Name: Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a realizar gravações eletrofisiológicas em embriões de Drosophila para estudar propriedades elétricas de músculos e neurônios em desenvolvimento. Este método permite caracterizar a sinaptogênese funcional em junções neuromusculares glutamatérgicas e sinapses colinérgicas e GABAérgicas centrais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KB é suportado pelo NIH conceder GM54544.

Os autores não têm nada a declarar.

Eletrofisiológicas gravação a partir de embriões Drosophila requer manipulação manual e dissecção. A saúde da preparação e conseqüente qualidade das gravações, depende de um ser capaz de rapidamente e ordenadamente preparar os tecidos frágeis embrionárias para gravação, e depois executar o experimento. Experimentadores devem ser proficientes em ambas as dissecções embrionárias e eletrofisiologia patch clamp antes de tentar resolver ao mesmo tempo. As gravações podem ser feitas em um...

gravação eletrofisiológicas na drosophila embrião

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila é um modelo premier genética para o estudo de ambos o desenvolvimento embrionário e neurociência funcional. Tradicionalmente, esses campos são muito afastadas umas das outras, com histórias em grande parte independentes e comunidades científicas. No entanto, a interface entre esses campos normalmente díspares são os programas de desenvolvimento subjacente aquisição de propriedades funcionais elétricos de sinalização e diferenciação das sinapses químicas funcionais durante as fases finais da formação de circuitos neurais. Esta interface é uma área extremamente importante para a investigação. Em Drosophila, estas fases de desenvolvimento funcional ocorrem durante um período de &lt;8 horas (a 25 ° C) durante o último terço da embriogênese. Este período final de desenvolvimento foi considerado por muito tempo intratáveis ​​devido a investigação para a deposição de um resistente, impermeável cutícula epidérmica. Um avanço de avanço foi a aplicação de cola de água polimerização cirúrgica que pode ser aplicado localmente para a cutícula para que a dissecção controlada de embriões em estágio avançado. Com uma incisão dorsal longitudinal, o embrião pode ser deitadas, expondo o cordão nervoso ventral e musculatura da parede do corpo à investigação experimental. Whole-cell patch-clamp técnicas podem então ser empregadas para gravar a partir de neurônios individualmente identificáveis ​​e músculos somáticos. Estas configurações de gravação ter sido usado para rastrear o surgimento e amadurecimento de correntes iónicas e propagação do potencial de ação em ambos os neurônios e músculos. Mutantes genéticos que afetam estas propriedades elétricas foram caracterizados para revelar a composição molecular de canais iônicos e associados complexos de sinalização, e para começar a exploração dos mecanismos moleculares de diferenciação funcional. Uma atenção especial tem sido a montagem de conexões sinápticas, tanto no sistema nervoso central e periferia. O glutamatérgica junção neuromuscular (MNJ) é mais acessível a uma combinação de imagens ópticas e de gravação eletrofisiológico. Um eletrodo de sucção de vidro é usado para estimular o nervo periférico, junção com excitatórios atual (EJC) gravações feitas na tensão muscular preso. Esta configuração de gravação tem sido usado para traçar a diferenciação funcional da sinapse, e acompanhar o surgimento e amadurecimento de propriedades de liberação pré-sináptica de glutamato. Além disso, as propriedades de pós-sinápticos podem ser analisadas de forma independente por meio de iontoforese ou aplicação de pressão de glutamato diretamente na superfície do músculo, para medir o aparecimento e maturação dos campos receptores de glutamato. Assim, ambos os elementos pré e pós-sinápticos podem ser monitorados separadamente ou em combinação durante a sinaptogênese embrionárias. Este sistema tem sido fortemente usada para isolar e caracterizar mutantes genéticos que impedem a formação da sinapse embrionárias e, assim, revelar os mecanismos moleculares que regem a especificação e diferenciação das conexões sinápticas funcionais sinapse e propriedades de sinalização.

Gravações eletrofisiológicas da<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões permitem análises de músculo em desenvolvimento e as propriedades elétricas do neurônio, bem como caracterização de sinaptogênese funcionais da junção neuromuscular e glutamatérgica colinérgica central e sinapses GABAérgica.

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

A Drosophila é um modelo genético primordial para o estudo tanto do desenvolvimento embrionário quanto da neurociência funcional. Tradicionalmente, esses campos são bastante ...

