Name: Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda técnicas de microinjeção para estudar a mitose em embriões sinciciais de Drosophila melanogaster. Este método permite visualizar divisões celulares com alta resolução em biologia do desenvolvimento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este protocolo é usado atualmente em nosso laboratório e tem sido aperfeiçoado ao longo dos anos por muitas pessoas, incluindo os Drs. David Sharp, Kwon Mijung, Sommi Patrizia, Cheerambathur dhanya. Agradecemos a Dr Bill Sullivan (UCSC), que nos forneceu excelentes conselhos sobre a manipulação e microinjeção de embriões Drosophila quando o nosso trabalho neste sistema estava sendo iniciada (ref. 13). Agradecemos a todos os membros do laboratório Scholey. Nosso trabalho sobre mitose em Drosophila é suportado pelo NIH conceder GM55507.

Receitas: Suco de uva placas: <ul><li> 5,5 g de ágar Bacto </li><li> 14,5 g de dextrose ou glicose </li><li> 7,15 g de sacarose </li><li> 45 ml suco concentrado de uva (100% suco). </li><li> 204,5 ml H 2 0 </li><li> 625 mL de NaOH 10N </li></ul> Misture todos os ingredientes e microondas até ferver. Adicionar 2,8 ml de ácido mix (mistura de ácido: 20,9 ml de ácido propiônico, ácido fosfórico 2,1 ml, 27 ml H 2 0) Misture e despeje em 35 milímetros pratos de Petri. Deixe solidificar à temperatura ambiente por um ou dois dias. Se as placas não vão ser usados ​​em breve, vedação com parafilme e manter a 4 ° C (deixar equilibrar à temperatura ambiente antes de usar). Colar de levedura: Dissolva cerca de uma colher de chá de fermento (Sigma YSC2, levedura de Saccharomyces cerevisiae tipo II) em água para formar uma pasta grossa. Coloque uma pequena quantidade deste em cada prato suco de uva pouco antes de usar. G-PEM buffer: <ul><li> 80 mM Na-PIPES, pH 6,9 </li><li> 1 mM MgCl 2 </li><li> 1 mM EGTA </li><li> 1 mM GTP </li></ul> Buffer de injecção: <ul><li> 150 mM K-Aspartato </li><li> 10 mM K-fosfato </li><li> Imidazol 20 mM, pH 7,2 </li></ul> Cola heptano: Desenrole fita dupla adesiva e coloque em uma garrafa de 100ml, adicionar cerca de 50ml heptano, selar a garrafa, e rock durante vários dias. Ao usar, adicione heptano se a cola é muito grosso. Câmara de desidratação: Dê uma placa de Petri 100 milímetros, coloque uma parte de um prato 35 milímetros para dentro para fazer uma &quot;mesa&quot; e adicione Drierite (sulfato de cálcio anidro) em torno dele para que a altura de Drierite não é maior do que a &quot;mesa&quot; e cobertura. A lamela com embriões serão colocados nesta &quot;tabela&quot; para a desidratação antes da injeção. É uma boa idéia para usar pelo menos alguns Drierite indicando e alterá-lo quando ele mudou de cor. Protocolo: Este protocolo pode ser utilizado para a injeção de praticamente qualquer reagente solúvel no embrião Drosophila sincicial: Por exemplo, seja uma proteína fluorescente para observação ou um inibidor da proteína-alvo, ou ambos. Ficando tudo pronto: 1 .- 2 a 3 dias antes do experimento, fazer placas de suco de uva e configurar leigos gaiola: Pegue uma garrafa de plástico (6 oz, fundo redondo de Drosophila Científica Aplicada), corte dois pequenos furos (cerca de 1cm 2) em lados opostos do garrafa e preencha com um pedaço de algodão (o que permitirá que o fluxo de ar), toque as moscas dentro da garrafa e cubra com uma placa de suco de uva. Mantenha a 25 ° C (ou à temperatura ambiente), as moscas devem estabelecer embriões para cerca de 10 dias. 2 .- Pelo menos um dia antes do experimento puxar agulhas para injeção, usamos uma agulha Kopf / Pipetar modelo extrator 720 e finos filamentos de vidro paredes (Precision Instruments tw100f Mundial). Para injeção de tubulina fluorescentes, manter agulhas a 4 ° C para evitar induzidas pela temperatura de polimerização na agulha. Preparação tubulina: Nota: Todos os trabalhos com tubulina deve ser feito a 4 ° C para evitar a polimerização. <ol><li> Tome tubulina rotulados fora do congelador e colocá-lo em gelo durante 5 a 15 minutos. </li><li> Diluir com G-PEM tampão (4 a 10 vezes, dependendo da intensidade necessária). </li><li> Centrifugar a 13k rpm a 4 ° C por 10-15 minutos. </li><li> De carga 1 - 2 l na agulha. </li></ol> Anticorpo ou inibidor químico: Prepare agulhas como para tubulina, usando uma concentração adequada (isto pode precisar de ser testado). O anticorpo pode ser em tampão de injeção, G-PEM buffer ou PBS. Se outro buffer é necessária, esse buffer terá de ser injetado como um controle para garantir que este tampão não causa nenhum dano por conta própria. Nota: tubulina Inibidor e fluorescentes podem ser misturados e injectados