, entre 0,3 e 0,7 corantes por monômero de actina, para garantir que os pontos apareçam brilhantes e discretos antes do armazenamento de longo prazo. Clarifique a solução de actina marcada por centrifugação a 75.000 a 80.000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius. A actina marcada deve ser armazenada em solução tampão G a menos 80 graus Celsius.Prepare alíquotas de dois microlitros para evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, o que pode levar à formação de agregados insolúveis. Para evitar o desbotamento fotoquímico dos corantes florais, não exponha a solução de actina marcada à luz direta por períodos prolongados e use tubos opacos de microcentrífuga para o armazenamento prolongado. As células para microinjeção sobre lâminas de vidro quadradas tratadas com ácido.O revestimento padrão do substrato pode ser aplicado à lamínula e não afetará a microinjeção. Armazene as células a 37 graus enquanto a actina está sendo preparada, a fim de selecionar células adequadas para microinjeção. Para FSM, considere estes critérios.As células devem ser grandes, com diâmetro superior a 50 micrômetros, devem espalhar-se planas após o plaqueamento e ser naturalmente aderentes a substratos. Também é útil se a área ocupada pela célula for maior do que a de seu núcleo. Algumas linhagens celulares adequadas incluem PTK one, células de pulmão de tritão e neurônios AIA.Nesta demonstração, injetaremos células epiteliais PTK1. A seleção correta das micropipetas de injeção depende do tamanho da abertura da ponta. Normalmente, os diâmetros podem variar de 0,5 micrômetros a até três micrômetros.Recomendamos um tamanho de abertura ótimo entre 0,5 e um micrômetro. Para a injeção de Acton, as microagulhas podem ser adquiridas prontas ou fabricadas. Se um puxador de agulhas comercial estiver disponível para iniciantes, recomendamos ter entre 10 e 20 agulhas puxadas prontas antes de iniciar o procedimento de injeção.O próximo passo é diluir a actina marcada com tampão de injeção gelado. Mantenha todas as soluções de trabalho em gelo. A concentração ideal de injeção, que é a concentração final de actina carregada na agulha, está entre 0,5 e 1 micrograma por microlitro.Com base em uma proporção de marcação de 40% de D por monômero de actina, carregue de 0,5 a um microlitro da solução diluída de actina. Usando uma agulha de seringa micrométrica, dispense cuidadosamente a solução de actina. Tente evitar bolhas.Se houver bolhas, elas podem ser facilmente removidas aspirando os líquidos em excesso ao redor da bolha. Certifique-se de que a solução Acton esteja completamente posicionada na ponta da agulha. Não deve haver solução em excesso em nenhuma parte do capilar da agulha, pois isso pode interromper o fluxo de injeção.A agulha carregada está agora pronta para ser fixada ao suporte de injeção para microinjeção. Retire suas células do incubador e coloque a lamínula na platina do microscópio. Para iniciar o procedimento de microinjeção, leve a agulha carregada até o microscópio.Fixe cuidadosamente a agulha evitando o contato com a ponta da agulha ao suporte do injetor. Posicione o suporte de modo que a agulha forme um ângulo de 35 a 50 graus em relação à base da platina do microscópio. Abaixe a ponta da agulha até que ela quase rompa a superfície do meio de banho.Agora posicione a ponta da agulha de modo que fique diretamente acima do centro do objetivo. Se a ponta da agulha estiver alinhada com o objetivo, você deverá ver um halo brilhante através da ocular. Esta é a extremidade da ponta da agulha.Mover lentamente a agulha de um lado para o outro pode ajudar a localizar melhor o halo. Ao navegar, certifique-se de que a ponta da agulha esteja bem acima das suas células. Para evitar quebrar a ponta da agulha, ajuste o Z.Focus do microscópio até que suas células estejam nitidamente visíveis.Em seguida, abaixe lentamente a ponta da agulha enquanto controla o foco até que o halo se contraia gradualmente e, por fim, se concentre na ponta da agulha. Você também pode procurar pelo corpo da agulha, que projetará sombras lineares. Abaixar a agulha definirá progressivamente o seu corpo.Pode ser necessário realizar pequenos ajustes no anel de fase para melhorar o contraste; tanto a extremidade da agulha quanto suas células devem estar agora claramente visíveis. Ao selecionar células para injeção, células com bordas livres devem estar voltadas para a ponta da agulha. Isso garantirá que a inclinação decrescente da célula, desde o