Name: Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Aprenda a extrair DNA genômico de alta qualidade de amostras marinhas usando filtros Sterivex e purificação por gradiente de cloreto de césio. Este método é essencial para estudos de ecologia microbiana ambiental.

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Gostaríamos de agradecer à Fundação Canadense para Inovação, a British Columbia Fundo de Desenvolvimento do Conhecimento e das Ciências e Pesquisa de Engenharia National Council (NSERC) do Canadá para apoiar estudos em andamento em regiões de baixo oxigênio das águas oceânicas costeiras e aberto. JJW foi apoiado por bolsas de NSERC e DAW foi apoiado por bolsas de NSERC, Killam ea fundação TULA Centro financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution. SL foi apoiado pelo Centro de fundação TULA financiado pela Diversidade Microbiana e Evolution.

Nota: Todos os reagentes utilizados neste protocolo são extraídos das existências de laboratório em pequenos stocks de trabalho-isto é muito importante para evitar a contaminação cruzada de amostras de seu DNA e contaminação dos estoques de laboratório. Além disso, quando pipetagem, certifique-se de trocar a ponteira para cada adição para evitar a contaminação cruzada. Part One: Lise Celular e Digestão <ol><li> Comece este protocolo por descongelamento dos filtros Sterivex que contêm biomassa planctônica anteriormente concentrada no gelo. Para simplificar, aqui descrevemos o procedimento para o processamento de um filtro individual. Na prática, recomenda-se o processamento de 16 ou menos filtros de cada vez. </li><li> Uma vez que o filtro tem descongelado, começar a primeira de duas incubações: uma para lisar as células e remover RNA, e um para quebrar proteínas. Para a primeira incubação, adicionar 100 mL de lisozima (125 mg em 1000 TE mL) e 20 ml de RNase A (10 mcg / ml) para o filtro. Feche o filtro com Parafilm e deixá-lo para rodar no forno de hibridação a 37 ° C por 1 hora. </li><li> Para a incubação seguinte, adicionar 100 mL proteinase K e 100 l SDS 20% para o filtro. Reseal usando Parafilm e deixá-lo para rodar 1-2 horas a mais no forno de hibridização, desta vez a 55 ° C. </li><li> Usando uma seringa 5cc, transferir o lisado do filtro Sterivex em um tubo Falcon 15 ml. Lavar o filtro com um tampão de lise ml e adicionar o líquido para o enxágüe lisado em seu tubo Falcon utilizando a seringa 5cc. Agora que você tem lisadas e digerido suas células, você está pronto para extrair seu DNA. </li></ol> Parte II: Extração de DNA <ol><li> O próximo passo é usar o método fenol-clorofórmio para extrair o DNA de seu lisado. Adicionar um volume igual (cerca de 3 ml) de Fenol: Clorofórmio: álcool isoamílico (IAA) ao tubo lisado, certificando-se de trocar a ponteira para cada adição para evitar a contaminação cruzada. Vortex por 10 segundos para misturar bem. </li><li> Girar o tubo a 2500 g por 5 minutos, certificando-se a centrífuga é equilibrado. Durante a centrifugação, a mistura de fenol-clorofórmio-lisado deve separar em duas camadas: uma camada orgânica contendo o clorofórmio, fenol e proteínas a partir de sua amostra, no fundo, e uma camada aquosa, que consiste em seu DNA, água e outros moléculas mais hidrofílica, em cima. </li><li> Transferir a camada aquosa (contendo o DNA) em um tubo de 15 ml nova Falcon. Tenha cuidado para não tocar a interface com a ponta da pipeta (sempre deixar uma pequena quantidade da camada aquosa para trás). </li><li> Para este novo tubo, adicionar igual volume (cerca de 3 mL) de clorofórmio: IAA, certificando-se de trocar a ponteira para cada adição para evitar a contaminação cruzada. Vortex por 10 segundos. Este passo ajuda a remover qualquer fenol remanescentes de sua amostra de DNA. </li><li> Giram a 2.500 g por 5 minutos ou até que fase aquosa é clara. Transferência de fase aquosa para um novo tubo Falcon rotulados e adicionar 1 ml de TE em pH 8,0, tendo o cuidado para não tocar a interface com a ponta da pipeta (sempre deixar uma pequena quantidade da camada aquosa para trás). Esta camada aquosa contém o extrato de DNA. </li></ol> Parte III: Concentração de DNA e lavar <ol><li> O próximo passo é lavar e concentrar a amostra