em conjunto, se as concentrações permitem. Caso contrário, injetar o tubulina fluorescentes e esperar 5 a 10 minutos antes de injetar o inibidor. Ao realizar uma injeção dupla, comece com mais embriões, uma vez que menos embriões irá recuperar normalmente. De colheita de embriões: <ol><li> Colocar uma placa de suco de uva novo na gaiola leigos. </li><li> Remover esta placa, após uma hora, esta é a primeira coleção do dia e muitas vezes não é muito bom. Ele pode ser descartado. </li><li> Mudar a placa a cada hora para manter embriões coleta de uma hora cada. </li></ol> Preparação lamela: <ol><li> Coloque uma lamela 50 x 22 milímetros em um lado de uma lâmina de microscópio. Tape os quatro cantos para o slide para que ele não se move. </li><li> Usando um aplicador derrubado algodão, coloque uma camada de cola heptano em uma única linha sobre a lamela (a cola não deve ser viscoso e deve secar em poucos segundos, caso contrário, adicionar mais heptano). </li><li> Coloque um pedaço dedupla fita adesiva sobre o slide para o lado da lamela. </li></ol> Preparação embrião: Nota: Os embriões devem ser visualizados cerca de 2 horas após o início da coleta, para começar os seguintes passos permitindo tempo suficiente para terminá-los dentro desse espaço de tempo. <ol><li> Com um pincel umedecido com cuidado pegar os embriões da placa de suco de uva e coloque em fita adesiva dupla no slide. </li><li> Usando a parte exterior das pinças, rolar os embriões sobre a fita adesiva dupla até o córion (membrana externa) se rompe. </li><li> Pegue o embrião de suavemente ondulado-lo sobre o córion assim que adere à pinça e colocá-lo na cola heptano na lamela com o lado longo do paralelo de embriões para o lado longo da lamela. Conjunto de 10 a 20 embriões em uma linha. </li><li> Retirar as lamelas e colocá-lo na câmara de desidratação de 3-8 minutos (isso depende da umidade da sala ea quantidade a ser injetada). </li><li> Coloque em uma câmara metálica com graxa de vácuo. </li><li> Cobrir os embriões com 700 halocarbono óleo para evitar uma maior desidratação. Embriões já estão prontos para injeção. </li></ol> Injeção de embrião: <ol><li> Pesquisar os embriões em um objetivo 16x. </li><li> Mover os embriões de distância, e encontrar a agulha sem mover o plano focal. </li><li> Centro de agulha e movê-lo sem movê-lo na direção x ou y. </li><li> Se a agulha não estiver aberto, colocar a ponta da lamela no campo de visão, mas não onde a agulha será, e inferior a agulha para o mesmo plano focal. Com muito cuidado mover a lamela até atingir a agulha e delicadamente quebra-la aberta. Se a agulha estiver aberto, vá para o passo 5. (As agulhas podem ser abertos com ácido fluorídrico antes de preencher). </li><li> Colocar os embriões em ver (mas não onde a agulha será), menor a agulha no óleo e certifique-se de obter gotas de líquido agradável da agulha. </li><li> Com cuidado mas firmemente mover o embrião para a agulha e injetar uma gota no embrião e mover o embrião de distância. (Ou siga as instruções do seu aparelho de injecção). </li><li> Depois de todos os embriões foram injetados, eles estão prontos para observação em um microscópio confocal. </li></ol> Imagem: Imagem os embriões em um microscópio confocal com um objetivo de 60 ou 100 vezes: Notas: <ol><li> O intervalo de tempo em uma série de lapso de tempo deve ser no máximo alguns segundos, uma vez que a mitose no embrião é muito rápido, dependendo do processo exato a ser estudado. </li><li> Uma série 3D ou um único plano pode ser adquirido, dependendo do processo de interesse. </li><li> Para os inibidores de ação rápida, a transferência do microscópio de injeção para microscópio de imagem tem que ser rápido. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1: Estudo da mitose no embrião Drosophila sincicial. Núcleos no embrião sofrer divisões rápida sem citocinese, durante os ciclos de 10 a 13 núcleos formam uma monocamada no córtex. A. Esquemática do embrião com núcleos no córtex. Embrião pode expressar GFP e / ou RFP proteínas e pode ser rotulada microinjeção com outras proteínas rotuladas e / ou inibidores. B. imagem lapso de tempo de embrião expressando GFP-tubulina e RFP-histonas. Plot C. do pólo-pólo de separação para ciclos de 11 , 12 e 13 em um embrião de tipo selvagem. Comprimento do eixo apresenta períodos de duração isométrica e períodos de alongamento, que são muito consistentes e reprodutíveis. Dynamics D. dos microtúbulos do fuso. Injeção de baixa concentração de tubulina rodamina leva a manchas formadas por subunidades de tubulina poucos, o que pode ser usado para estudar a dinâmica de microtúbulos.

