Name: No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Aprenda eletroporação in utero e ex vivo para manipulação gênica em células ganglionares da retina murina. Este método permite estudar desenvolvimento e propriedades funcionais das RGCs em modelo de rato.

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Agradecemos ao Dr. Richard Vallee e Brikha Shrestha para ajudar com o in utero e ex vivo técnicas de eletroporação retinal, respectivamente, e Dr. T. Sakurai para comentários a este protocolo. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants F31 NS051008 (TJP), a Fondation pour la Recherche Medicale, ea Human Frontier Science Program (AR) e R01 EY12736 (CM).

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li>
</ol>

Neste vídeo, demonstramos técnicas de eletroporação, tanto no útero e ex vivo, para entrega de genes em embriões murinos RGCs. In utero eletroporação retinal fornece um mecanismo para a manipulação de expressão gênica em RGCs e visualizar suas projeções de axônio in vivo. Permitindo que os embriões de sobreviver após o nascimento permite a avaliação desses GFP + projeções RGC em seu alvo, o núcleo geniculado lateral (LGN). Ex eletroporação in vivo da retina fornece uma capacidade mais controlada para atingir regiões específicas da retina para uso com ensaios in vitro. Combinando in vivo e in vitro análises derivadas dessas técnicas permite a caracterização completa de desenvolvimento RGC e projeções axônio em um subconjunto de RGCs em um fundo de outra maneira normal. Enquanto a nossa manifestação se concentra em RGC orientação axônio no quiasma óptico, tanto no útero e electroporations ex vivo da retina pode ser benéfico para estudar como perturbações no gene de diferenciação efeito expressão RGC, morfologia dendrítica, propriedades eletrofisiológicas, formação de sinapses e adequada focalização em zonas de rescisão como o LGN e colículo superior.

<table><tbody><tr><td>BTX Electro Square Porator ECM 830 (com pedal)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodos tipo pinça redondos</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 ou CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>Suturas de seda</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas de vidro com êmbolos</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Meio DMEM/F12</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Placas com fundo de vidro e poços micrométricos</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

no útero e ex eletroporação in vivo para expressão gênica em células ganglionares da retina do rato

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Da retina e sua neurônio de saída única, a células ganglionares da retina (RGC), constituem um excelente modelo para examinar questões biológicas, tais como diferenciação celular, axônio orientação, organização e formação de sinapses retinotopic [1]. Uma desvantagem é a incapacidade de maneira eficiente e confiável manipular expressão gênica em RGCs in vivo, especialmente nos de outra forma acessível murino caminhos visual. Camundongos transgênicos podem ser usados ​​para manipular a expressão do gene, mas esta abordagem é muitas vezes caro, demorado e pode produzir efeitos colaterais indesejados. No bico, na eletroporação in ovo é usado para manipular a expressão do gene em RGCs para o exame da retina e desenvolvimento RGC. Embora as técnicas de eletroporação semelhantes foram desenvolvidas em filhotes de rato neonatal [2], ratos adultos [3], e retinae embrionárias murinas in vitro [4], nenhuma dessas estratégias permitirá a caracterização completa de desenvolvimento RGC e projeções axônio in vivo. Para este fim, desenvolvemos duas aplicações de eletroporação, uma no útero e os outros ex vivo, especificamente alvo embrionárias murinas RGCs [5, 6]. Com eletroporação in utero da retina, podemos misexpress ou downregulate genes específicos em RGCs e siga suas projeções de axônio através das vias visuais in vivo, permitindo a análise de decisões de orientação em objectivos intermédios, como o quiasma óptico, ou em regiões-alvo, como o núcleo geniculado lateral. Perturbando a expressão de genes em um subconjunto de RGCs em um fundo de outra forma tipo selvagem facilita a compreensão da função dos genes ao longo do percurso da retina. Além disso, temos desenvolvido uma técnica para analisar companheiro crescimento do axônio RGC in vitro. Nós electroporate embrionárias cabeças ex vivo, recolher e incubar toda a retina, em seguida, preparar explantes de retina estes dias mais tarde. Explantes da retina pode ser usado em uma variedade de ensaios in vitro, a fim de examinar a resposta de electroporated axônios RGC aos sinais de orientação ou de outros fatores. Em suma, este conjunto de técnicas aumenta nossa capacidade de misexpress ou downregulate genes em RGCs e deve ajudar muito o desenvolvimento de estudos examinando RGC e projeções axônio.