de DNA em um Amicon 15 ml tubo de centrifugação Ultra. Os tubos Amicon consiste de um filtro que retém as moléculas igual ou superior a um peso molecular especificados (o retentado) e um tubo para travar o fluxo-through (o filtrado). Neste caso, o filtro retém o seu DNA (o retentado). Transferir o seu extrato de DNA a partir do passo 2.5 para o compartimento do filtro de um tubo Amicon Ultra. </li><li> Giram a 3.500 g por 10 minutos. Verifique se há menos de 1 ml de líquido retido no filtro Amicon. Se permanece mais retentado, encher o filtro com TE e girar novamente. Certifique-se usar uma ponteira nova para cada adição TE para evitar a contaminação cruzada. </li><li> Remova o fluxo-through, ou filtrado, para outro tubo Falcon e salve-o na geladeira até que você tenha confirmado seu produto final, DNA em um gel (Parte IV). </li><li> Adicionar 2 ml de tampão TE para o filtro Amicon e spin em 3500 g por 6 minutos, certificando-se de usar uma ponteira nova para cada adição TE para evitar a contaminação cruzada. Piscina filtrado com que a partir do passo 3.3 e guardar no frigorífico. </li><li> Lavar o DNA mais duas vezes com o TE para um total de três lavagens (certificando-se de usar sempre uma ponta de pipeta fresco), e salvar o filtrado de cada vez (como passos por 3.3 e 3.4). Para a última lavagem, girar até 200 a 500 ml de retentado permanece no filtro Amicon. Registre o volume final e transferir o retentado (que contém o DNA) a um tubo de 1,5 ml rotulados Eppendorf. </li></ol> Parte IV: Determinação da Qualidade DNA <ol><li> Verificar a qualidade do DNA e estimar a concentração do DNA por esgotar-se as amostras em um gel 0,8% agarose gel staINED com 1 ml brometo de etídio (EtBr) durante a noite. (Seja extremamente cauteloso ao usar EtBr-it é um agente mutagénico conhecidos e possivelmente cancerígeno. Certifique-se de trocar as luvas com frequência e evitar EtBr transferência para o resto do laboratório e para a sua pele.) Carregar as amostras ao lado de escadas de DNA, que servem como tamanho e intensidade de normas (ver passo seguinte). </li><li> Nas pistas do primeiro de vários, carregar escadas com bandas de vários pesos moleculares e as concentrações. Recomendamos o padrão de carregamento seguinte: nas pistas do primeiro e último (pistas ultraperiféricas), mL de carga 10 de 50ng/μl de 1kb + ou escada 2log. Em faixas 2,3 e 4, mL de carga 2, 5 mL, e 10 ml, respectivamente, de 50ng/μl escada λHindIII. Por último, coloque 5 mL por via do extrato de DNA com corante para cada amostra. </li><li> Executar o gel a 15 volts por aproximadamente 16 horas (é recomendável executar durante a noite). </li><li> No dia seguinte, a fotografia do gel usando um sistema de documentação UV gel. Para determinar a faixa de peso molecular de seu DNA e sua concentração, compare as bandas de exemplo para as bandas das escadas. DNA de boa qualidade vai ter alto peso molecular (&gt; 36kb), e mostram pouca evidência de corte / degradação. Veja a Figura 1. </li></ol> Parte V: A centrifugação de gradiente de cloreto de césio <ol><li> Se a qualidade do DNA é bom ea quantidade é suficiente, você pode prosseguir para purificar o DNA através da realização de um cloreto de césio (CsCl) centrifugação de gradiente. Observe que esta etapa de purificação é opcional e não é necessário para todas as aplicações a jusante (por exemplo, se você deseja gerar bibliotecas fosmid você DEVE purificar, ao passo que se você simplesmente deseja executar reações de PCR, purificação geralmente não é necessário). Primeiro, nomeie um tubo de centrifugação para cada amostra. </li><li> A cada tubo de centrífuga, adicionar 160 mg de CsCl, 178 mL de DNA genômico. Após a adição de CsCl e DNA para o tubo, coloque um pequeno pedaço de parafilme em cima do tubo e inverter cuidadosamente o tubo de 1-20 vezes para misturar os componentes. Não misture por pipetagem, que pode causar ruptura do DNA. Em seguida, adicione 10 ml de 10 mg / mL EtBr a este tubo e misturá-lo da mesma maneira. (Seja extremamente cauteloso ao usar EtBr-it é um agente mutagénico conhecidos e possivelmente cancerígeno. Certifique-se de trocar as luvas com frequência e evitar EtBr transferência para o resto do laboratório