<ol><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+anaphase+B%3A+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li>
<li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li>
<li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch%3A+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromokinesin%2C+KLP3A%2C+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+kinesin%2C+KLP61F%2C+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li>
<li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy%2C+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li>
</ol>

Este protocolo é relativamente simples, no entanto, cada etapa requer prática para se certificar de que os embriões não estão danificados. Experimentos de controle cuidadoso sempre precisa ser feito para garantir que os resultados estão sendo obtidos confiável. Uma boa maneira de começar isso é microinjecting tubulina buffer ou rodamina em embriões de controle expressando GFP-tubulina para se certificar de que a mitose prossegue normalmente através de todos os ciclos na superfície do embrião (ciclos de 10 a 13). Em embr...

técnicas de microinjeção para estudar na mitose drosophila melanogaster embrião sincicial

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Este protocolo descreve o uso do embrião Drosophila melanogaster sincicial para estudar a mitose 1. Drosophila tem uma genética útil com um genoma sequenciado, e pode ser facilmente mantido e manipulado. Mutantes mitose existem muitas, e as moscas transgênicas expressando funcional fluorescente (GFP, por exemplo) - proteínas mitótica tagged foram e estão sendo gerados. Expressão do gene alvo é possível utilizar o sistema GAL4/UAS 2. O embrião Drosophila cedo realiza múltiplas mitoses muito rapidamente (duração do ciclo celular, ≈ 10 min). É bem adequado para imagens de mitose, pois durante os ciclos de 10-13, os núcleos se dividem rapidamente e de forma síncrona sem intervir citocinese na superfície do embrião em uma monocamada única logo abaixo do córtex. Esses núcleos se dividem rapidamente, provavelmente, usar o aparelho mitótico mesmo que outras células, mas eles são otimizados para a velocidade, o ponto de verificação é acreditado geralmente para não ser rigoroso, permitindo o estudo de proteínas mitótica cuja ausência poderia causar parada do ciclo celular em células com um posto de controle forte . Embriões que expressam proteínas GFP rotulados quanto com microinjeção de proteínas fluorescentes rotulados podem ser facilmente visualizados para acompanhar a dinâmica ao vivo (Fig. 1). Além disso, os embriões podem ser microinjeção com função de bloqueio de anticorpos ou inibidores de proteínas específicas para estudar o efeito da perda ou perturbação da sua função 3. Estes reagentes podem se propagar por todo o embrião, atingindo muitos fusos para produzir um gradiente de concentração de inibidor, o que resulta em um gradiente de defeitos comparável a uma série alélica de mutantes. Idealmente, se a proteína-alvo é fluorescente etiquetado, o gradiente de inibição pode ser diretamente visualizada 4. Supõe-se que o mais forte fenótipo é comparável ao fenótipo nulo, embora seja difícil formalmente excluir a possibilidade de que os anticorpos podem ter efeitos dominante em casos raros, os controles de modo rigoroso e interpretação cautelosa deve ser aplicado. Mais longe do local da injeção, a função da proteína é apenas parcialmente perdido permitindo que outras funções da proteína-alvo para se tornar evidente.

Este protocolo descreve o uso de microinjeção e imagens de alta resolução na<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sincicial embrião para estudar a mitose.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

Este protocolo descreve o uso do embrião sincicial de Drosophila melanogaster para o estudo da mitose. A Drosophila possui uma genética útil, com um genoma sequenciado...