Registros eletrofisiológicos de músculos e neurônios motores podem ser obtidos a partir da parede corporal de um embrião de oph adequadamente preparado. Os músculos 6, 7, 12 ou 13 podem ser facilmente registrados na configuração de gravação de célula inteira, e correntes de amplitude miniatura robustas podem ser medidas após a obtenção de um selo gigaohm para registrar da junção neuromuscular. Um eletrodo de sucção pode ser usado para aspirar um nervo motor próximo ao ponto de saída do SNC e fornecer estimulação pré-sináptica enquanto as correntes de célula inteira são medidas no músculo pós-sináptico.Alternativamente, uma pipeta pode ser usada para liberar neurotransmissores excitatórios próximo ao eletrodo de registro por iontoforese ou ejeção por pressão. Olá, eu sou Ton do Laboratório do Dave do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Illinois em Chicago. Hoje eu vou mostrar a vocês a gravação eletrofisiológica da junção neuromuscular de embriões em estágio de saliente e de neurônios centrais.Estes procedimentos estão sendo usados para estudar a função e o desenvolvimento do sistema neuromuscular de joof. Essas técnicas foram originalmente desenvolvidas por Kendall Brody, repassadas a David Fit Stone e, posteriormente, a mim; hoje, eu as repasso a vocês.Este procedimento exige que os embriões sejam corretamente colhidos e dissecados previamente. Para ver como isso é realizado, consulte a publicação acompanhante da JoVE por Brody Featherstone e Chen. As gravações eletrofisiológicas de músculos e neurônios embrionários de Jossa utilizam técnicas padrão de grampo de patch em célula inteira. Primeiro, o embrião dissecado é colocado em uma pequena câmara de gravação de plexiglass.A área de gravação fisiológica é eletricamente amortecida por uma gaiola de Faraday e instalada sobre uma mesa amortecida contra vibrações. A câmara é observada em luz transmitida utilizando um microscópio composto ereto com óptica KY e uma objetiva de imersão em água com distância de trabalho longa de 40 x. As gravações objetivas são tipicamente realizadas abaixo da temperatura ambiente, pois torna-se cada vez mais difícil realizar o patch clamp em músculos oculomotores à medida que a temperatura aumenta.O eletrodo de gravação deve ter uma resistência final entre cinco e 10 megaohms e ser polido a calor até um diâmetro interno de cerca de um micrômetro. Na ponta, os eletrodos de gravação são preenchidos retrogradamente com uma solução fisiológica contendo cloreto de potássio e sacarose. Um fio de terra de cloreto de prata é colocado no banho contendo salina padrão, que também é utilizada na dissecação de embriões.Os sinais são amplificados usando um amplificador de patch clamp, filtrados e armazenados digitalmente para análise posterior. Qualquer sistema adequado para experimentos de patch clamp pode ser utilizado, como este equipamento e software da axon. Instruments células de três tecidos diferentes no sistema nervoso embrionário agora podem ser estimuladas e registradas a partir dos músculos, neurônios na junção neuromuscular e neurônios motores centrais.Com esta preparação de embrião, pode-se registrar qualquer músculo embrionário na maioria dos experimentos. Concentre-se no grupo de quatro músculos longitudinais ventrais 6, 7, 12 e 13, particularmente no músculo 6 no abdômen anterior, de A2 a A3, para registrar os músculos dorsais. O embrião deve ser colado com o lado dorsal para baixo e dissecado ao longo da linha média ventral em embriões jovens.Nenhum tratamento enzimático é necessário antes da gravação muscular. No entanto, em embriões mais desenvolvidos com cutículas formadas, uma bainha muscular também se desenvolve antes da gravação por patch. Essa bainha deve ser removida por meio de imersão breve em colagenase.A maioria das gravações é realizada na configuração de gravação em célula inteira, obtida facilmente a partir do estado de célula ligada com leve sucção ou um impulso elétrico. Isso é um choque. É uma estimulação elétrica, você sabe, para romper a membrana celular.Um selo em célula inteira apresenta resistências no músculo tipicamente superiores a um gigaohm; correntes em célula inteira geralmente são obtidas em menos de três minutos após a formação do selo. A resistência é acentuadamente aumentada na maioria dos casos, e as células podem desenvolver um aumento na vazão. Para gravação por fixação de patch, os embriões devem ter pelo menos 14 horas de idade, já que em estágios de desenvolvimento mais precoces isso não é viável.O acoplamento elétrico extenso entre os miotubos tornará a fixação de voltagem imprecisa para gravações com microeletrodo de fibra muscular. Os potenciais de retenção típicos variam de menos 60 a menos 80 milivolts, e podem ser utilizados métodos de fixação de voltagem e fixação de corrente. Gravações bem-sucedidas de célula inteira em menos 60 milivolts são acompanhadas por correntes sinápticas espontâneas robustas que variam de algumas a