e para a sua pele.) </li><li> Certifique-se que o peso de todos os tubos são equilibradas antes da centrifugação de tal forma que as diferenças de peso entre os tubos são menos de 1 mg. </li><li> Coloque os tubos no rotor utilizando hemostat, feche a tampa e coloque o rotor dentro da ultracentrífuga. </li><li> Feche a porta ultracentrífuga. Vácuo será aplicado assim que você fechar a porta. Executar durante a noite a 100 mil rpm por 18 horas e 20 ° C. </li><li> Centrifugação, quando estiver completa, retirar os tubos do rotor utilizando hemostat e coloque em uma cremalheira do tubo. </li><li> Visualizar o DNA com transiluminador de luz azul, ou se não estiver disponível, usar a luz UV de comprimento de onda longa, em um quarto escuro. Usar um par de óculos de âmbar filtro para ver a banda DNA. Veja a Figura 2. </li><li> Usando uma seringa e agulha estéril 1cc (26G 08/05), remova banda DNA e colocá-lo em um tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Para ajudar a recuperar a maior parte do DNA preso no espaço morto da seringa, lavar a seringa com 100 mL de TE e adicionar a solução de lavado ao tubo. Prepare um tubo com 100 mL de buffer TE por amostra, a fim de evitar a contaminação cruzada. </li><li> Para remover EtBr do DNA, adicionar igual volume de água saturada de butanol ao tubo, inverter os tubos suavemente 1-20 vezes, centrifugar a 10000 rpm por 1 minuto e descartar a camada superior. </li><li> Repita a lavagem até a cor do butanol é transparente, 3-4 vezes mais. </li><li> Coloque 4 ml TE em um tubo de centrífuga Amicon Ultra e adicionar a solução de DNA a partir de cima. </li><li> Centrifugar a 3.500 g em temperatura ambiente, até que o volume de DNA é reduzida a cerca de 100-500 mL (aproximadamente 6-7 minutos) e descartar o escoamento. </li><li> Adicionar 2 ml de TE Amicon filtro e centrifugar a 3.500 g por 6 minutos, certificando-se de usar uma ponteira nova para cada adição para evitar a contaminação cruzada. Repita duas vezes. </li><li> Concentre-se para um volume final de 50-100 mL por centrifugação adicional quando necessário, e transferir a solução de DNA no filtro para um novo tubo de 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Adicionar 40 mL de TE o filtro Amicon e pipetar cima e para baixo ao longo de ambas as membranas de filtro para eliminar qualquer DNA restantes. Adicionar esta solução para o tubo no 5.15. </li><li> Coloque um microcontrolador YM-30 unidade de filtro para um tubo de microcontrolador e pré-lavagem do microcontrolador, adicionando 200 mL de água autoclavada e centrifugação a 10000 rpm por 7 minutos. </li><li> Adicionar a solução de DNA a partir de 5,16 para o microcontrolador pré-lavados, a fim de concentrar ainda mais o DNA. Centrifugar a 5000-10000 g por 1-3 minutos. Verificar a quantidade de líquidona centrifugação filtro e repetir até que a quantidade de líquido no filtro é reduzida a aproximadamente 50 ul. </li><li> Coloque a unidade de filtro de cabeça para baixo em um tubo novo microcontrolador e centrifugar a 1000 g por 3 minutos. A quantidade ideal de solução concentrada é de 50-60 mL. </li><li> Medir e registrar a concentração do DNA em um Nanodrop e verificar a qualidade de pico (deve ser 260nm). </li><li> Transferir uma alíquota pequena do DNA para um tubo eppendorf limpo para trabalhar ações e congelar a -20. Transferir o restante do DNA a um segundo eppendorf limpo e congelar a menos 80. </li></ol> Resultados representativos: Quando este protocolo é feito corretamente, você deve ver uma imagem de gel após a etapa 4.4 no Determinação da qualidade do DNA semelhante à Figura 1. Concentração de DNA real de extratos irá variar dependendo da fonte da amostra. Após o passo 5,7 em CsCl centrifugação de gradiente, DNA genômico iluminado por uma luz azul deve ser semelhante à Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. 0,8% agarose imagem eletroforese em gel de DNA de alto peso molecular coletadas de quatro profundidades no subarctic Oceano Pacífico (em duplicado), manchado com o agente intercalando brometo de etídio (10 mg / ml). Gel foi executado em 15V para ~ 16hrs em tampão 1X TBE gel em execução. Bandas da amostra são de boa qualidade mostrando pouca evidência de corte mecânico (mostra faixas ou manchas único em oposição a várias bandas), embora os extratos 10m reter alguns RNA transitar (ver esfregaço na faixa Kb 0,5-2,0). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Band DNA genômico iluminado por uma luz azul após centrifugação em gradiente de CsCl.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