Aqui apresentamos duas técnicas para manipular a expressão do gene em camundongos células ganglionares da retina (RGCs) por<em&gt; In utero</em&gt; E<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação. Estas técnicas permitem que se examine como as alterações na expressão dos genes afetam o desenvolvimento RGC, orientação axônio, e propriedades funcionais.

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

A retina e seu único neurônio de saída, a célula ganglionar da retina (CGR), constituem um modelo excelente para examinar questões biológicas como a célula...

In utero, a eletroporação retiniana começa com uma incisão abdominal em uma fêmea anestesiada nos estágios E 13,5 a 14,5 para expor a cadeia embrionária. O DNA é injetado em uma retina por embrião e as cabeças são eletroporadas, fazendo com que o DNA seja incorporado pelos progenitores das células ganglionares da retina (RGC). Em E 18,5, os embriões são perfundidos e apresentam GFP positivo.A retina e as projeções visuais são analisadas para a eletroporação retiniana ex vivo. Cabeças de E 13,5 a 14,5 são fixadas com a face dorsal voltada para cima em uma placa, e o DNA é injetado na região dorsal periférica de ambas as retinas, seguido por eletroporação. Retinas inteiras são cultivadas por 40 horas, seguidas pelo plaqueamento de explantes retinianos positivos para GFP para ensaios de cultura in vitro.Olá, sou Tim Petros do laboratório da Dra. Carol Mason, do Departamento de Patologia e Biologia Celular e Neurociência da Universidade Columbia. Hoje vamos mostrar como introduzir genes na retina em desenvolvimento de embriões utilizando eletroporação retiniana in utero e ex vivo. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar como a manipulação da expressão gênica em células ganglionares da retina altera sua via de projeção, especificamente no quiasma óptico.Ok, vamos começar. Antes de tentar a eletroporação retiniana in utero, é essencial um preparo adequado. Consulte nosso protocolo escrito para obter informações detalhadas sobre o preparo da anestesia, esterilização de ferramentas e instrumentos, preparação das soluções de DNA para injeção e soluções antibióticas antifúngicas para uso após a cirurgia, preparação da área cirúrgica e aquecimento das soluções apropriadas.Pipetas microfinas devem ser preparadas previamente à cirurgia utilizando um puxador de microeletrodos. Quebre a ponta para obter um ponto angulado para a eletroporação intraútero. Primeiro, injete 0,15 mililitros da mistura anestésica por via intraperitoneal em uma fêmea gestante entre os estágios E13,5 e E14,5. Levará de três a sete minutos até que a fêmea esteja completamente anestesiada; para verificar se o camundongo está anestesiado, realize um teste de reflexo.Pince a pata traseira e verifique a ausência de resposta durante o intervalo em que o animal está entrando em anestesia. Corte um pequeno pedaço e pipete cinco microlitros da solução de DNA sobre o param. Dobre um êmbolo de fio metálico em um ângulo de 90 graus e insira-o em uma micropipeta puxada, utilizando o êmbolo para aspirar a solução de DNA para dentro da micropipeta.Agora exponha cirurgicamente os embriões de camundongo. Consulte o protocolo do JoVE por Wal Inus et al. para a técnica adequada. Agora estamos prontos para a eletroporação.O primeiro passo é orientar adequadamente a retina. Em seguida, injetaremos DNA na retina e então realizaremos a eletroporação da cabeça. Ok, vamos começar.Certo, o primeiro passo é orientar a retina de modo que ela fique voltada para cima, como esta aqui. Em seguida, com a micropipeta, vamos perfurar a parede amniótica e, idealmente, injetar o DNA diretamente na retina. Após perfurar a parede uterina, você deverá pressionar o êmbolo, o que fará com que o DNA seja expelido dentro da retina, e então puxar o êmbolo de volta.Assim sendo, após injetar o DNA, você deverá observar o corante verde preenchendo o líquido amniótico e também a retina. Ok, agora que realizamos a injeção, estamos prontos para a eletroporação. Para eletroporar, vamos posicionar as placas de eletroporação ao redor do embrião, com a placa positiva adjacente à retina que foi eletroporada.E, quando estiver pronto, um estímulo elétrico depressivo no pedal e isso fará com que a corrente seja entregue ao embrião. Você verá bolhas se formando no pedal do polo negativo, o que indica que a eletroporação foi bem-sucedida. Repita este passo para todos os embriões injetados.Assim é como se eletropora DNA em uma retina embrionária. Você pode repetir este procedimento em quantos