ponto mais espesso, onde se encontra o núcleo, até o ponto mais fino da borda anterior, encontre a ponta da agulha, em vez de correr paralelamente a ela.Defina a pressão da agulha entre 0,3 e 0,8 PSI. A pressão constante aplicada resultará em um fluxo contínuo da solução de actina. Quando você decidir em qual célula realizar a injeção, posicione a agulha de modo que a ponta fique próxima ao núcleo da célula; lentamente, abaixe e reajuste a posição da agulha até que a ponta esteja exercendo pressão.O incremento da membrana abaixe lentamente a agulha até que sua ponta tenha perfurado a membrana. Se a agulha tiver perfurado completamente a membrana, a célula parecerá mais brilhante. Assim que você observar essa mudança, levante a agulha até que ela não esteja mais tocando a célula.O processo real de perfuração e injeção levará de 0,5 a dois segundos. Quando realizado corretamente, a forma da célula parecerá inalterada. Para minimizar o estresse nas células, não passe mais de 20 a 45 minutos em cada sessão de microinjeção.Às vezes, você pode não observar alterações na célula durante a injeção e a célula não fica mais brilhante. Isso indica que a ponta da agulha pode estar obstruída. Você pode testar isso pressionando o botão de limpeza, se disponível no seu injetor de trans.Se a ponta da agulha estiver aberta, isso aumentará significativamente o fluxo de pressão constante, o que pode ser observado como ondulações e dispersão de detritos próximos. Se a ponta da agulha estiver fechada, você pode inserir uma nova agulha de microinjeção ou tentar quebrar a ponta da agulha abaixando-a suavemente até que a extremidade pressione contra a lamínula de vidro, fazendo com que a ponta mais fina se quebre.A área de quebra não deve ser superior a um quinto da área da ponta da agulha, a porção da agulha que começa a convergir para um ponto, quando a microinjeção for concluída. Substitua o meio celular no recipiente por meio pré-aquecido fresco para remover qualquer resíduo fluorescente. Após a troca do meio, deixe as células se recuperarem por 30 minutos em uma incubadora a 37 graus antes da aquisição de imagens.Isso também permitirá que a actina se integre à rede existente do citoesqueleto enquanto as células se recuperam na incubadora, comece a montar a câmara de imagem. Primeiro, pré-aqueça o meio de imagem em um banho-maria a 37 graus. Em seguida, descongele um alíquota de 15 microlitros de oxa erase à temperatura ambiente.A adição de RA ao meio posteriormente reduzirá significativamente os efeitos do fotodesbotamento. Manter a oxa erase envolta em folha de alumínio garantirá que o composto fotossensível seja protegido da luz. Pré-aqueça o selante VAP em uma placa aquecedora ajustada em temperatura baixa; não superaqueça nem queime o VAP, ou ele perderá sua eficácia como selante.Limpe um lâmina microscópica com uma toalha de papel Kim umedecida com etanol puro para limpar e remover pequenos detritos. Empilhe dois pedaços de fita adesiva dupla face de mesmo tamanho, com 2,5 centímetros de comprimento, um sobre o outro, utilizando uma superfície plana e limpa, como outra lâmina microscópica. Como plataforma, pressione para expelir quaisquer bolhas de ar aprisionadas, criando um plano completamente plano.Em seguida, utilize uma lâmina de barbear para cortar duas tiras retas ao longo do eixo longitudinal da fita, de modo que cada tira meça 0,5 centímetros de largura. Usando pin&ccedil;as, posicione cada tira ao longo das bordas longas da sua l&acirc;mina de microsc&oacute;pio, de forma que as duas tiras de fita criem uma abertura no centro da sua l&acirc;mina. Pressione suavemente a fita para obter um bom selamento com o vidro.Essas tiras de fita atuarão como espaçadores entre a lâmina microscópica e a lamínula. Verifique a válvula para garantir que ela tenha se liquefeito completamente. Antes de iniciar a próxima etapa, recupere seu meio de imagem pré-aquecido.Adicione 15 microlitros de oxy rays a cada 500 microlitros de meio. Dobre um lenço químico em formato de triângulo para criar três bordas firmes. Isso será usado para limpar a lamínula posteriormente.Retire as células do incubador usando pinças. Segure um canto da lamínula rapidamente. Coloque a lamínula sobre um lenço de papel com o lado das células voltado para cima e sem tocar o tecido, e use o lenço de papel dobrado para limpar dois lados opostos da lamínula, criando uma superfície semi-seca.Em seguida, pegue um canto da lamínula com uma pinça e posicione a lamínula sobre a lâmina de microscopia de modo que as superfícies secas fiquem alinhadas com as duas tiras de fita. Observe que agora você tem dois lados fechados e duas fendas abertas. Pipete lentamente 200 microlitros da sua solução de meio de imagem RA próximo a uma das aberturas.