Este procedimento inicia-se com a coleta de embriões em placas de suco de uva fresco durante 30 a 60 minutos. Após remover a placa da gaiola do lago, pegue os embriões com um pincel umedecido e coloque-os em fita adesiva dupla. Rode suavemente um embrião sobre a fita usando uma das extremidades de uma pinça até que o córion se rompa.Pegue o embrião e coloque-o suavemente sobre a lamínula. Aplique uma camada de cola het. Repita isso até que você tenha embriões suficientes.Após a desidratação, os embriões estão prontos para a injeção. Olá, sou Ingrid Bruce Musher do laboratório do Dr. Jonathan Sculley, do Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade da Califórnia em Davis. Hoje vamos mostrar um procedimento para microinjeção de embriões sinciciais de drosófila.Utilizamos este procedimento para estudar o papel dos microtúbulos e dos motores baseados na mitose na mitose. Por exemplo, injetamos microscópicamente anticorpos ou outros inibidores de proteínas mitóticas específicas. Ao analisar o efeito do inibidor sobre a mitose, somos capazes de determinar a função da proteína-alvo.Então vamos começar. Para iniciar os preparativos dois ou três dias antes do experimento, monte a gaiola de postura cortando dois pequenos orifícios de aproximadamente um centímetro quadrado em lados opostos de uma garrafa plástica. Preencha os orifícios com um pedaço de algodão, permitindo a circulação de ar.Bata levemente no frasco para fazer as moscas caírem dentro dele e, em seguida, cubra-o com uma placa de suco de uva. Com levedura, mantenha a gaiola com as moscas à temperatura ambiente; elas colocarão ovos por até 10 dias, pelo menos um dia antes do experimento. Prepare as agulhas para injeção e mantenha-as a quatro graus Celsius.No dia do experimento, prepare e carregue as agulhas. Primeiro, retire a tubulina rotulada do congelador e coloque-a no gelo por cinco a 15 minutos. Em seguida, dilua-a com tampão GPEM e, depois, centrifugue-a por 10 a 15 minutos a 13.000 RPM a quatro graus Celsius.Por fim, carregue um a dois microlitros na agulha e mantenha-a a quatro graus Celsius para evitar a polimerização induzida por temperatura na agulha. Antes de montar a lamínula, prepare cola de heptano enrolando fita adesiva dupla face e colocando-a em um frasco de 100 mililitros.Adicione cerca de 50 mililitros de heptano, feche o frasco e agite-o por vários dias. Antes de preparar os embriões, monte uma câmara de desidratação na qual os embriões serão colocados previamente à injeção. Para isso, coloque uma parte de uma placa de 35 milímetros dentro de uma placa de Petri de 100 milímetros para formar uma plataforma, adicione um desidratante, como sulfato de cálcio anidro, ao redor dela, de modo que a altura do desidratante não ultrapasse a da plataforma, e cubra.Para começar a preparar os embriões, colete-os primeiro da gaiola no lago trocando o prato de suco de uva com levedura a cada hora; os embriões devem ser observados cerca de duas horas após o início da coleta. Para preparar a lamínula, coloque-a em um dos lados de uma lâmina de microscópio e fixe as quatro pontas com fita adesiva para que não se mova. Usando um aplicador de algodão, coloque uma camada de cola de heptano em linha sobre a lamínula.A cola não deve ser viscosa e deve secar em alguns segundos. Se estiver muito espessa, adicione mais heptano. Por