No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

No útero, a eletroporação da retina começa com uma incisão abdominal em uma barragem anestesiada de E 13,5 a 14,5 estágios para expor a cadeia embrionária. O DNA é injetado em uma retina por embrião e as cabeças são eletroporadas, fazendo com que o DNA seja absorvido pelos progenitores do RGC. Em E, 18,5 embriões são perfundidos e GFP positivos.

As projeções visuais e de retina são analisadas para eletroporação de retina X vivo. E 13,5 a 14,5 cabeças são fixadas com o lado dorsal para cima em um prato e o DNA é injetado na região dorsal periférica de ambas as retinas, seguido de eletroporação. A retina inteira é cultivada por 40 horas, seguida por explantes retinianos positivos para GFP para ensaios de cultura in vitro.

Olá, sou Tim Petros, do laboratório da Dra. Carol Mason no Departamento de Patologia e Biologia Celular e Neurociência da Universidade de Columbia. Hoje mostraremos como introduzir genes na retina espelhada embrionária, utilizando eletroporação retiniana in utero e ex vivo. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar como a manipulação da expressão gênica e das células ganglionares da retina altera sua via de projeção especificamente no quiasma óptico.

Ok, vamos começar. Antes de tentar a eletroporação retiniana in utero, a preparação adequada é essencial. Consulte nosso protocolo escrito para obter informações detalhadas sobre a preparação da esterilização anestésica de ferramentas e instrumentação, preparação das soluções de DNA para injeção e soluções antimicóticas antibióticas para após a cirurgia, preparação da área cirúrgica e aquecimento das soluções adequadas.

Micropipetas de ponta fina devem ser preparadas antes da cirurgia usando um extrator de microeletrodos. Quebre a ponta para fazer um ponto angular para eletroporação in utero Primeiro injete 0,15 mililitros da mistura anestésica interperitoneal em uma barragem de estágio E 13,5 a E 14,5. Deve levar de três a sete minutos até que a barragem esteja totalmente sob anestesia para testar se o camundongo está anestesiado.

Aperte a pata traseira e verifique se há falta de resposta durante o intervalo em que o animal está sucumbindo à anestesia. Corte um pequeno pedaço e pipete cinco microlitros da solução de DNA no parâmetro. Dobre um êmbolo de fio de metal em um ângulo de 90 graus e insira-o em uma micropipeta puxada usando o êmbolo aspirar a solução de DNA na micropipeta.

Agora exponha cirurgicamente os embriões de camundongos. Consulte o protocolo JoVE de Wal Inus et al para obter a técnica adequada. Agora estamos prontos para a eletroporação.

O primeiro passo é orientar a retina adequadamente. Então vamos injetar DNA na retina e depois vamos eletro desfile na cabeça. Ok, vamos começar.

Ok, o primeiro passo é orientar a retina para que ela fique voltada para cima como esta. Em seguida, com a micropipeta, perfuraremos a parede amniótica e, idealmente, injetaremos o DNA diretamente na retina. Depois de perfurar a parede uterina, você pressionará o êmbolo, que expelirá o DNA para a retina e puxará o êmbolo para trás.

Como tal, depois de injetar o DNA, você deve ver o corante verde preenchendo o líquido amniótico e também a retina. Ok, agora que fizemos a injeção, estamos prontos para a eletroporação. Então, para a eletrooração, vamos colocar as pás de eletroporação ao redor do embrião com a pá positiva adjacente à retina que foi eletrodesfilada.

E quando estiver pronto, um remo depressivo e que entregará corrente ao embrião. Você vê bolhas se formando na pá da panela de carga negativa e isso mostra que a eletroporação foi um sucesso. E você repetirá esta etapa para todos os embriões injetados.

Então é assim que você eletro o DNA em uma retina embrionária. Você pode repetir este procedimento até quantos embriões desejar. Tendo em mente que quanto mais embriões você desfilar, maior a chance de a mãe abortar os embriões.

Depois de eletro desfilar os embriões, use os dedos para massagear a cadeia embrionária de volta à barragem assim que os embriões estiverem de volta. Despeje cerca de dois mililitros da solução antibiótica antimicótica na cavidade abdominal. Use o hemostático e a pinça para suturar o peritônio começando com um nó duplo na porção anterior da incisão e continue em um padrão de sutura contínua simples até a porção posterior da incisão.