Dependendo do número de amostras devem ser processadas, isso pode ser um procedimento demorada devido aos dois passos de incubação de uma hora, e as lavagens repetidas e passos de centrifugação. É melhor plano de dois dias inteiros para este procedimento para deixar bastante tempo. Se houver problemas para obter o volume extrato final no tubo Amicon para reduzir até 200 500μl durante a concentração de DNA e de lavar roupa, tentar fazer lavagens adicionais TE e centrifugações (repetir Parte III) até que o volume apropria...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>seringa de 1 cc (agulha 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 ml (agulha 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>tubos Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 5 cc</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos de filtração centrífuga Amicon&amp;#174; Ultra-4</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>limite nominal de peso molecular de 10.000</td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>Preparar saturado com água (butanol:água = 1:1)</td></tr><tr><td>Rotor de centrífuga, JA5.3</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga, Avanti&amp;#174; J-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de césio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio:IAA (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetraacético diidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Tampão de lise</td><td></td><td></td><td>sacarose 0,75 M, EDTA 40 mM, Tris 50 mM (pH 8,3)</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>125 mg em 1000 &amp;#x03BC;l de tampão TE</td></tr><tr><td>Unidade de filtração centrífuga Microcon&amp;#174; Ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>limite de corte de 50 pb</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Clorofórmio:IAA (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Protease K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul Safe Imager&amp;#8482;</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de sódio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>SDS a 20%</td></tr><tr><td>Filtros Sterivex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Tampão TE, pH 8,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma&amp;#174;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga (7X20 mm, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>Porta-tubos de ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga, Optima&amp;#174; Max</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

extração de dna de 0,22 mm sterivex filtros e césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Este método é usado para extrair o DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM Sterivex filtros que foram tratados com armazenamento / tampão de lise e arquivados a -80 ° C, e para purificar esse DNA usando um gradiente de densidade de césio cloreto. O protocolo começa com duas etapas de uma hora de incubação para liberar o DNA das células e remover RNA. Em seguida, uma série de Fenol: Clorofórmio Clorofórmio e extrações são realizadas seguida de centrifugação para remover proteínas e componentes da membrana celular, a coleta do extrato aquoso de DNA, e as etapas de vários buffer de troca para lavar e concentrar o extrato. Parte V descreve a purificação opcional através de gradiente de cloreto de césio densidade. Recomenda-se a trabalhar com menos de 15 amostras de uma só vez para evitar confusão e reduzir o tempo de protocolo. O tempo total necessário para este protocolo depende do número de amostras a serem extraídas. Por 10-15 amostras e assumindo o equipamento de centrifugação adequada estiver disponível, este protocolo inteiro deve levar três dias. Certifique-se que os fornos de hibridação definir a temperatura no início do processo.