embriões desejar. Tenha em mente que quanto mais embriões forem eletroporados, maior será a chance de a mãe abortar os embriões.Após a eletroporação dos embriões, use os dedos para massagear a cadeia embrionária de volta para dentro da fêmea, uma vez que os embriões estejam de volta. Despeje cerca de dois mililitros da solução antibiótica antimicótica na cavidade abdominal. Use o hemostato e a pinça para suturar o peritônio, começando com um nó duplo na porção anterior da incisão e continuando com um padrão de sutura contínua simples até a porção posterior da incisão.Use o último laço para amarrar o ponto e corte o excesso de fio. Por fim, feche a incisão com grampos. Para isso, levante a pele na porção anterior da incisão com uma pinça romba.Tenha cuidado para separar a pele do peritônio. Em seguida, posicione os dentes da grampeadora ao redor da pele e pressione a grampeadora, continuando a grampear a incisão até a extremidade posterior, o que geralmente requer de cinco a sete grampos. Após concluir a grampeamento, limpe a ferida ao redor dos grampos com um cotonete de álcool.Deixe a fêmea se recuperar sobre a placa aquecida e, em seguida, coloque-a em uma nova gaiola. Quando ela começar a apresentar tremores e rolar, geralmente leva entre 15 e 90 minutos para acordar, o que minimiza dor e desconforto. As fêmeas recebem buprenorfina ao acordar e em momentos posteriores.Se o desconforto continuar a impedir a hidratação, injete a fêmea com um mililitro de soro fisiológico por via subcutânea cerca de duas a quatro horas após a cirurgia. Após 24 horas da cirurgia, a fêmea deverá retomar o comportamento normal e estar bebendo e se alimentando regularmente. Coletaremos a retina eletroporada no E 18,5 para análise.Alternativamente, você pode permitir que a fêmea pare e colete a retina em idades pós-natais para análise em estágios posteriores. Após anestesiar o animal, use uma tesoura para cortar a pele e o peritônio sob os grampos. Para expor a cavidade abdominal e os cornos uterinos, remova um embrião eletroporado e fixe o embrião pelas patas em uma placa de dissecação com a face ventral voltada para cima, corte a pele abdominal e o peritônio e, em seguida, corte as porções laterais da caixa torácica para expor o coração.Em seguida, perfure o ventrículo esquerdo com a agulha de perfusão e corte o átrio direito com a tesoura microcirúrgica. Agora, inicie a perfusão e permita que o PFA flua por cerca de 60 a 90 segundos. Se realizado corretamente, o sangue deverá sair pelo átrio direito e o embrião deverá ficar pálido.Após concluir a perfusão, decapite o embrião e colete as cabeças em PF 4% em um tubo cônico de 15 mililitros. Repita este procedimento para todos os embriões eletroporados e todas as matrizes. Após concluir a coleta de todos os embriões, sacrifique a matriz por dislocação cervical.Mantenha as cabeças em PFA 4% durante a noite a quatro graus Celsius e, em seguida, lave em PBS por vários dias; após as lavagens com PBS, você já está pronto para examinar a retina quanto à expressão bem-sucedida de GFP. Primeiro, fixe a cabeça em uma placa de dissecação com a retina voltada para cima e imersa em PBS. Remova a pele ao redor da retina para expor o epitélio pigmentado da retina ou RPE utilizando uma agulha de calibre 26 e meio.Fure a retina ventral na junção entre a lente e o epitélio pigmentado da retina (RPE). Em seguida, insira uma das pontas da tesoura microcirúrgica nesse orifício e faça uma incisão vertical através da retina ventral até o disco óptico. Isso permitirá que você oriente a retina ao removê-la.Se pare o epitélio pigmentado da retina (EPR) da retina segurando o EPR no corte ventral com um par de pin&ccedil;as. E use outro par de pin&ccedil;as para destacar o EPR da retina, especificamente na jun&ccedil;&atilde;o EPR-cristalino, onde o EPR est&aacute; firmemente aderido. Ap&oacute;s remover o EPR, segure o cristalino com pin&ccedil;as e puxe para cima e para fora.Para remover o cristalino, remova cuidadosamente a retina colocando uma pinça sob a retina e apertando o disco óptico para soltar a retina. Finalmente, transfira a retina para um poço preenchido com PBS. Certifique-se de acompanhar de qual cabeça veio cada retina. Repita esses passos para a retina contralateral e para todos os demais embriões eletroporados. Utilize um microscópio estereoscópico fluorescente para examinar todas as retinas em busca de retinas positivas para GFP, o que indicaria que a eletroporação foi bem-sucedida neste embrião, e essas retinas e o cérebro correspondente podem ser processados