Use o laço final para amarrar a sutura e aparar o excesso de sutura. Finalmente, grampeie a incisão fechada. Para fazer isso, levante a pele na porção anterior da incisão com uma pinça romba.

Tenha cuidado para separar a pele do peritônio. Em seguida, coloque os dentes do grampeador ao redor da pele e, para pressionar o grampeador, continue grampeando a incisão fechada até a extremidade posterior, o que geralmente requer de cinco a sete grampos. Quando terminar, grampeando, limpe a ferida ao redor dos grampos com uma compressa com álcool.

Deixe a barragem se recuperar na almofada de aquecimento e coloque-a em uma nova gaiola. Quando ela começa a se contorcer e rolar, geralmente leva de 15 a 90 minutos para ela acordar para minimizar a dor e o desconforto. As mães recebem buprenorfina ao acordar e em momentos posteriores.

Se o desconforto persistir para evitar a desidratação, injete a barragem com um mililitro de solução salina por via subcutânea cerca de duas a quatro horas após a cirurgia. Após 24 horas após a cirurgia, a mãe deve recuperar o comportamento normal e beber e comer regularmente. Vamos colher a retina eletroporada em E 18,5 para análise.

Alternativamente, você pode deixar a mãe dar à luz e colher a retina em idades pós-natais para análise em idades posteriores. Depois de anestesiar o animal, use uma tesoura para cortar a pele e o peritônio sob os grampos. Para expor a cavidade abdominal e os cornos uterinos, remova um embrião eletroporado e prenda o embrião através dos membros em um prato de dissecação, com o lado ventral para cima, corte a pele abdominal e o peritônio e corte as porções laterais da caixa torácica para expor o coração.

Em seguida, perfure o ventrículo esquerdo com a agulha de perfusão e corte o átrio direito com a microtesoura. Agora inicie a perfusão e deixe o PFA fluir por cerca de 60 a 90 segundos. Se feito corretamente, o sangue deve sair do átrio direito e o embrião deve ficar pálido.

Uma vez terminada a perfusão, decapitar o embrião e coletar as cabeças em 4% de PF em um frasco cônico de 15 mililitros. Repita este procedimento para todos os embriões eletroporados e todas as mães. Uma vez terminada a coleta de todos os embriões, sacrifique a mãe por luxação cervical.

Mantenha as cabeças em 4% PFA durante a noite a quatro graus Celsius e depois lave em PBS por vários dias após a lavagem com PBS, agora você está pronto para examinar a retina quanto à expressão bem-sucedida de GFP. Primeiro, prenda a cabeça em uma placa de dissecação com a retina voltada para cima e imersa em PBS. Remova a pele ao redor da retina para revelar o epitélio pigmentar da retina ou EPR usando uma agulha de calibre 26 e meio.

Perfure a retina ventral na junção do EPR do cristalino. Em seguida, insira uma ponta da microtesoura neste orifício e faça uma incisão vertical através da retina ventral até o disco óptico. Isso permitirá que você oriente a retina ao retirá-la.

Separe o EPR da retina agarrando o EPR na incisão ventral com um par de pinças. E use outro par de pinças para retirar o EPR da retina, especificamente na junção da lente do EPR, onde o EPR está firmemente preso. Depois de remover o RPE, segure a lente com uma pinça e puxe para cima e para fora.

Para remover o cristalino, remova cuidadosamente a retina colocando uma pinça embaixo da retina e aperte a cabeça do nervo óptico para liberar a retina. Finalmente, transfira a retina para A PBS preenchida. Bem, certifique-se de acompanhar de qual retina veio, quais cabeças repetem essas etapas para a retina contralateral e para todos os outros embriões eletroporados, use um microscópio de dissecação fluorescente para escanear toda a retina em busca de retina positiva para GFP, o que indicaria que a eletroporação foi bem-sucedida neste embrião e essas retinas e o cérebro correspondente podem ser processados para análise posterior.