fim, coloque um pedaço de fita adesiva dupla face no lâmina ao lado da lamínula.Deslize com um pincel umedecido. Retire cuidadosamente os embriões da placa de suco de uva e coloque-os sobre a fita adesiva dupla face do lâmina. Em seguida, use uma das extremidades de uma pinça para rolar os embriões sobre a fita adesiva dupla face até que o córion se rompa.Pegue o embrião rolando-o suavemente sobre o Corian para que adere à pinça e coloque-o sobre a cola de heptano na lamínula. Posicione-o com o lado longo do embrião paralelo ao lado longo da lamínula. Coloque 10 a 20 embriões em uma única fileira.Remova a lamínula e coloque-a na câmara de desidratação por três a oito minutos. O tempo depende da umidade local e da quantidade a ser injetada. Em seguida, coloque a lamínula sobre uma câmara metálica com graxa de vácuo.Por fim, cubra os embriões com óleo de halo carbono para evitar desidratação adicional. Os embriões estão agora prontos para a injeção. Primeiro, localize os embriões sob uma objetiva de 16 x.Mova os embriões para longe e localize a agulha sem alterar o plano focal. Centralize a agulha e mova-a para cima sem deslocá-la nas direções X ou Y. Para abrir a agulha, coloque a borda da lamínula no campo de visão, mas não na posição onde a agulha estará.E abaixe a agulha até o mesmo plano focal. Mova cuidadosamente a lamínula até que ela toque a agulha e a quebre suavemente. Levante a agulha.Agora coloque os embriões em vista. Abaixe a agulha no óleo e certifique-se de obter gotas líquidas bem definidas a partir da agulha. Mova suavemente o embrião para dentro da agulha, injete uma gota no embrião e, em seguida, afaste o embrião.Após todos os embriões terem sido injetados, eles estão prontos para serem observados em um microscópio confocal com uma objetiva de 60 ou 100 x. Um embrião controle deve apresentar-se como o do filme apresentado. Este é um embrião expressando tubulina GFP e histona RFP, imagens obtidas com uma objetiva de 100 x em um microscópio confocal de disco giratório.O tempo total mostrado é de oito minutos. Os gráficos da distância de polo a polo são altamente reprodutíveis e constituem uma medida confiável de sucesso em embriões controle. Eles devem ser semelhantes aos mostrados aqui para os ciclos 11 a 13.Mostrado neste vídeo está outro embrião controle. Este expressa KLP61F-GFP e foi injetado com tubulina marcada com Alexa Fluor 568. Ele também foi visualizado com uma objetiva de 100x em um microscópio confocal de disco giratório, e o tempo total é de sete minutos.Este filme foi obtido imediatamente após a microinjeção, e o gradiente na concentração de tubulina r Domine é claramente visível no início do filme. Esses embriões podem ser utilizados para estudar a inibição da Klp 61 F após a microinjeção do anticorpo contra Klp 61 F. Podemos observar a perda da Klp 61 FGFP dos fusos.Acabamos de mostrar como microinjetar embriões de Drosophila em estágio de blastodermo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de realizar controles, primeiramente praticar a injeção de tampão ou rutina isoladamente, e certificar-se de que a mitose prossiga normalmente durante a fase celular. Uma vez que todas as suas injeções sejam confiáveis e não causem danos, você poderá injetar um inibidor e estudar o efeito dessa inibição específica.Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

