Name: Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a colorir proteínas em géis de poliacrilamida com Coomassie G-250 sem solventes orgânicos ou ácido acético. Este método simplificado permite visualizar bandas proteicas em apenas um minuto.

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Gostaríamos de agradecer a assistência técnica da Ines Racke.

Parte 1: Preparação da solução de coloração CBB <ol><li> 60-80 mg de CBB G-250 são dissolvidos em 1 litro de água bidestilada pela agitação por 2-4 horas. Finalmente, 3 ml de HCl concentrado é adicionado à solução de azul escuro, com agitação por mais um minuto e armazenados no escuro para uso posterior. A solução pode ser armazenada por várias semanas até vários meses sem perder sua eficiência de coloração. </li><li> HCl concentrado deve ser tratado com o cuidado habitual und usada sob uma coifa. A solução final será em cerca de pH 2, por isso as luvas devem ser utilizadas e qualquer contacto com a pele devem ser evitados. </li></ol> Parte 2: SDS-PAGE <ol><li> Alíquotas adequadas de amostras de proteínas são misturadas com tampão de carregamento para uma concentração final de 1X tampão de carregamento. Nós usamos tampão de carregamento com 2x 125mm Tris/H3PO4 (pH 7,5 a 25 ° C), 2mM EDTA, SDS 4%, DTT 200mM, 0,02% azul de bromofenol e glicerol 50%. Buffers carregar outro para SDS-PAGE pode ser usado também. </li><li> Amostras de proteínas são aquecidas por cerca de 5 min antes do carregamento. Enquanto isso, a câmara de eletroforese em gel é preparado para a corrida. Usamos precast NuPAGE 4-12% © Bis-Tris géis (Invitrogen) em um SureLock XCell ® Mini-Cell (Invitrogen) com tampão MES-como o tampão de corrida, mas qualquer outro gel e um sistema de eletroforese pode ser usado também. </li><li> Amostras de proteínas são carregadas no gel e eletroforese de funcionar por 50 min em 220V. </li></ol> Parte 3: A coloração do gel <ol><li> A cassete de gel é desmontado eo gel colocado em uma caixa para as etapas subseqüentes de lavar roupa. </li><li> Cerca de 100 ml de água bidestilada é adicionado ao gel e aquecidos no forno de microondas por 30 segundos. Aquecimento deve ser interrompido antes da ebulição ocorre. A caixa com o gel é então colocada em um agitador por 3-5 min. e esta etapa de lavagem é repetida duas vezes com água fresca. </li><li> Solução de coloração bastante da CBB é adicionado para cobrir o gel na caixa ea caixa aquecida no microondas por 10 segundos. sem ferver. A caixa com o gel é então colocada em um agitador para o acabamento da coloração. Já depois de 1 minuto, as bandas de proteína pode ser observado, após 15-30 min. a coloração é forte o suficiente na maioria dos casos. </li><li> A solução de coloração é decantado e 50-100 ml de água bidestilada é adicionado a fim de prosseguir destain a luz de fundo azul do gel em uma coqueteleira. A água pode ser substituída por água fresca para mais de descoloração, se necessário. </li><li> O gel pode ser digitalizado, fotografado ou secas para armazenamento de longo prazo </li></ol> Parte 4: Resultados Representante: Ver fig. 1 para um gel corado adequadamente seguindo o procedimento descrito. Ver fig. 2 para um gel que não tenha sido lavado o suficiente antes de coloração e SDS residual inibe coloração eficiente. Note-se que as faixas do marcador (*) contêm a mesma quantidade de proteínas marcadoras. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="" /> Fig. 1: Representante manchada gel após colocar as amostras de uma purificação de proteínas (*: marcador de peso molecular). <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="" /> Fig. 2: CBB gel corado que não tenha sido lavado o suficiente antes de manchar CBB. As bandas de proteínas parecem mais fracos (note que o * lane marcador contém a mesma quantidade de proteína como na Fig. 1.).

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses. O procedimento descrito acima foi publicado originalmente em um pedido de patente pela EM Wondrak (ver ref.).