várias centenas de picoampères, como as mostradas aqui.Grandes correntes da junção neuromuscular podem ser evocadas estimulando o nervo motor com eletrodos de sucção. Estes podem ser puxados a partir de uma variedade de eletrodos de vidro preenchidos com fibras e devem ser polidos com chama para alcançar a configuração desejada, utilizando sucção suave no puxador da pipeta para introduzir um pequeno segmento do segmento motor apropriado próximo ao ponto de saída do SNC. Para formar um selo apertado, uma estimulação breve funciona melhor com uma intensidade determinada experimentalmente, geralmente entre um e cinco volts. A estimulação confiável é obtida ajustando a intensidade do estímulo um a dois volts acima do limiar determinado experimentalmente.Os receptores de glutamato na junção neuromuscular pós-sináptica podem ser ativados pela aplicação do neurotransmissor glutamato; moléculas carregadas como o glutamato podem ser entregues à junção neuromuscular utilizando iontoforese. Pipetas de alta resistência são usadas para mapear os receptores, e pipetas de menor resistência são usadas para estimar a resposta total dos receptores de glutamato. As pipetas iontoforéticas são carregadas com uma solução de L-glutamato 100 milimolar.Para liberar o glutamato L, utilize um pulso curto de corrente negativa com uma pequena corrente positiva de apoio para prevenir vazamentos; o glutamato ou qualquer molécula não carregada também pode ser administrado à junção neuromuscular por meio de ejeção por pressão. Para a ejeção por pressão, use glutamato de um a dois milimolares e aplique uma força para fora de cinco a 10 PSI à pipeta, utilizando um pico spritzer.A corrente da junção neuromuscular evocada pela estimulação nervosa ou pela aplicação de glutamato em menos 60 milivolts é tipicamente de 1500 a 2000 picoampères. Muitos neurônios embrionários podem ser identificados individualmente com base na posição do corpo celular e na morfologia da projeção. A maioria das gravações experimentais concentrou-se em um grupo de cinco neurônios dorsais superficiais dentro do cordão nervoso ventral embrionário.Para realizar a gravação desses neurônios, a bainha do neuroma do cordão nervoso ventral deve ser removida com um breve tratamento focal com protease; os corpos celulares são dessheathados mediante a aplicação de 0,5 a 1% de protease no meio de gravação, utilizando um pipeta de patch de grande diâmetro para sugar o material da bainha para dentro da pipeta contendo a protease. Pode-se usar uma ação suave com a boca para mover repetidamente a bainha para dentro e para fora da pipeta. Após um a dois minutos, a bainha se romperá.As células estão agora expostas para o clamp de célula inteira. Este paradigma de gravação não exige que o salino seja circulado ou aquecido. O salino externo de gravação nesta preparação é diferente do utilizado na gravação de músculos.O eletrodo de grampo pode ser carregado com amarelo de Lucifer para posteriormente visualizar a posição e a morfologia da célula em grampo. Aqui está um neurônio motor central que incorporou o amarelo de Lucifer e foi visualizado por microscopia de fluorescência. Registros em configuração de grampo de tensão em célula inteira são realizados em potenciais de retenção de menos 60 milivolts a 18 graus Celsius.Registros em clamping de corrente também são possíveis. Os neurônios podem ser estimulados com os neurotransmissores acetilcolina ou GABA. Eles são aplicados no corpo celular por iontoforese ou ejeção por pressão, da mesma forma que ao realizar gravações de njs.Uma vez estabelecida uma conexão em célula inteira, são observadas primeiramente correntes espontâneas. Este é um minuto de dados brutos obtidos do músculo longitudinal ventral embrionário seis, submetido a grampo de membrana em menos 60 milivolts na ausência de estimulação. Um preparo saudável normalmente exibe uma intensa atividade sináptica espontânea, representada aqui pelos muitos desvios de corrente para baixo.Aqui estão dados do mesmo músculo com estimulação aplicada usando uma pipeta de sucção no nervo motor que inerva esse músculo. Isso resultou em múltiplas deflexões descendentes da corrente, representando correntes junções evocadas ou EJCs. Este é o dado do mesmo músculo estimulado por glutamato de um milimolar aplicado por ejeção sob pressão.O glutamato abre receptores, levando a grandes deflexões descendentes. No traçado atual, duas curvas são mostradas, representando duas aplicações subsequentes de glutamato. Acabei de mostrar como realizar gravações eletrofisiológicas de embriões de geo soft em estágio tardio; gravações eletrofisiológicas são geralmente realizadas usando técnicas padrão de patch clamp, que não podemos descrever aqui em detalhes.Idealmente, qualquer pessoa que deseje realizar gravações a partir de seus embriões macios já terá aprendido a técnica de patch clamp utilizando uma preparação mais fácil. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

