Fator-Revestido crescimento Placement Bead em explantes Encéfalo anterior Dorsal

Então, esse é o primeiro tipo de miçangas que vou usar. São as contas de gel azul gel. Eles são macios.

Então, eu preciso usar uma pipeta de vidro agrupada no final de uma pipeta de boca para colocar essas contas em Xs.O segundo tipo de conta que vou demonstrar são as contas de heparina acrílica. Eles são um tipo de conta rígida, e vou colocar essas contas em explantes X usando uma agulha de tungstênio. Então, esses são os tubos capilares de vidro que vou derreter primeiro usando o bico de bunsen.

Então eu vou puxá-los para criar uma ponta mais fina. Então eu seguro o tubo capilar no meio da chama e rolo enquanto o tubo derrete. Eu posso sentir isso ficar mole.

Vou tirá-lo da chama e depois puxá-lo. Vou gravar uma linha no tubo capilar com esta caneta com ponta de diamante para que eu possa ter um bom corte reto. Então vou polir as pontas para limpá-lo.

Vou passar o capilar pela chama para polir a ponta e diminuir a abertura para que ela possa capturar uma conta em vez de a conta passar pelo capilar. Uma coisa importante a notar é que você não quer manter o tubo capilar na chama por muito tempo. Na verdade, é uma passagem muito rápida, caso contrário, vai selar.

Eu costumo fazer vários deles porque muitos deles saem onde a ponta é selada pela chama. É difícil de controlar, então você apenas faz vários. Este é um exemplo de um em que a ponta foi selada.

Este é um exemplo de uma boa pipeta. Eu pipetei 250 microlitros das contas de agel neste tubo einor e vou lavá-las cinco vezes com um mililitro de PBS para remover a solução azi em que estavam de imersão. Vou esperar cerca de três minutos para deixar as contas assentarem e então aspirarei o excesso de PBS e repetirei isso mais quatro vezes.

As contas ainda não se estabilizaram, então as contas se assentaram e vou aspirar o excesso de PBS e repetir isso quatro vezes. E no final vou adicionar 300 microlitros do PBS e começar a trabalhar com as contas. Esta é uma pipeta de boca padrão e vou pegar o capilar que puxei e empurrá-lo para dentro cerca de um terço do caminho para cima.

Primeiro, encha as pipetas com PBS. Geralmente preenche apenas por uma ação capilar. Então, esta é uma tampa de um prato de cultura de 30 milímetros e eu coloquei uma gota de contas em azul.

E ao lado dele está uma pequena gota de PBS. E neste prato aqui está uma gota de cinco microlitros de solução de proteína. Nesse caso, é B e P quatro, mas você pode usar uma proteína de escolha usando a pipeta bucal.

Vou transferir uma conta deste círculo azul aqui, enxaguá-la uma vez na gota de PBS. Em seguida, pego o cordão com a pipeta bucal e coloco na gota de solução de proteína e incubo em temperatura ambiente por cerca de uma hora ou quatro graus por várias horas. Então, você vê um conjunto de contas na PBS e eu preciso selecionar contas do tamanho certo.

Se forem muito pequenos, eles simplesmente passarão pela pipeta bucal. Eles precisam apenas sentar no final. Então agora você vê que eu escolhi algumas contas lá, três contas maiores e três contas menores.

Vou usar as contas maiores no experimento. Vou agora transferir uma grande gota da gota de PBS para a gota de solução de proteína. E para fazer isso, vou puxar suavemente minha língua para longe da pipeta da boca.

Não é um movimento de sucção de sucção, mas apenas para aplicar alguma pressão negativa. E então eu vou transferi-lo e, basicamente, colocar minha língua de volta sobre a boca. Cabeça do tubo, não soprando, mas apenas adicionando um pouco de pressão positiva para empurrar a batida para fora do final.

Agora tenho cinco grânulos na gotícula da solução de proteína e vou incubá-los a quatro graus por várias horas ou, alternativamente, em temperatura ambiente por meia hora a uma hora. Portanto, este é o prato de cultura que contém a membrana que está flutuando no meio junto com as berinjelas que eu já dissequei. Vou pegar a ponta da minha pipeta e sugar um pouco da mídia.

Vou enxaguar as contas em uma gota de mídia apenas uma vez imediatamente antes de colocar a conta na explicação X. Estas são as agulhas de tungstênio que usarei para pegar e colocar as contas de acrílico. Esta é a agulha de tungstênio e está em seu suporte agora.

E estes são alguns fórceps finos. Em um ângulo de 45 graus. Vou usar minha agulha de tungstênio em uma pinça para levantar uma conta dessa poça de PBS e transferir a conta para uma gota de solução de proteína.

Como fiz com as contas de agel. Como com as contas de agel, enxaguei essas contas de acrílico cinco vezes em PBS e transferi uma gota para este prato. Vou então usar minha agulha de tungstênio em fórceps para transferir uma conta para uma gota de proteína e incubar assim como fiz com as contas de gel.

Então, é um elevador do cordão. Eu tenho minha mão direita firmemente contra a mesa, e eu uso meu dedo indicador esquerdo para firmar a agulha enquanto eu desço no fluido, eu toco levemente uma conta com uma agulha e a levanto lentamente para fora do fluido. Às vezes, ele cai da agulha, então volte para pegar outra.

Agora, com minha mão esquerda, tenho a pinça de ângulo de 45 graus. Com as pontas para baixo, toco a conta e a agulha no fluido e uso. Use a ponta da pinça para pressioná-la suavemente.

Então agora eu tenho cinco contas de proteína. Ok, então com minha mão direita eu tenho a agulha de tungstênio na conta, e minha mão esquerda, minha pinça novamente com a ponta para baixo da mesma forma que eu empurrá-los para fora Os quatro, eu vou fazer isso de novo aqui no x explan. Incubar a 37 graus e o tempo depende do ensaio específico.