Fator-Revestido crescimento Placement Bead em explantes Encéfalo anterior Dorsal

Esses são o primeiro tipo de contas que usarei. São as contas de gel azul-gel. São macias.

Então, preciso usar uma pipeta de vidro agrupada na extremidade de uma pipeta bucal para colocar essas esferas sobre os Xs. O segundo tipo de esfera que demonstrarei são esferas de acrílico heparinizado. São um tipo rígido de esfera, e colocarei essas esferas sobre explantes X usando uma agulha de tungstênio. Essas são as tubos capilares de vidro que primeiro derretereis usando o bico de Bunsen.

Então eu puxo para criar uma ponta mais fina. Seguro o tubo capilar no centro da chama e o giro enquanto o tubo derrete. Consigo sentir quando ele amolece.

Vou retirá-lo da chama e depois puxá-lo. Vou fazer um entalhe ao longo do tubo capilar com esta caneta de ponta de diamante para obter um corte reto e limpo. Em seguida, vou polir as extremidades com chama para limpá-las.

Vou passar a capilar através da chama para polir a extremidade e reduzir a abertura, de modo que ela consiga capturar uma esfera em vez de a esfera atravessar a capilar. É importante observar que você não deve segurar o tubo capilar na chama por muito tempo. Na verdade, é uma passagem muito rápida, caso contrário, ele selará.

Normalmente faço vários desses, porque muitos acabam com a ponta selada pela chama. É difícil controlar, então basta fazer vários. Este é um exemplo de um em que a ponta foi selada.

Este é um exemplo de uma boa pipeta. Pipetei 250 microlitros dos grânulos de agel neste tubo einor e vou lavá-los cinco vezes com um mililitro de PBS para remover a solução de azi na qual estavam embebidos. Aguardarei cerca de três minutos para permitir que os grânulos sedimentem e, em seguida, aspirarei o excesso de PBS, repetindo este procedimento mais quatro vezes.

As esferas ainda não assentaram completamente, então vou aspirar o excesso de PBS e repetir este procedimento quatro vezes. E, ao final, vou adicionar 300 microlitros de PBS e começar a trabalhar com as esferas. Esta é uma pipeta oral padrão e vou simplesmente pegar o capilar que preparei e inseri-lo cerca de um terço do caminho para cima.

Primeiro, encha as pipetas com PBS. Normalmente, elas se preenchem apenas por ação capilar. Esta é a tampa de uma placa de cultura de 30 milímetros e coloquei uma gota de microesferas em azul.

E ao lado há uma pequena gota de PBS. E neste recipiente, há gotas de cinco microlitros de solução proteica. Neste caso, é B e P quatro, mas você pode usar uma proteína de sua escolha utilizando a pipeta bucal.

Vou transferir uma esfera deste círculo azul aqui, lavá-la uma vez na gota de PBS. Em seguida, pegarei a esfera com a pipeta bucal e a colocarei na gota de solução proteica, incubando-a à temperatura ambiente por cerca de uma hora ou a quatro graus por várias horas. Aqui você vê um grupo de esferas em PBS e preciso selecionar aquelas que têm o tamanho adequado.

Se forem muito pequenas, elas simplesmente passarão pela pipeta de boca. Precisam ficar posicionadas na extremidade. Agora você vê que escolhi algumas esferas ali, três esferas maiores e três esferas menores.

Vou usar as esferas maiores no experimento. Agora, vou transferir uma esfera grande da gota de PBS para a gota de solução proteica. Para isso, vou puxar suavemente a língua para longe da pipeta bucal.

Não é um movimento de sucção, mas apenas aplicar alguma pressão negativa. Em seguida, vou transferi-lo e, basicamente, colocar a língua de volta sobre a boca. Cabeça do tubo, sem soprar, mas apenas adicionando alguma pressão positiva para empurrar a batida para fora da extremidade.

Agora tenho cinco esferas na gota de solução proteica, e as incubarei a quatro graus por várias horas, ou alternativamente à temperatura ambiente por meia hora a uma hora. Esta é a placa de cultura que contém a membrana flutuando no meio, juntamente com as berinjelas que já dissecuei. Vou pegar a ponta da minha pipeta e aspirar um pouco do meio.

Vou enxaguar as microesferas em uma gota de meio apenas uma vez, imediatamente antes de colocar a microesfera sobre o X explicativo. Estas são as agulhas de tungstênio que usarei para pegar e posicionar as microesferas acrílicas. Esta é a agulha de tungstênio e agora está no seu suporte.

E estas são algumas pinças finas. A um ângulo de 45 graus. Vou usar minha agulha de tungstênio com as pinças para levantar uma esfera dessa poça de PBS e transferir a esfera para uma gota de solução proteica.

Como fiz com as microesferas de agelose. Assim como com as microesferas de agelose, lavei essas microesferas acrílicas cinco vezes em PBS e transfiro uma gota para esta placa. Em seguida, usarei minha agulha de tungstênio em pinça para transferir uma microesfera para uma gota de proteína e incubarei da mesma forma que fiz com as microesferas de gel.

Então, é levantar a esfera. Mantenho a mão direita firmemente apoiada na mesa e uso o indicador esquerdo para estabilizar a agulha enquanto a insiro no fluido. Toco levemente uma esfera com a agulha e a levanto lentamente para fora do fluido. Às vezes, ela cai da agulha; nesse caso, basta retornar e pegar outra.

Agora, com a minha mão esquerda, tenho a pinça em ângulo de 45 graus. Com as pontas para baixo, encosto a esfera e a agulha ao fluido e utilizo. Uso a ponta da pinça para pressionar suavemente e soltá-la.

Agora tenho cinco esferas com proteína. Ok, com a mão direita seguro a agulha de tungstênio na esfera, e com a mão esquerda seguro a pinça novamente com a ponta voltada para baixo, da mesma forma que as empurro para fora. As quatro, farei novamente aqui no x explan. Incubar a 37 graus e o tempo depende do ensaio específico.