electrophysiological-recording-in-the-drosophila-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais usando a tecnologia de célula padrão todo. Inclui imagens de células GFP rotulados e neurônios visto durante a gravação.

Todo Recordings celular do cérebro de adultos Drosophila

Aqui nós descrevemos métodos eletrofisiológicos para medir a transmissão sináptica na junção neuromuscular de larva Drosophila. Liberação evocada é iniciado artificialmente estimulando os axônios do neurônio motor ea transmissão através do MNJ pode ser medida pela resposta pós-sináptica evocado no músculo.

Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Esta técnica expõe a Drosophila neuromusculature embrionárias para imuno-histoquímica ou gravação eletrofisiológico. É útil para o estudo de eventos no início do desenvolvimento neuromuscular ou a realização de eletrofisiologia em mutantes que não podem eclodir.

Colheita e Preparação Drosophila Os embriões para Gravação eletrofisiológicos e outros procedimentos

O Sistema de Fibra gigante é um circuito neuronal simples de...

As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster</em

Este vídeo descreve o protocolo para registro eletrofisiológico da atividade fotorreceptora no olho de uma Drosophila imobilizada, permitindo a medição precisa das mudanças de voltagem em resposta a estímulos luminosos.

Registro eletrofisiológico das respostas de voltagem de fotorreceptores retinianos de Drosophila a estímulos luminosos

O vídeo demonstra o registro extracelular da atividade neuronal do sistema nervoso central (SNC) de larvas de Drosophila. O SNC seccionado é posicionado em uma câmara de registro e a atividade elétrica de um nervo descendente é registrada para estabelecer a frequência de disparo da linha de base. Um agente de teste é então introduzido e a mudança na frequência de disparo é registrada para determinar o efeito excitatório ou inibitório do agente.

Registro extracelular da atividade elétrica no sistema nervoso central da drosófila

Este protocolo descreve gravação extracelular das respostas potenciais de ação disparados pelos neurônios do gosto labellar em Drosophila.

Eletrofisiológica Gravação De<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Prove sensilla

Os microeletrodos afiados permitem a caracterização eletrofisiológica precisa da saída de fotorreceptores e interneurônios visuais em Drosophila viva. Aqui, mostramos como usar esse método para registrar respostas de voltagem de alta qualidade de células individuais à estimulação de luz controlada. Este método é ideal para estudar o processamento de informações neurais em olhos compostos de insetos.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

As gravações de células inteiras dos fotorreceptores Drosophila melanogaster permitem a medição de solavancos escuros espontâneos, colisões quânticas, respostas macroscópicas à luz e relações tensão-tensão em várias condições. Em combinação com as ferramentas de manipulação genética de D. melanogaster , este método permite o estudo da via de sinalização inositol-lipídico ubíqua e seu alvo, o canal TRP.

Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Este protocolo descreve um método para registrar a atividade elétrica descendente do sistema nervoso central Drosophila melanogaster para permitir que o custo-eficiente e conveniente de teste de agentes farmacológicos, mutações genéticas das proteínas neurais, e/ou o papel das vias fisiológicas inexploradas.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

O objetivo deste protocolo é delinear o desenho e o desempenho de experimentos in vivo em Drosophila melanogaster para avaliar as conseqüências funcionais de variantes genéticas raras associadas a doenças humanas.

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Aprenda a realizar gravações eletrofisiológicas em embriões de Drosophila para estudar propriedades elétricas de músculos e neurônios em desenvolvimento. Este método permite caracterizar a sinaptogênese funcional em junções neuromusculares glutamatérgicas e sinapses colinérgicas e GABAérgicas centrais.

Gravação eletrofisiológicas na Drosophila Embrião

Explorar mais vídeos