<ul><li> Os passos de lavagem são críticos para a coloração eficiente das proteínas. Um menor tempo de lavagem com menos de 2 min ou volume reduzido de água (&lt;50ml) pode resultar em pálida bandas de proteína azul, provavelmente devido a maior quantidade de SDS residuais no gel. </li><li> Se as proteínas vão ser analisados ​​por espectrometria de massa, os passos de aquecimento no forno de microondas deve ser ignorada, o tempo para a lavagem do gel estendido para cerca de 10 min em cada etapa eo tempo de coloração prorrogado até a intensidade...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>pode-se usar igualmente qualquer outro CBB G-250</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico concentrado</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

coloração de proteínas em géis com coomassie g-250 sem ácido acético e solventes orgânicos

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Em protocolos de proteína clássica coloração com Coomassie Brilliant Blue (CBB), soluções com alto teor de substâncias tóxicas e inflamáveis ​​solventes orgânicos (metanol, etanol ou 2-Propanol) e ácido acético são usados ​​para fixação, coloração e descoloração de proteínas em um gel após SDS -PAGE. Para acelerar o procedimento, o aquecimento da solução corante no forno de microondas por um tempo curto é freqüentemente usada. Isso geralmente resulta em evaporação do metanol tóxicos ou perigosos, etanol ou 2-Propanol e um forte cheiro de ácido acético no laboratório, que deve ser evitado devido a considerações de segurança. Em um protocolo publicado originalmente em dois pedidos de patente por EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), uma composição alternativa de solução de coloração é descrito em que nenhum solvente orgânico ou ácido é usado. A CBB é dissolvido em água bidestilada (60-80mg de CBB G-250 por litro) e 35 mM HCl é adicionado como o único composto outras na solução corante. A CBB staning do gel é feito após a lavagem SDS-PAGE e completa do gel em água bidestilada. Pelo aquecimento do gel durante a lavagem e coloração etapas, o processo pode ser concluído mais rapidamente e não compunds tóxicos ou perigosos são evaporando. A coloração das proteínas ocorre já dentro de 1 minuto após o aquecimento do gel na coloração da solução e está totalmente desenvolvido após 15-30 min com um fundo levemente azul que é totalmente descorados por lavagem prolongada do gel corado em água bidestilada, sem afetar as proteínas coradas bandas.

Um protocolo curto para a coloração de proteínas com Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 em gel de poliacrilamida é descrito sem o uso de solventes orgânicos ou em ácido acético como nos procedimentos de coloração clássica com CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

Em protocolos clássicos de coloração de proteínas utilizando Coomassie Brilliant Blue (CBB), soluções com altos teores de solventes orgânicos tóxicos e inflamáveis ...

Para iniciar este procedimento, o Azul Brilhante Kumasi ou CBG dois 50 é dissolvido em um litro de água bidestilada sob agitação por duas a quatro horas. Ácido clorídrico é posteriormente adicionado à solução azul-escura com agitação por mais um minuto, e a solução é armazenada no escuro para uso posterior. Após a preparação da amostra proteica e a eletroforese em gel de STS, a cassete do gel é desmontada e o gel é colocado em uma caixa para três etapas subsequentes de lavagem com água bidestilada.Após a terceira etapa de lavagem, a água é substituída por uma quantidade suficiente de solução corante CBB para cobrir o gel na caixa. A caixa é aquecida no micro-ondas por 10 segundos, e em seguida é colocada sobre um agitador. Para conclusão da coloração, as bandas proteicas podem ser observadas após um minuto.Olá, sou Amri Lawrence da unidade de expressão e purificação de proteínas da Emberin Heidelberg. Hoje vamos mostrar um protocolo para coloração de proteínas com azul brilhante de Coomassie G-250 em géis de cloreto. Diferentemente dos métodos clássicos de coloração, nosso protocolo não utiliza solventes orgânicos nem ácido acético.Utilizamos este protocolo para analisar nossas pro

staining-proteins-gels-with-coomassie-g-250-without-organic-solvent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Após a separação por métodos eletroforéticos, proteínas em um gel pode ser detectado por vários métodos de coloração. Coloração de proteínas com Coomassie Blue, coloração pela prata, Orange SYPRO, Ruby SYPRO são demonstradas neste vídeo.

