Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

Este procedimento começa com a coleta de embriões em placas de suco de uva fresco 30 a 60 minutos. Depois de retirar a placa da gaiola do lago, pegue os embriões com uma escova umedecida e coloque-os em fita adesiva dupla. Role suavemente um embrião sobre a fita usando metade de uma pinça até que o córion se abra.

Pegue o embrião e coloque-o suavemente na tampa. Deslize sobre uma camada de cola het. Repita isso até ter embriões suficientes.

Após a desidratação, os embriões estão prontos para injeção. Olá, sou Ingrid Bruce Musher, do laboratório do Dr. Jonathan Sculley no Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade da Califórnia em Davis. Hoje mostraremos um procedimento para microinjetar embriões sinciciais de drosófilas.

Usamos este procedimento para estudar o papel dos micro ttes e motores mitrais na mitose. Por exemplo, microinjetamos anticorpos ou outros inibidores de proteínas mitóticas específicas. Ao analisar o efeito inibidor na mitose, somos capazes de determinar a função das proteínas-alvo.

Então vamos começar. Para iniciar os preparativos dois a três dias antes do experimento, monte a gaiola cortando dois pequenos orifícios de cerca de um centímetro quadrado em lados opostos de uma garrafa de plástico. Preencha os buracos com um pedaço de algodão, permitindo que o ar flua.

Bata as moscas na garrafa e cubra-a com um prato de suco de uva. Com levedura, mantenha a gaiola da perna em temperatura ambiente, as moscas põem ovos por até 10 dias, pelo menos um dia antes do experimento. Puxe as agulhas para injeção e mantenha-as a quatro graus Celsius.

No dia do experimento, prepare e carregue as agulhas. Primeiro, retire a tubulina rotulada do freezer e coloque-a no gelo por cinco a 15 minutos. Em seguida, dilua-o com tampão GPEM e centrifugue-o por 10 a 15 minutos a 13.000 RPM a quatro graus Celsius.

Por fim, coloque de um a dois microlitros na agulha e mantenha-a a quatro graus Celsius. Para evitar a polimerização induzida por temperatura na agulha. Antes de configurar a lamínula, faça cola de heptano enrolando fita adesiva dupla e colocando-a em uma garrafa de 100 mililitros.

Adicione cerca de 50 mililitros de heptano, feche a garrafa e balance-a por vários dias. Antes de preparar os embriões, faça uma câmara de desidratação na qual os embriões serão colocados antes da injeção. Para fazer isso, coloque uma parte de um prato de 35 milímetros dentro de um 100 milímetros

Para começar a preparar os embriões, primeiro, colete-os da gaiola do lago trocando o prato de suco de uva com fermento a cada hora, os embriões devem ser fotografados cerca de duas horas após o início da coleta. Para preparar a lamínula, coloque-a em um lado de um microscópio, deslize e prenda os quatro cantos para baixo para que ela não se mova. Usando um aplicador com ponta de algodão, coloque uma camada de cola de heptano em uma linha na lamínula.

A cola não deve ser viscosa e deve secar em alguns segundos. Se for muito grosso, adicione mais heptano. Por fim, coloque um pedaço de fita adesiva dupla no slide ao lado da capa.

Deslize com uma escova umedecida. Pegue cuidadosamente os embriões do prato de suco de uva e coloque-os na fita adesiva dupla na lâmina. Em seguida, use metade de uma pinça para rolar os embriões sobre a fita adesiva dupla até que o córion se abra.

Pegue o embrião rolando-o suavemente sobre o Corian para que grude na pinça e coloque-o sobre a cola de heptano na tampa. Deslize com o lado comprido do embrião paralelo ao lado comprido da lamínula. Coloque de 10 a 20 embriões em uma fileira.

Remova a lamínula e coloque-a na câmara de desidratação por três a oito minutos. O tempo depende da umidade local e da quantidade a ser injetada. Em seguida, coloque a lamínula em uma câmara de metal com graxa a vácuo.

Finalmente, cubra os embriões com óleo de halo carbono para evitar mais desidratação. Os embriões estão agora prontos para injeção. Primeiro, encontre os embriões sob uma objetiva de 16 x.

Afaste os embriões e encontre a agulha sem mover o plano focal. Centralize a agulha e mova-a para cima sem movê-la na direção X ou Y. Para abrir a agulha, coloque a borda da lamínula no campo de visão, mas não onde a agulha estará.

E abaixe a agulha para o mesmo plano focal. Mova com muito cuidado a lamínula até que ela atinja a agulha e a abra suavemente. Mova a agulha para cima.

Agora traga os embriões à vista. Abaixe a agulha no óleo e certifique-se de obter boas gotas líquidas da agulha. Mova constantemente o embrião para a agulha, injete uma gota no embrião e, em seguida, afaste o embrião.

Depois que todos os embriões foram injetados, eles estão prontos para observação em um microscópio confocal com objetiva de 60 ou 100 x. Um embrião de controle deve se parecer com o deste filme. Este é um embrião que expressa tubulina GFP e histona RFP fotografado com uma objetiva de 100 x em um microscópio confocal de disco giratório.

O tempo total mostrado é de oito minutos. Parcelas de distância pólo a pólo são muito reprodutíveis e são uma medida confiável de sucesso em embriões controle. Eles devem se parecer com os mostrados aqui para os ciclos 11 a 13.

Mostrado neste filme é outro embrião de controle. Este expressando KLP 61 FGFP e injetado com r Domine tubulina. Isso também foi fotografado com uma objetiva de 100 x em um disco giratório confocal, e o tempo total é de sete minutos.

Este filme foi adquirido imediatamente após a microinjeção, e o gradiente na concentração de r Domine tubulina é claramente visível no início do filme. Esses embriões podem ser usados para estudar a inibição do Klp 61 F após a microinjeção do anticorpo Klp 61 F. Podemos ver a perda de Klp 61 FGFP dos fusos.

Acabamos de mostrar como microinjetar embriões incisionais de drosófilas. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de realizar controles, primeiro praticar a injeção de tampão ou rutina sozinha e certificar-se de que a mitose prossiga normalmente através do celular. Uma vez que todas as suas injeções sejam confiáveis e não causem danos, você pode injetar um inibidor e estudar o efeito dessa inibição específica.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.