Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial
September 15th, 2009
Este protocolo descreve o uso de microinjeção e imagens de alta resolução na Drosophila melanogaster Sincicial embrião para estudar a mitose.
Este procedimento começa com a coleta de embriões em placas de suco de uva fresco 30 a 60 minutos. Depois de retirar a placa da gaiola do lago, pegue os embriões com uma escova umedecida e coloque-os em fita adesiva dupla. Role suavemente um embrião sobre a fita usando metade de uma pinça até que o córion se abra.
Pegue o embrião e coloque-o suavemente na tampa. Deslize sobre uma camada de cola het. Repita isso até ter embriões suficientes.
Após a desidratação, os embriões estão prontos para injeção. Olá, sou Ingrid Bruce Musher, do laboratório do Dr. Jonathan Sculley no Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade da Califórnia em Davis. Hoje mostraremos um procedimento para microinjetar embriões sinciciais de drosófilas.
Usamos este procedimento para estudar o papel dos micro ttes e motores mitrais na mitose. Por exemplo, microinjetamos anticorpos ou outros inibidores de proteínas mitóticas específicas. Ao analisar o efeito inibidor na mitose, somos capazes de determinar a função das proteínas-alvo.
Então vamos começar. Para iniciar os preparativos dois a três dias antes do experimento, monte a gaiola cortando dois pequenos orifícios de cerca de um centímetro quadrado em lados opostos de uma garrafa de plástico. Preencha os buracos com um pedaço de algodão, permitindo que o ar flua.
Bata as moscas na garrafa e cubra-a com um prato de suco de uva. Com levedura, mantenha a gaiola da perna em temperatura ambiente, as moscas põem ovos por até 10 dias, pelo menos um dia antes do experimento. Puxe as agulhas para injeção e mantenha-as a quatro graus Celsius.
No dia do experimento, prepare e carregue as agulhas. Primeiro, retire a tubulina rotulada do freezer e coloque-a no gelo por cinco a 15 minutos. Em seguida, dilua-o com tampão GPEM e centrifugue-o por 10 a 15 minutos a 13.000 RPM a quatro graus Celsius.
Por fim, coloque de um a dois microlitros na agulha e mantenha-a a quatro graus Celsius. Para evitar a polimerização induzida por temperatura na agulha. Antes de configurar a lamínula, faça cola de heptano enrolando fita adesiva dupla e colocando-a em uma garrafa de 100 mililitros.
Adicione cerca de 50 mililitros de heptano, feche a garrafa e balance-a por vários dias. Antes de preparar os embriões, faça uma câmara de desidratação na qual os embriões serão colocados antes da injeção. Para fazer isso, coloque uma parte de um prato de 35 milímetros dentro de um 100 milímetros
Para começar a preparar os embriões, primeiro, colete-os da gaiola do lago trocando o prato de suco de uva com fermento a cada hora, os embriões devem ser fotografados cerca de duas horas após o início da coleta. Para preparar a lamínula, coloque-a em um lado de um microscópio, deslize e prenda os quatro cantos para baixo para que ela não se mova. Usando um aplicador com ponta de algodão, coloque uma camada de cola de heptano em uma linha na lamínula.
A cola não deve ser viscosa e deve secar em alguns segundos. Se for muito grosso, adicione mais heptano. Por fim, coloque um pedaço de fita adesiva dupla no slide ao lado da capa.
Deslize com uma escova umedecida. Pegue cuidadosamente os embriões do prato de suco de uva e coloque-os na fita adesiva dupla na lâmina. Em seguida, use metade de uma pinça para rolar os embriões sobre a fita adesiva dupla até que o córion se abra.
Pegue o embrião rolando-o suavemente sobre o Corian para que grude na pinça e coloque-o sobre a cola de heptano na tampa. Deslize com o lado comprido do embrião paralelo ao lado comprido da lamínula. Coloque de 10 a 20 embriões em uma fileira.
Remova a lamínula e coloque-a na câmara de desidratação por três a oito minutos. O tempo depende da umidade local e da quantidade a ser injetada. Em seguida, coloque a lamínula em uma câmara de metal com graxa a vácuo.
Finalmente, cubra os embriões com óleo de halo carbono para evitar mais desidratação. Os embriões estão agora prontos para injeção. Primeiro, encontre os embriões sob uma objetiva de 16 x.
Afaste os embriões e encontre a agulha sem mover o plano focal. Centralize a agulha e mova-a para cima sem movê-la na direção X ou Y. Para abrir a agulha, coloque a borda da lamínula no campo de visão, mas não onde a agulha estará.
E abaixe a agulha para o mesmo plano focal. Mova com muito cuidado a lamínula até que ela atinja a agulha e a abra suavemente. Mova a agulha para cima.
Agora traga os embriões à vista. Abaixe a agulha no óleo e certifique-se de obter boas gotas líquidas da agulha. Mova constantemente o embrião para a agulha, injete uma gota no embrião e, em seguida, afaste o embrião.