Nós descrevemos um método para extração de DNA genômico de alto peso molecular a partir da biomassa planctônica concentrou-se em 0,22 mM filtros Sterivex, seguido por centrifugação em gradiente de cloreto de césio densidade para purificação.

Extração de DNA de 0,22 mM Sterivex Filtros e Césio cloreto de centrifugação em gradiente de densidade

Este método é utilizado para extrair DNA genômico de alto peso molecular de biomassa planctônica concentrada em filtros Sterivex de 0,22 μM que foram...

Olá, sou a Jody do laboratório de Steven Hallam, do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade da Colúmbia Britânica. Hoje vamos mostrar um procedimento para extrair DNA genômico, concentrado a partir de amostras de água do mar em filtros STX de 0,2 mícrons, e para purificar esse DNA por meio de centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para obter DNA ambiental, a fim de estudar a estrutura, diversidade e metabolismo das comunidades microbianas em ambientes marinhos.Então vamos começar. Inicie este protocolo descongelando no gelo o suporte de X filtros que você previamente concentrou com biomassa planctônica, tratou com tampão de lise e congelou para facilitar o processo. Aqui descrevemos o procedimento para processar um único filtro.Na prática, recomendamos processar 15 filtros ou menos por vez. Assim que o filtro descongelar, inicie a primeira de duas incubações: uma para lisar as células e remover o RNA e outra para degradar as proteínas.Para a primeira incubação, adicione 100 microlitros de lisozima e 20 microlitros de RNase A ao filtro. Selle novamente o filtro com parafina e deixe em rotação a 37 graus Celsius por uma hora. Para a próxima incubação, adicione 100 microlitros de proteinase K, 100 microlitros de SDS 20% ao filtro.Selle novamente o filtro usando perfil e deixe-o girar por mais uma a duas horas. Este tempo a 55 graus. Use uma seringa de cinco cc para transferir o lisado do filtro Stax para um tubo cônico de 15 mililitros.Lave o filtro com um mililitro de tampão de lise e adicione o líquido de lavagem ao lisado no seu tubo cônico. Agora que você lisou e digeriu suas células, está pronto para extrair seu DNA. O próximo passo é usar o método de fenol-clorofórmio para extrair o DNA do seu lisado.Adicione um volume igual de aproximadamente três mililitros de fenol clorofórmio, álcool isoamílico ao tubo de lisado e vortexie por 10 segundos para misturar bem. Em seguida, centrifugue o tubo a 2.500 ×g por cinco minutos. Durante a centrifugação, a mistura de lisado com fenol clorofórmio deve se separar em duas camadas.Uma camada orgânica na parte inferior contendo o fenol, clorofórmio e proteínas da sua amostra. E uma camada aquosa geralmente na parte superior, que consiste em seu DNA, água e outras moléculas mais hidrofílicas. Transfira a camada aquosa contendo seu DNA para um novo tubo Falcon de 15 mililitros. A este tubo, adicione um volume igual de uma mistura de clorofórmio e álcool isoamílico e vortex por 10 segundos.Esta etapa remove qualquer fenol remanescente da sua amostra de DNA. Centrifugue a 2.500 ×g por cinco minutos ou até que a camada aquosa fique clara. Transfira a camada aquosa para um novo tubo cônico rotulado e adicione um mililitro de TE em pH 8.Agora você tem o seu extrato de DNA. O próximo passo é lavar e concentrar a amostra de DNA em um tubo de ultracentrífuga Amazon de 15 mililitros. Transfira sua amostra de DNA para o compartimento