O procedimento de eletroporação retiniana ex vivo requer várias etapas preparatórias adicionais que são distintas da eletroporação in utero. Consulte o protocolo escrito para obter informações detalhadas sobre a preparação e oxigenação do meio livre de soro e a preparação de placas de cultura e ensaios de borda. Após anestesiar o animal, a cavidade abdominal é aberta como demonstrado anteriormente e toda a cadeia embrionária é removida e colocada em D-M-E-M-F 12 no gelo.

A mãe deve então ser sacrificada usando luxação cervical. Use uma tesoura para cortar a parede uterina, em seguida, remova os embriões do saco amniótico e colete em DMEF 12 e mantenha no gelo embriões decapitados e mantenha em meio DMEA em corpos de gelo podem ser descartados. Em seguida, use uma pipeta bucal ou uma pipeta de êmbolo e encha uma micropipeta com a quantidade desejada de solução de DNA.

Em seguida, transfira um. Dirija-se a um prato de dissecação com PBS e prenda a cabeça com o lado dorsal para cima. Vá para o escopo de dissecação para as injeções.

Ok, agora estamos prontos para eletro prate. Vou injetar o DNA na dorsal periférica de ambas as retinas e, em seguida, eletrocutar a cabeça. Ok, aqui vou eu.

O primeiro passo é remover a pele acima da retina. Para fazer isso, usaremos a pinça apenas para descascar a pele. Agora podemos ver a porção dorsal de ambas as retinas.

Em seguida, vou injetar DNA logo abaixo da camada do epitélio pigmentar da retina em ambas as retinas. Para fazer isso, vou segurar o eletrodo em uma posição quase horizontal e perfurar o EPR na parte dorsal mais periférica da retina. Você deve ver o corante verde preencher o espaço retiniano e vazar para a solução de PBS.

Ok, agora é hora da eletroporação. Primeiro você solta a cabeça. Agora vamos atacar eletrograficamente as pás e queremos que a pá positiva esteja no lado ventral da cabeça.

Então, colocaremos a cabeça dentro das pás com a pá positiva na superfície ventral e aplicaremos pressão para manter a pá estável assim. E agora vamos desfilar eletro. Você pode ver as bolhas se formando no remo e no topo da cabeça.

E é isso. Agora vamos mover a cabeça para um prato com mediana. Então é isso para a eletroporação retiniana ex vivo.

Repita este procedimento para quantos embriões e condições de DNA desejar. Agora vamos nos preparar para cultivar a retina. Depois de completar todas as preparações elétricas, adicione cerca de 1,5 mililitros de solução SFM oxigenada a um prato de quatro poços e mantenha-o no gelo.

Tenha um poço para cada solução de DNA diferente injetada. Em seguida, transfira um eletroporado. Dirija-se a uma placa de dissecação com D-M-E-M-F 12 com uma retina voltada para cima na retina ventral ou no lado oposto à região-alvo.

Use uma pinça fina para beliscar e fazer um buraco no EPR. Use este orifício como ponto de partida para retirar o RPE ao redor da retina. Não corte ou danifique o olho, pois isso fará com que a retina entre em colapso durante a incubação.

Depois de remover o RPE, use uma pinça para retirar a retina, beliscando o nervo óptico na base da retina, deixando a lente intacta. Transfira a retina para o SFM oxigenado no prato de quatro poços. Dirija-se e repita a remoção da retina para o olho contralateral.

Conclua esta etapa para todas as cabeças eletroporadas e incube a retina no SFM oxigenado a 37 graus Celsius por 40 a 48 horas. Após a incubação de toda a retina, transfira a retina de um poço de SFM oxigenado para uma tampa de placa de Petri com DME MF 12. Usando um escopo de dissecação fluorescente, escolha uma retina e visualize a porção de expressão positiva de GFP da retina.

Em seguida, usando um microbisturi e uma pinça, disseque e descarte a porção não positiva para GFP da retina para que apenas um pedaço positivo para GFP da retina permaneça. É útil alternar continuamente entre luz fluorescente e regular durante a dissecação. Para selecionar especificamente a retina positiva para GFP, transfira o pedaço de retina positivo para GFP para um poço com G-M-E-M-F 12.

Repita esta etapa para todas as retinas de um Bem, para cada condição de DNA, use uma nova placa de Petri e um meio D-M-E-M-F 12 para dissecar esses pedaços de retina positivos para GFP em um explanante retiniano menor para revestir. Use um escopo de dissecação para cortar o grande pedaço de retina positiva para GFP em uma explicação menor com um micro bisturi. O explan deve ter cerca de 200 a 300 micrômetros de comprimento e largura.