Coloração Proteínas em Gel

Este vídeo é popularizar uma coloidal Coomassie G-250 protocolo de coloração de acordo com...

Rápido e sensível Colloidal Coomassie G-250 coloração para proteínas em gel de poliacrilamida

Usando glicosidases específicas para remover a partir de açúcares glicoproteínas seguido por SDS-PAGE é um método valioso para detectar modificações glicano em amostras de proteína e é uma boa escolha para estudos glycobiology inicial. Seguintes alterações deglycosylation podem ser detectados como mudanças na mobilidade gel ou através da coloração com glicano reagentes sensíveis.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para coloração combinada de azul de Alcian e prata de fragmentos de oligossacarídeos de glicosaminoglicanos sulfatados. Esta técnica de coloração combinada amplifica significativamente as bandas de polímeros de glicosaminoglicanos de diferentes comprimentos em géis de poliacrilamida.

Coloração de prata de glicosaminoglicanos sulfatados: um método de coloração para visualização de glicosaminoglicanos sulfatados em géis de poliacrilamida

A fim de explorar de forma abrangente a diversidade de glicanos ligados a O, um novo procedimento para eliminação de β redutora em gel, combinado com permetilação e um método de partição rápida de fase, é aplicado à análise de glicanos ligados a O diretamente liberados de glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE e passíveis de análise glicômica subsequente por espectrometria de massa.

Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa

Aqui, apresentamos uma eletroforese em gel bidimensional (2DE) acoplada com espectrometria de massa (MS) para separar e identificar adenoma de hipófise humana tecido proteome, que apresenta um padrão de 2DE bom e reprodutíveis. Muitas proteínas são observadas em cada ponto de 2DE quando analisando proteome complexo de câncer com o uso de MS de alta sensibilidade.

Eletroforese em Gel bidimensional juntamente com métodos de espectrometria de massa para uma análise do proteoma de tecido humano Adenoma de hipófise

A arquitetura de complexos de proteínas é essencial para a sua função. Combinar várias técnicas de espectrometria de massa provou poderosa para estudar seu assembly. Nós fornecemos protocolos para cross-linking química e espectrometria de massa nativa e mostrar como essas técnicas complementares ajudam a elucidar a arquitetura de assemblies multi o subunit da proteína.

Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado descrevendo uma fluorescente nova técnica para detecção de proteínas totais em gel de poliacrilamida de coloração. O protocolo utiliza uma sonda de excitante prata íon-específicos de fluorescência, que detecta Ag+-complexos de proteínas e elimina determinadas limitações de manchas de prata cromogênica tradicionais.

Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida

Este protocolo centra-se na identificação de proteínas que se ligam a fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Ele usa a cromatografia de afinidade com fosfatos de inositol biotinylated ou fosfoinositídeos que são imobilizados via estreptavidina para agarose ou grânulos magnéticos. Fosfato de inositol ou proteínas de ligação Fosfoinositídeo são identificados por western blotting ou espectrometria de massa.

Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

Este protocolo descreve a extração e visualização de proteínas agregadas e solúveis de Escherichia coli após o tratamento com um antimicrobiano proteotóxico. Após este procedimento permite uma comparação qualitativa da formação de agregado de proteínas in vivo em diferentes cepas bacterianas e/ou entre os tratamentos.

Extração e Visualização de Agregados proteicos após tratamento de Escherichia coli com um Estressor Proteotóxico

Este protocolo descreve uma técnica para a análise de supercomplexos respiratórios quando apenas pequenas quantidades de amostras estão disponíveis.

Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células 

Aprenda a colorir proteínas em géis de poliacrilamida com Coomassie G-250 sem solventes orgânicos ou ácido acético. Este método simplificado permite visualizar bandas proteicas em apenas um minuto.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

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