É importante não introduzir bolhas de ar. A solução deve ser sugada para dentro da câmara recém-montada pelas forças capilares, imergindo completamente suas células na solução. Com um cotonete, toque os quatro cantos da lamínula com vap derretido para fixar e estabilizar rapidamente a lamínula.Você notará que o VAP seca em segundos à temperatura ambiente. Em seguida, começando pelos lados fechados, aplique uma fina camada de VAP utilizando o cotonete e imitando um movimento de pincelada. Repita o procedimento para os lados abertos.Construa lentamente a camada de VAP, reforçando o selamento ao repetir as etapas de revestimento. O VAP deve ser confinado às bordas, deixando o centro do lamínula limpo. Após selar as bordas do lamínula, limpe suavemente a parte central do lamínula utilizando um cotonete com H2O DD para remover qualquer meio residual.Tenha cuidado para não esmagar as células. Repita esta etapa de limpeza com etanol puro. Agora você tem uma câmara de imagem completamente fechada, otimizada para imagem de manchas fluorescentes.Ter um compartimento totalmente selado impedirá que suas células florais sofram fotobranqueamento rápido. As células na câmara totalmente fechada estão agora prontas para a aquisição de imagens. Utilizamos um microscópio invertido de campo amplo com lâmpada de mercúrio, iluminador de epifluorescência, filtros apropriados e objetiva de imersão a óleo plana.As imagens obtidas com objetivas apocromáticas são capturadas com uma câmera CCD refrigerada com pixels de 6,7 mícrons e um software de aquisição de imagens. Pré-aqueça a platina do microscópio a 37 graus. Coloque a câmara de imagem e aguarde de 10 a 15 minutos para que a temperatura se estabilize antes da aquisição de imagens.Uma vez que a temperatura tenha estabilizado, foque suas células em campo claro e, em seguida, localize suas células injetadas alternando para as configurações fluorescentes corretas. Tente minimizar o tempo de exposição à fluorescência para reduzir o fotodesbotamento. Procure células injetadas que apresentem bordas anteriores saudáveis e curvas.Células superinjetadas serão caracterizadas por bordas retraídas e irregulares, semelhantes a numerosos filopódios. Não image estas células. As configurações de aquisição dependerão do tipo celular, da qualidade da actina marcada e dos componentes do microscópio.No entanto, as configurações de exposição não devem ultrapassar dois segundos e o intervalo de tempo entre quadros deve ser definido entre cinco e dez segundos. As configurações de ganho na câmera podem ser aumentadas para elevar a relação sinal-ruído. As características ideais do speckle devem apresentar cada speckle espaçado por aproximadamente dois diâmetros de speckle até o speckle vizinho mais próximo.Para células epiteliais, a rede pontilhada de actina parecerá homogênea, com pontos distribuídos uniformemente. As configurações de exposição devem ser ajustadas para obter as melhores imagens com padrão pontilhado.A chave para obter bons filmes de granulação é manter o foco. Isso é particularmente importante para a análise pós-experimental envolvendo medidas de fluxo e renovação da granulação. Assim, a qualidade da análise quantitativa dependerá da fixação do foco durante toda a duração do lapso de tempo.Várias estratégias para manter o foco são detalhadas no texto; neste demonstração, será utilizado o sistema de foco perfeito da Nikon. Abaixo estão diversos exemplos de células microinjectadas. O painel esquerdo mostra uma célula submicroinjectada com uma imagem de manchas de baixa concentração.O painel central mostra uma célula superinjetada com uma imagem de pontilhado com concentração muito alta, e o painel direito mostra uma célula injetada de forma ideal. Para a microscopia de pontilhado fluorescente com uma boa imagem de pontilhado, acabamos de mostrar como microinjetar actina marcada fluorescentemente em células epiteliais.Ao realizar este procedimento, é extremamente importante lembrar que a qualidade da actina marcada, bem como a técnica de microinjeção, determinarão a qualidade geral das suas imagens de manchas. É isso, e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

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