Depois que todos os embriões foram injetados, eles estão prontos para observação em um microscópio confocal com objetiva de 60 ou 100 x. Um embrião de controle deve se parecer com o deste filme. Este é um embrião que expressa tubulina GFP e histona RFP fotografado com uma objetiva de 100 x em um microscópio confocal de disco giratório.
O tempo total mostrado é de oito minutos. Parcelas de distância pólo a pólo são muito reprodutíveis e são uma medida confiável de sucesso em embriões controle. Eles devem se parecer com os mostrados aqui para os ciclos 11 a 13.
Mostrado neste filme é outro embrião de controle. Este expressando KLP 61 FGFP e injetado com r Domine tubulina. Isso também foi fotografado com uma objetiva de 100 x em um disco giratório confocal, e o tempo total é de sete minutos.
Este filme foi adquirido imediatamente após a microinjeção, e o gradiente na concentração de r Domine tubulina é claramente visível no início do filme. Esses embriões podem ser usados para estudar a inibição do Klp 61 F após a microinjeção do anticorpo Klp 61 F. Podemos ver a perda de Klp 61 FGFP dos fusos.
Acabamos de mostrar como microinjetar embriões incisionais de drosófilas. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de realizar controles, primeiro praticar a injeção de tampão ou rutina sozinha e certificar-se de que a mitose prossiga normalmente através do celular. Uma vez que todas as suas injeções sejam confiáveis e não causem danos, você pode injetar um inibidor e estudar o efeito dessa inibição específica.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visão Geral
Este protocolo descreve o uso de microinjeção e imagem de alta resolução no embrião sincicial de Drosophila melanogaster para estudar a mitose. O procedimento envolve o manuseio cuidadoso dos embriões para garantir a obtenção bem-sucedida de imagens e análise.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Biologia Celular
Contexto
- Drosophila melanogaster é um organismo modelo amplamente utilizado na pesquisa biológica.
- Compreender a mitose é crucial para insights sobre divisão celular e desenvolvimento.
- Técnicas de imagem de alta resolução aprimoram a observação de processos celulares.
- A microinjeção permite a manipulação precisa de embriões para fins experimentais.
Objetivo do Estudo
- Investigar a dinâmica da mitose em embriões de Drosophila.
- Utilizar técnicas avançadas de imagem para observação celular detalhada.
- Estabelecer um protocolo confiável para futuros estudos em biologia do desenvolvimento.
Métodos Utilizados
- Coleta de embriões em placas de suco de uva.
- Microinjeção de embriões para manipulação experimental.
- Imagem de alta resolução para observar processos mitóticos.
- Manuseio cuidadoso dos embriões para evitar danos durante a preparação.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida de estágios mitóticos em embriões de Drosophila.
- Demonstrou a eficácia das técnicas de microinjeção.
- Forneceu insights sobre o tempo e regulação da divisão celular.
- Estabelecer uma estrutura para pesquisas futuras sobre o desenvolvimento embrionário.
Conclusões
- O protocolo é eficaz para estudar a mitose em embriões de Drosophila.
- A imagem de alta resolução é crucial para compreender a dinâmica celular.
- Este estudo contribui para o campo mais amplo da biologia do desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables functional interrogation of mitotic proteins in a rapid, synchronous in vivo system, supporting target validation through phenotypic readouts of protein inhibition. The syncytial Drosophila embryo provides a disease-relevant system for mechanistic de-risking of mitotic targets, allowing assessment of protein function prior to lead identification. Quantitative imaging of spindle dynamics offers predictive confidence in target essentiality and pathway involvement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation by visualizing loss-of-function phenotypes via protein-specific antibody microinjection.
- Operational Value: Supports biological de-risking through gradient-dependent phenotypic series resembling allelic mutants.
- Predictive Value: Facilitates target confidence assessment by correlating inhibition strength with mitotic defect severity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible mitotic readouts (pole-to-pole distance) for compound or inhibitor screening.
- Quantitative Output: Provides measurable, imaging-based endpoints enabling dose-response analysis of protein inhibition.
- Scalability: Allows parallel embryo preparation and imaging for medium-throughput functional validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Mitotic machinery conservation supports translational biomarker alignment with human cell division pathways.
- Preclinical Continuity: Enables mechanistic follow-up from genetic hits to functional validation in a living system.
- Risk-Adjusted Decisions: Helps prioritize targets based on phenotypic penetrance and specificity of inhibition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to validate mitotic targets before assay development and lead identification stages, leveraging in vivo functionality.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation via direct perturbation of mitotic proteins.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantifiable mitotic imaging readouts.
- Analytics: Delivers objective, imaging-based measurements (e.g., spindle length) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved mitotic mechanisms and protein function conservation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target validation across multiple mitotic regulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function through direct, reversible protein inhibition in vivo.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized embryo preparation and injection protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization using phenotypic severity gradients.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microinjection, and live confocal imaging.
- Dependent on microinjection apparatus, antifade oils, and high-resolution imaging systems.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging and injection consistency.
- Adaptation considerations include protein solubility, antibody functionality, and fluorescent tag compatibility.
- Practical limitations include embryo viability post-injection and potential diffusion barriers in larger embryos.