para análises adicionais.O procedimento de eletroporação ex vivo da retina exige várias etapas preparatórias adicionais que são distintas da eletroporação in utero. Consulte o protocolo escrito para obter informações detalhadas sobre a preparação e oxigenação do meio livre de soro e sobre a preparação de placas de cultura e ensaios de borda. Após anestesiar o animal, a cavidade abdominal é aberta conforme demonstrado anteriormente e toda a cadeia embrionária é removida e colocada em D-M-E-M-F 12 sobre gelo.A matriz deve então ser submetida à eutanásia por dislocação cervical. Use uma tesoura para cortar a parede uterina, depois remova os embriões do saco amniótico e colete-os em D-M-E-M-F 12, mantendo-os em gelo. Decapite os embriões e mantenha-os em meio DMEA sobre gelo; os corpos podem ser descartados. Em seguida, use uma pipeta de boca ou uma pipeta com êmbolo e preencha uma micropipeta com a quantidade desejada de solução de DNA.Em seguida, transfira um. Leve-o para uma placa de dissecação com PBS e fixe a cabeça com o lado dorsal voltado para cima. Prossiga para o microscópio estereoscópico para as injeções.Ok, agora estamos prontos para eletroporar. Vou injetar o DNA na região dorsal periférica de ambas as retinas e, em seguida, eletroporar a cabeça. Ok, vamos lá.O primeiro passo é remover a pele acima da retina. Para isso, usaremos a pinça para desprender cuidadosamente a pele. Agora podemos ver a porção dorsal de ambas as retinas.A seguir, vou injetar DNA logo abaixo da camada do epitélio pigmentado da retina em ambas as retinas. Para tanto, vou segurar o eletrodo em uma posição quase horizontal e perfurar o EPR na parte dorsal mais periférica da retina. Você deverá ver a coloração verde preencher o espaço retiniano e vazar para a solução de PBS.Ok, agora é a hora da eletroporação. Primeiro, você remove o pino da cabeça. Agora vamos aplicar o pulso elétrico com as placas, e queremos que a placa positiva fique no lado ventral da cabeça.Então posicionaremos a cabeça entre as hastes com a haste positiva na superfície ventral e aplicaremos pressão para manter a haste estável dessa forma. Agora realizaremos a eletroporação. É possível observar as bolhas se formando na haste e no topo da cabeça.E é isso. Agora vamos mover a cabeça para um recipiente com meio. Assim concluímos a eletroporação retiniana ex vivo.Repita este procedimento para quantos embriões e condições de DNA desejar. Agora vamos nos preparar para cultivar a retina. Após concluir todas as preparações eletro, adicione cerca de 1,5 mililitros de solução SFM oxigenada a uma placa de quatro poços e mantenha-a em gelo.Utilize um poço para cada solução de DNA diferente injetada. Em seguida, transfira um eletroporado. Dirija-se a uma placa de dissecação com D-M-E-M-F 12 com uma retina voltada para cima, seja na retina ventral ou no lado oposto à região-alvo.Use pin&ccedil;as finas para pin&ccedil;ar e rasgar um orif&iacute;cio no epit&eacute;lio pigmentado da retina (RPE). Use este orif&iacute;cio como ponto de partida para destacar o RPE ao redor da retina. N&atilde;o corte nem danifique o olho, pois isso far&aacute; a retina colapsar sobre si mesma durante a incuba&ccedil;&atilde;o.Após remover o EPR, use pinça para extrair a retina pinçando o nervo óptico na base da retina, mantendo a lente intacta. Transfira a retina para o meio SFM oxigenado na placa de quatro poços com a face voltada para cima. Prossiga e repita a remoção da retina no olho contralateral.Realize este passo para todas as cabeças eletroporadas e incube a retina no meio SFM oxigenado a 37 graus Celsius por 40 a 48 horas. Após a incubação da retina inteira, transfira a retina de um poço de meio SFM oxigenado para uma tampa de placa de Petri com D-M-E-M-F 12. Utilizando um microscópio estereoscópico fluorescente, escolha uma retina e visualize a porção da retina que expressa GFP positivamente.Em seguida, utilizando um escalpelo microcirúrgico e pinça, dissecar e descartar a porção da retina não positiva para GFP, de modo que apenas um fragmento da retina positivo para GFP permaneça. É útil alternar continuamente entre luz fluorescente e luz comum durante toda a dissecação. Para selecionar especificamente a retina positiva para GFP, transferir o fragmento positivo para GFP para um poço contendo G-M-E-M-F 12.Repita este passo para todas as retinas de um poço; para cada condição de DNA, use um novo recipiente de Petri e meio D-M-E-M-F 12 para dissecar esses fragmentos positivos para GFP da retina em explantes retinianos menores para plaqueamento. Use