microinjection-techniques-for-studying-mitosis-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hemócitos Drosophila dispersam sobre a totalidade do embrião em desenvolvimento. Este protocolo demonstra como montar e imagem essas migrações usando embriões com hemócitos fluorescente etiquetado.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

O cinetocoro é onde o SAC inicia seu sinal de monitoramento da segregação mitótica das cromátides irmãs. Um método é descrito para visualizar o recrutamento e de rotação de uma das proteínas cinetocoro e pela sua coordenação com o movimento cromossoma...

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

Devido ao seu grande tamanho e organização relativamente simples, as células enfermeiras de Drosophila são ideais para estudos de imagem de células vivas. Este vídeo descreve um método de microinjeção para entrega de compostos exógenos nas células, e o protocolo apresentado demonstra o procedimento com sondas de oligonucleotídeos fluorescentes chamadas beacons moleculares (MBs) usadas para visualizar transcritos de mRNA endógenos.

Microinjeção de células enfermeiras de Drosophila: um método de entrega intracelular

Este vídeo descreve como realizar microinjeções que fornecem reagentes em embriões vivos de Drosophila. Os pesquisadores podem usar esse método para introduzir compostos exógenos como ácidos nucléicos e proteínas durante os estágios iniciais do desenvolvimento embrionário. O protocolo apresentado demonstra como configurar e realizar o procedimento de injeção de qualquer reagente solúvel - aqui, uma proteína fluorescente para experimentos de imagem ao vivo.

Microinjeção de embriões vivos de Drosophila: entrega precoce de reagentes ao embrião em desenvolvimento

Nós apresentamos uma técnica para etiquetar neurônios no sistema nervoso central (SNC)...

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

O objetivo deste protocolo é injetar actina globular conjugada por Rhodamine em embriões Drosophila e montagem de haste de actina intranuclear de imagem após estresse térmico.

Imagens Intranuclear Actin Rods em Embriões de Drosophila estressados de calor vivo

Apresentado aqui é um protocolo para microinjetar e simultaneamente imaginar múltiplos embriões de Drosophila durante o desenvolvimento embrionário usando um imager de alto teor baseado em placas.

Preparação e microinjeção de embriões Drosophila para Microscopia de Células Vivas Realizadas usando um Analisador automatizado de alto teor

Este artigo toma como exemplo a transgênese mediada por integrase phiC31 em Drosophila e apresenta um protocolo otimizado para microinjeção de embriões, uma etapa crucial para a criação de moscas transgênicas.

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para realizar imagens ao vivo da divisão assimétrica de células-tronco germinativas (GSCs) no nicho ovariano de Drosophila. Usamos uma linhagem transgênica que expressa de forma ubíqua uma fusão de proteína fluorescente verde (GFP) da proteína do espectrossomo Par-1.

Imagem ao vivo estendida de nichos de células-tronco germinativas de Drosophila melanogaster fêmea

Esses protocolos descrevem como caracterizar a organização e a função de oclusão das junções do septo plissado no epitélio embrionário de Drosophila no controle e mutante.

Experimentos de imunocoloração e penetração de corantes para definir proteínas de junção septata plissada no núcleo em epitélios embrionários de Drosophila

Aprenda técnicas de microinjeção para estudar a mitose em embriões sinciciais de Drosophila melanogaster. Este método permite visualizar divisões celulares com alta resolução em biologia do desenvolvimento.

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

Explorar mais vídeos