do filtro de um non.O tubo ultrafiltro consiste em um filtro que retém moléculas com peso molecular igual ou superior a um valor especificado, o tampão e um tubo para coletar o filtrado que passa. Neste caso, o filtro retém seu DNA sob centrifugação a 3.500 × g durante 10 minutos. Verifique se há menos de um mililitro de líquido retido no filtro Amicon.Se mais retenção permanecer, reencha o filtro com TE e gire novamente. Remova o fluxo passante ou filtrado para outro tubo tipo falcon e guarde-o na geladeira até que você tenha confirmado seu produto final em um gel; adicione dois mililitros de tampão TE ao filtro Amazon e gire a 3.500 × g durante seis minutos. Remova o filtrado como anteriormente.Lave o DNA mais duas vezes com TE, totalizando três lavagens, guardando o filtrado a cada vez até a última centrifugação, quando restarem entre 200 e 500 microlitros de Tate no filtro Amon. Anote o volume final e transfira para um tubo einor de 1,5 mililitro identificado. Prepare uma alíquota de 70 microlitros do DNA concentrado e lavado para uso como estoque de trabalho.Armazene o estoque de trabalho a menos 20 graus Celsius. Congele o restante do DNA a menos 80 graus Celsius. Verifique a concentração e qualidade do seu produto final realizando eletroforese dos seus amostras em um gel ao lado do DNA.Escadas que servem como padrões de tamanho e intensidade preparam um gel de AROS 0,8% mais brometo de atherium para correr durante a noite. Nos primeiros poços, carregue escadas com bandas de diversos pesos moleculares e concentrações; recomendamos o seguinte padrão de carregamento. Nos dois primeiros poços, carregue 10 microlitros da escada de um quilobase mais; nos próximos três poços, carregue respectivamente 2 microlitros, 5 microlitros e 10 microlitros da escada Lambda H três a 50 nanogramas por microlitro.Por fim, carregue cinco microlitros por poço da amostra de extrato de DNA. Execute o gel a 15 volts por aproximadamente 16 horas. Fotografe o gel utilizando o sistema de documentação de gel de UV para determinar a faixa de peso molecular do seu DNA e sua concentração.Compare as bandas da amostra com as bandas da escada. O DNA de boa qualidade terá alto peso molecular e mostrará pouca evidência de cisalhamento ou degradação. Se a qualidade do DNA for boa e a quantidade for suficiente, prossiga com a purificação do DNA realizando um gradiente de cloreto de césio.Primeira etiqueta de centrifugação, coloque um tubo de centrífuga para cada amostra; em cada tubo, adicione 160 miligramas de cloreto de césio e 178 microlitros de DNA genômico. Cubra o tubo com um pequeno pedaço de parafilme e inverta suavemente o tubo de 10 a 20 vezes para misturar os componentes. Não misture por pipetagem, pois isso pode causar cisalhamento do DNA.Em seguida, adicione 10 microlitros de brometo de AUM ao tubo e misture novamente. Certifique-se de que os tubos estejam bem balanceados antes da centrifugação e de que as diferenças de peso entre os tubos sejam inferiores a um miligrama. Coloque os tubos no rotor da ultracentrífuga utilizando pinça de ponta fina.Em seguida, feche a tampa do rotor e coloque o rotor dentro da ultracentrífuga. O vácuo da porta da ultracentrífuga será aplicado assim que você fechar a porta. Execute durante a noite por um total de 18 horas a 100.000 RPM a 20 graus Celsius.Quando a centrifugação estiver concluída, retire os tubos do rotor usando pinça e tesoura e coloque-os no suporte. Leve