Um pedaço de retina positivo para GFP deve produzir cerca de quatro a 10 explanação retiniana positiva para GFP Colete todos os explans em um poço com D-M-E-M-F 12. Repita esta etapa para todas as regiões retinianas positivas para GFP que são colhidas. Depois de preparar todas as explicações retinianas positivas para GFP, adicione 250 microlitros de SFM frio mais 0,4% de metilcelulose às placas de cultura revestidas com laminação.

Em seguida, transfira de quatro a oito explanação positiva GFP para a placa de cultura e use a pinça para organizar suavemente a explanação X em um polígono com a explanação x localizada a meio caminho entre o centro e a borda da placa. Determine qual lado da explanação X é a camada RGC. Isso pode ser feito procurando cristais de RPE, que às vezes podem permanecer presos à camada externa da retina, indicando que o lado oposto é a camada RGC.

O lado RGC também costuma ter alguns detritos celulares que podem ajudar na explicação adequada com a camada RGC para baixo. Use uma pinça para pressionar firmemente o centro da explicação para que ela adira à lamínula de vidro na base da placa de cultura. Depois de colocar todos os X explane em uma placa de cultura, transfira para uma incubadora de 37 graus Celsius.

Os explantes do X da retina exibem crescimento abundante do axônio após 24 horas e podem ser usados para vários ensaios in vitro e, em seguida, fixados com 4% de PFA por 30 minutos. E coloração imunológica para o ensaio de borda. Transfira o explanante positivo 4G FP para um prato que tenha sido preparado para o ensaio de borda.

Disponha os explantes X em uma linha reta que aproxime a borda fluorescente do substrato de interesse. Sob um microscópio de dissecação fluorescente, use uma pinça para revestir o EXPLAN de modo que fique a cerca de 50 a 150 micrômetros da borda fluorescente. Alternando entre os dois canais fluorescentes para visualizar a explicação verde e a borda vermelha.

Em seguida, incube as placas a 37 graus Celsius por 24 horas, permitindo tempo suficiente para que os axônios RGC atinjam o substrato da borda. O X explan pode então ser fixado em 4% de PFA por 30 minutos, seguido de imunocoloração. Seguindo eletroporação retiniana in utero.

As montagens de orifícios retinianos podem ser preparadas para visualizar GCs R positivos para GFP na retina e semi-intactos. Os sistemas visuais podem ser preparados para visualizar axônios positivos para GFP em todo o nervo óptico, quiasma óptico e trato óptico. Alternativamente, cortes criogênicos frontais podem ser feitos através da via da retina e RGC para visualizar e analisar corpos celulares RGC positivos para GFP na retina e axônios no quiasma e trato do nervo óptico.

Todos os axônios da retina são visualizados com coloração de neurofilamento. Além disso, no útero, a eletroporação pode ser usada para estudar o direcionamento do axônio RGC no núcleo do gene lateral LGN, colhendo filhotes em P quatro a P 10. Em P, oito axônios positivos para GFP são visíveis no LGN com CTB LOR 5 94 canal vermelho injetado na retina ipsilateral e CT bor 6 47 Canal Azul na retina contralateral para rotular toda a projeção RGC após eletroporação ex vivo e plaqueamento de implantes retinianos.

Um subconjunto de axônios RGC RGFP positivo e pode ser claramente visualizado em potência mais baixa e mais alta, como visto nas imagens superior e inferior, respectivamente. A resposta dos axônios positivos para GFP pode ser analisada por plaqueamento XS adjacente às bordas de vários substratos mostrados aqui em azul. Acabamos de mostrar como introduzir genes na retina espelhada embrionária, utilizando eletroporação retiniana in utero e ex vivo.

Embora tenhamos focado nossa análise na orientação do axônio do quiasma óptico, essa técnica pode ser benéfica para aqueles que estudam a diferenciação do RGC, a morfologia dendrítica e as propriedades eletrofisiológicas das células ganglionares da retina. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de minimizar os danos à retina ao injetar o DNA e sempre manter os embriões hidratados com PBS durante todo o experimento. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.