um microscópio estereoscópico para cortar o fragmento grande de retina positiva para GFP em explantes menores com uma lâmina microcirúrgica. Os explantes devem ter cerca de 200 a 300 micrômetros de comprimento e largura.Um fragmento positivo para GFP da retina deve produzir cerca de quatro a dez explantes retinianos positivos para GFP. Colete todos os explantes em um poço com D-M-E-M-F 12. Repita este passo para todas as regiões retinianas positivas para GFP que forem colhidas. Após preparar todos os explantes retinianos positivos para GFP, adicione 250 microlitros de SFM frio mais 0,4% de metilcelulose a placas de cultura revestidas com laminina.Em seguida, transfira quatro a oito explantes GFP positivos para a placa de cultura e use a pinça para organizar suavemente os X explantes em um polígono, com os explantes posicionados a meia distância entre o centro e a borda da placa. Determine qual lado dos explantes X corresponde à camada de RGC. Isso pode ser feito buscando cristais de RPE, que às vezes permanecem aderidos à camada retiniana externa, indicando que o lado oposto é a camada de RGC.O lado das CGR também geralmente apresenta algum debris celular que pode auxiliar na correta orientação com a camada de CGR voltada para baixo. Use pin&ccedil;as para pressionar firmemente o centro do explante, de modo que ele adira &agrave; lam&iacute;nula de vidro na base do recipiente de cultura. Ap&oacute;s semear todos os X explantes em um recipiente de cultura, transfira para uma incubadora a 37 graus Celsius.Explantes retinianos X exibem crescimento abundante de axônios após 24 horas e podem ser utilizados para inúmeros ensaios in vitro, sendo então fixados com PFA 4% por 30 minutos. E imunomarcados para o ensaio de borda. Transfira o explante positivo para FP 4G para uma placa que tenha sido preparada para o ensaio de borda.Organize os explantes X em uma linha reta que se aproxime da borda fluorescente com seu substrato de interesse. Sob um microscópio estereoscópico fluorescente, use pinças para semear os EXPLAN de modo que fiquem a cerca de 50 a 150 micrômetros da borda fluorescente. Alterne entre os dois canais fluorescentes para visualizar o explante verde e a borda vermelha.A seguir, incubar as placas a 37 graus Celsius por 24 horas, permitindo tempo suficiente para que os axônios das CRR alcancem o substrato de borda. X explan pode então ser fixado em PFA 4% por 30 minutos, seguido de imunomarcação. Após a eletroporação retiniana in utero.Pode-se preparar montagens de retina com orifícios para visualizar RGCs positivas para GFP na retina e no sistema visual parcialmente intacto. Os sistemas visuais podem ser preparados para visualizar axônios positivos para GFP ao longo do nervo óptico, quiasma óptico e trato óptico. Alternativamente, podem ser realizados cortes criostáticos frontais através da retina e da via das RGCs para visualizar e analisar corpos celulares de RGCs positivos para GFP na retina, bem como axônios no nervo óptico, quiasma e trato.Todos os axônios retinianos são visualizados com coloração para neurofilamentos. Além disso, a eletroporação in utero pode ser utilizada para estudar o direcionamento dos axônios das CRR no núcleo geniculado lateral (LGN), coletando filhotes entre P4 e P10. Em P8, axônios positivos para GFP são visíveis no LGN, com CTB LOR 5 94 no canal vermelho injetado na retina ipsilateral e CT bor 6 47 no canal azul injetado na retina contralateral, para rotular toda a projeção das CRR após eletroporação ex vivo e placa de implantes retinianos.Um subconjunto de axônios de CGR positivos para RGFP pode ser claramente visualizado tanto em aumento menor quanto maior, conforme visto nas imagens superior e inferior, respectivamente. A resposta de axônios positivos para GFP pode ser analisada cultivando XS adjacentes às bordas de vários substratos mostrados aqui em azul. Acabamos de mostrar como introduzir genes na retina em desenvolvimento de embriões utilizando eletroporação retiniana in utero e ex vivo.Embora tenhamos concentrado nossa análise no direcionamento axonal do quiasma óptico, esta técnica poderia ser benéfica para aqueles que estudam a diferenciação das CRR, a morfologia dendrítica e as propriedades eletrofisiológicas das células ganglionares da retina. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de minimizar os danos à retina durante a injeção do DNA e manter sempre os embriões hidratados com PBS durante todo o experimento. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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