os tubos até o transiluminador de luz azul, coloque os óculos com filtro âmbar. Em seguida, ligue a luz azul e observe sua banda de DNA usando uma seringa estéril de um cc com agulha.Remova a faixa de DNA e, em seguida, coloque-a em um tubo microfuga de 1,5 mililitro para ajudar a recuperar a maior parte do DNA aprisionado no espaço morto da seringa. Enxágue a seringa com 100 microlitros de TE e adicione a solução de enxágue ao tubo. Prepare um tubo com 100 microlitros de tampão TE por amostra para evitar contaminação cruzada.Para remover o brometo de AUM do DNA, adicione um volume igual de butanol saturado com água ao tubo. Inverta suavemente os tubos de 10 a 20 vezes, centrifugue a 10.000 RPM por um minuto e descarte a camada superior. Repita a lavagem cerca de três a quatro vezes adicionais até que a cor do butanol fique transparente.Coloque quatro mililitros de TE em um tubo de ultracentrífuga e adicione a solução de DNA da centrífuga acima a 3.500 vezes G à temperatura ambiente até que o volume de DNA seja reduzido a aproximadamente 100 a 500 microlitros e descarte o fluxo passante. Adicione dois mililitros de TE ao filtro Amazon e centrifugue a 3.500 vezes G durante seis minutos. Repita duas vezes, para um total de três lavagens, concentrando o TE a um volume final de 50 a 100 microlitros por centrífuga adicional, conforme necessário.E transfira a solução de DNA do filtro para um novo tubo einor de 1,5 mililitro. Adicione 40 microlitros de te ao filtro e pipete para cima e para baixo ao longo das duas membranas do filtro para lavar qualquer DNA remanescente. Adicione esta solução ao tubo com DNA concentrado.Coloque uma unidade de filtro MicroCon YM 30 em um tubo MicroCon e pré-lave o MicroCon adicionando 200 microlitros de água autoclavada e centrifugando a 10.000 RPM por sete minutos. Adicione a solução de DNA ao MicroCon pré-lavado para concentrar ainda mais o DNA, centrifugando a 5.000–10.000 × g por um a três minutos. Verifique a quantidade de líquido no filtro e repita a centrifugação até que o volume de líquido no filtro seja reduzido a aproximadamente 50 microlitros.Coloque a unidade de filtro de cabeça para baixo em um novo tubo MicroCon e centrifugue a 1000 vezes G durante três minutos. A quantidade ideal da solução concentrada é de 50 a 60 microlitros. Transfira sua amostra de DNA para um novo tubo einor de 1,5 mililitro.Meça a concentração de DNA em um NanoDrop e verifique a qualidade do pico. Um gráfico de absorbâncias para DNA puro deve apresentar um pico nítido em 260 nanômetros. Congele o restante do DNA a menos 80 graus Celsius.Quando este protocolo for realizado corretamente, você deverá observar uma imagem de gel semelhante à figura um; a concentração real de DNA dos extratos variará conforme a origem da amostra. Quando este protocolo for realizado corretamente, você deverá ver claramente uma faixa de DNA ao longo da parte central do tubo. Como na figura dois, acabamos de mostrar como extrair DNA genômico de filtros Sterex e purificá-lo utilizando um gradiente de densidade de cloreto de césio.Ao realizar este procedimento, é importante verificar antes de começar se você possui todos os reagentes e itens descartáveis necessários. Em segundo lugar, planeje pelo menos três dias inteiros para ter tempo suficiente para concluir o procedimento com cuidado. É isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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